金黄色葡萄球菌检验与计数ppt课件精美版

金黄色葡萄球菌检验与计数金黄色葡萄球菌检验与计数1金黄色葡萄球菌的生物学特性金黄色葡萄球菌的生物学特性形形态态与染色：与染色：金黄色葡萄球菌的典型形金黄色葡萄球菌的典型形态态呈球形，直径呈球形，直径0.40.41.2m1.2m，大小不一，平均直径，大小不一，平均直径约为约为0.8m0.8m。革革兰兰氏染色阳性，呈葡萄串状排列。无鞭氏染色阳性，呈葡萄串状排列。无鞭毛、无芽胞。在毛、无芽胞。在陈陈旧培养物中，衰老的菌旧培养物中，衰老的菌体常体常转为转为革革兰兰氏阴性。氏阴性。金黄色葡萄球菌的生物学特性形态与染色：2培养特性：培养特性：易培养，易培养，对营对营养要求不高，在普通培养基养要求不高，在普通培养基中生中生长长良好。良好。需氧或兼性需氧或兼性厌厌氧。氧。最适生最适生长长温度温度37C37C，最适生，最适生长长pH 7.4pH 7.4。耐。耐盐盐性性强强，在含，在含101015%15%的的氯氯化化钠钠培养基中仍培养基中仍能生能生长长，可用于，可用于筛选筛选菌种。菌种。在普通在普通营营养养琼琼脂平板上培养脂平板上培养18182424，可，可形成形成圆圆形、表面光滑、不透明的菌落。可形、表面光滑、不透明的菌落。可产产生金黄色色素，色素生金黄色色素，色素为为脂溶性，不溶于脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。中。培养特性：3在血平板上可形成明在血平板上可形成明显显透明的溶血透明的溶血环环。为为型溶血。型溶血。可可产产生卵磷脂，在卵黄高生卵磷脂，在卵黄高盐盐培养基上形成培养基上形成周周围围有白色沉淀有白色沉淀环环的菌落。的菌落。大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产产酸不酸不产产气。甲基气。甲基红试验红试验、VP VP试验试验多多为为阳阳性，不性，不产产生靛基生靛基质质。触。触酶酶阳性。阳性。在血平板上可形成明显透明的溶血环。为型溶血。4金黄色葡萄球菌的金黄色葡萄球菌的酶酶金黄色葡萄球菌可金黄色葡萄球菌可产产生血生血浆浆凝固凝固酶酶和耐和耐热热DNADNA酶酶。这这两种两种酶酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。血血浆浆凝固凝固酶酶：与金黄色葡萄球菌的致病力密切相：与金黄色葡萄球菌的致病力密切相关。一般关。一般认为认为，血，血浆浆凝固阳性的金黄色葡萄球菌凝固阳性的金黄色葡萄球菌菌株有致病力。否菌株有致病力。否则为则为无致病力的菌株。血无致病力的菌株。血浆浆凝凝固固酶酶对热稳对热稳定，能抵抗定，能抵抗6030min6030min甚至甚至10030min10030min后，仍能保存大部分活性。后，仍能保存大部分活性。耐耐热热DNADNA酶酶作作为为除血除血浆浆凝固凝固酶酶外外鉴鉴定金黄色葡萄定金黄色葡萄球菌致病力的指球菌致病力的指标标之一。之一。该该酶酶的最适的最适pHpH为为9.09.0。金黄色葡萄球菌的酶金黄色葡萄球菌可产生血浆凝固酶和耐热DNA5金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌肠肠毒素：是金黄色葡萄球菌一毒素：是金黄色葡萄球菌一种重要的致病物种重要的致病物质质。本菌引起的食物中毒是因。本菌引起的食物中毒是因为为食品食品污污染了金黄葡萄球菌后，由染了金黄葡萄球菌后，由细细菌菌产产生大生大量量肠肠毒素而毒素而导导致的。致的。近年近年报导报导表明，表明，50%50%以上的金黄色葡萄球菌菌株以上的金黄色葡萄球菌菌株在在实验实验室条件下可室条件下可产产生生肠肠毒素，并且毒素，并且1 1个菌株能个菌株能产产生两种或两种以上的生两种或两种以上的肠肠毒素。毒素。肠肠毒素是一种可溶性蛋白毒素是一种可溶性蛋白质质，由，由单单个无分枝的个无分枝的肽链组肽链组成。分子量成。分子量约为约为30003000左右。易溶于水，左右。易溶于水，难难溶于有机溶溶于有机溶剂剂。金黄色葡萄球菌的金黄色葡萄球菌的肠肠毒素毒素金黄色葡萄球菌肠毒素：是金黄色葡萄球菌一种重要的致病物质。本6耐耐热热，经经100100煮沸煮沸30min30min不被破坏，也不受胰蛋不被破坏，也不受胰蛋白白酶酶的影响。食物中的的影响。食物中的肠肠毒素耐毒素耐热热性更性更强强，一般，一般烹烹调调温度不能将其破坏。温度不能将其破坏。218248 218248 的油中需的油中需30min30min才能被破坏。可引起急性胃才能被破坏。可引起急性胃肠肠炎。炎。根据根据肠肠毒素的血清型，可分毒素的血清型，可分A A、B B、C C（C C1 1、C C2 2）、）、D D、E 5 E 5 个型。个型。A A型型肠肠毒素引起的食物中毒毒素引起的食物中毒较较多，多，约约占占50%50%左右。其他依次左右。其他依次为为D D、C C、B B和和E E型。也有型。也有A AD D、A AB B、A AC C、B BC C等。等。耐热，经100煮沸30min不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响7试验原理：致病性的金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变为纤维蛋白，附着于细菌表面，产生凝固。检样25g(mL)+225mL稀释，匀质，10倍系列稀释选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入纸片这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。25g(mL)检样+225mL稀释液，匀质接种前应注意保持平板的干燥(可在2050的培养箱中干燥)，通常情况下涂布后，将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板置361培养1h后，再反转平板，倒置于培养箱培养。计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。金黄色葡萄球菌肠毒素：是金黄色葡萄球菌一种重要的致病物质。金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑凸起、湿润，直径约23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225 mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000 r/min均质1min2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液近年报导表明，50%以上的金黄色葡萄球菌菌株在实验室条件下可产生肠毒素，并且1个菌株能产生两种或两种以上的肠毒素。甲基红试验、VP试验多为阳性，不产生靛基质。计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查MPN检索表。若T或者N为0，报告1d-1 cfu/mL(g)。金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶：一种是与细胞壁结合的凝固酶，为结合凝固酶；PetrifilmTM测试片法适用于肉及其制品，奶制品等。A A型型肠肠毒素毒力毒素毒力较较强强，摄摄入入1g1g即可引起中即可引起中毒；毒；B B型毒力型毒力较较弱弱摄摄入入25g25g，才引起中毒。，才引起中毒。一般一般认为认为引起人中毒的最小引起人中毒的最小剂剂量是量是1.07.2g/kg1.07.2g/kg。试验原理：致病性的金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶，使血浆中纤8金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌检验检验金黄色葡萄球菌检验9金黄色葡萄球菌的金黄色葡萄球菌的检测检测程序程序检样检样检样检样25g(mL)25g(mL)25g(mL)25g(mL)225mL225mL225mL225mL生理生理生理生理盐盐盐盐水或磷酸水或磷酸水或磷酸水或磷酸盐缓盐缓盐缓盐缓冲液冲液冲液冲液7.5%7.5%7.5%7.5%氯氯氯氯化化化化钠钠钠钠肉肉肉肉汤汤汤汤或或或或10%10%10%10%氯氯氯氯化化化化钠钠钠钠胰酪胰酪胰酪胰酪胨胨胨胨大豆肉大豆肉大豆肉大豆肉汤汤汤汤361361361361Baird-ParkerBaird-ParkerBaird-ParkerBaird-Parker平板，血平板平板，血平板平板，血平板平板，血平板涂片染色涂片染色涂片染色涂片染色观观观观察溶血察溶血察溶血察溶血血血血血浆浆浆浆凝固凝固凝固凝固酶酶酶酶试验试验试验试验报报报报告告告告血平板血平板血平板血平板1824h1824h1824h1824h，Baird-Parker Baird-Parker Baird-Parker Baird-Parker平板平板平板平板1824h1824h1824h1824h或或或或4548h4548h4548h4548h。BHIBHIBHIBHI肉肉肉肉汤汤汤汤和和和和营营营营养养养养琼琼琼琼脂小斜面脂小斜面脂小斜面脂小斜面3613613613611824h1824h1824h1824h金黄色葡萄球菌的检测程序检样25g(mL)225mL生理10检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入纸片检样25g(mL)+225mL稀释，匀质，10倍系列稀释Baird-Parker平板，血平板结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mL BHI，361培养18h48h，重复实验。固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225 mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000 r/min均质1min2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。T=T1+T2=110+17=127检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液不要用力振摇试管，以免凝块振碎。金黄色葡萄球菌PetrifilmTM测试片，含具有显色功能、经改良的Baird-Parker培养基，对金黄色葡萄球菌的生长有很强的选择。计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。A型肠毒素引起的食物中毒较多，约占50%左右。-方便MPN表的查找。根据对样品污染状况的估计，选择23个适宜稀释度的的样品匀液(液体样品可包括原液)，每个稀释度分别吸取1ml接种到胰酪大豆肉汤管，每稀释度接种3管。B:某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；T：两个稀释度平板上确认的金黄色葡萄球菌菌落总数之和；一般认为，血浆凝固阳性的金黄色葡萄球菌菌株有致病力。用于观察金黄色葡萄球菌的溶血现象。选择三个连续的适宜浓度的样品匀液，接种Baird-Parker平板5%氯化钠肉汤：为葡萄球菌选择性增菌培养基，因金黄色葡萄球有耐受高盐的特性，因而能在此增菌液中生长，除某些嗜高盐的海洋菌外，大多数细菌都被增菌液中的高盐所抑制。增菌培养基增菌培养基7.5%7.5%氯氯化化钠钠肉肉汤汤：为为葡萄球菌葡萄球菌选择选择性增菌性增菌培养基，因金黄色葡萄球有耐受高培养基，因金黄色葡萄球有耐受高盐盐的特的特性，因而能在此增菌液中生性，因而能在此增菌液中生长长，除某些嗜，除某些嗜高高盐盐的海洋菌外，大多数的海洋菌外，大多数细细菌都被增菌液菌都被增菌液中的高中的高盐盐所抑制。所抑制。胰酪胰酪胨胨大豆肉大豆肉汤汤：含：含氯氯化化钠钠达达10%10%，以胰酪，以胰酪胨胨替代牛肉浸粉，并加入少量磷酸替代牛肉浸粉，并加入少量磷酸氢氢二二钾钾和葡萄糖促和葡萄糖促进进葡萄球菌的生葡萄球菌的生长长。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液增菌培11样样品的稀品的稀释释固体和半固体固体和半固体样样品：称取品：称取25g25g样样品至盛有品至盛有225 225 mLmL磷酸磷酸盐缓盐缓冲稀冲稀释释液或生理液或生理盐盐水的无菌均水的无菌均质质杯内，杯内，8000r/min8000r/min10000 r/min10000 r/min均均质质1min1min2min2min，或放入盛有，或放入盛有225 mL225 mL稀稀释释液的无菌均液的无菌均质质袋中，用拍袋中，用拍击击式均式均质质器拍打器拍打1min1min2min2min，制，制成成1:101:10的的样样品匀液。品匀液。液体液体样样品：以无菌吸管吸取品：以无菌吸管吸取25mL25mL样样品至盛有品至盛有225mL225mL磷酸磷酸盐缓盐缓冲稀冲稀释释液或生理液或生理盐盐水的无菌水的无菌锥锥形瓶形瓶(瓶内瓶内预预置适当数量的无菌玻璃珠置适当数量的无菌玻璃珠)中，中，充分混匀，制成充分混匀，制成1:101:10的的样样品匀液。品匀液。样品的稀释固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225 mL12增菌与分离培养增菌与分离培养增菌培养：吸取增菌培养：吸取5mL5mL上述上述样样品匀液，接种于品匀液，接种于50mL 7.5%50mL 7.5%氯氯化化钠钠肉肉汤汤或或10%10%胰酪胰酪胨胨大豆肉大豆肉汤汤培养基内，培养基内，361361培养培养18h18h24h24h。金黄色。金黄色葡萄球菌在葡萄球菌在7.5%7.5%氯氯化化钠钠肉肉汤汤中呈混中呈混浊浊生生长长，污污染染严严重重时时在在10%10%胰酪胰酪胨胨大豆肉大豆肉汤汤内呈混内呈混浊浊生生长长。将上述培养物，分将上述培养物，分别别划划线线接种到接种到Baird-Baird-ParkerParker平板和血平板，血平板平板和血平板，血平板361361培养培养18h18h24h24h。Baird-ParkerBaird-Parker平板平板361361培养培养18h18h24h24h或或45h45h48h48h。增菌与分离培养增菌培养：吸取5mL上述样品匀液，接种于50m13分离培养基分离培养基Baird-ParkerBaird-Parker琼琼脂：培养基中含有卵黄脂：培养基中含有卵黄亚亚碲酸碲酸钾钾，能抑制大多数，能抑制大多数细细菌的繁殖，并能菌的繁殖，并能促促进进金黄色葡萄球菌的生金黄色葡萄球菌的生长长使其使其产产生黑色生黑色和和晕晕圈。培养基中的丙圈。培养基中的丙酮酮酸酸钠钠和甘氨酸也和甘氨酸也能促能促进进金黄色葡萄球菌的生金黄色葡萄球菌的生长长。金黄色葡萄球菌的菌落形金黄色葡萄球菌的菌落形态态：圆圆形、光滑形、光滑凸起、湿凸起、湿润润，直径，直径约约23mm23mm，颜颜色呈灰色到色呈灰色到黑色，黑色，边缘为边缘为淡色，周淡色，周围为围为一混一混浊带浊带，在，在其外其外层层有一透明圈。用接种有一透明圈。用接种针针接触菌落似接触菌落似有奶油有奶油树树胶的硬度，偶而可胶的硬度，偶而可见见无混无混浊带浊带和和透明圈的非典型菌落。透明圈的非典型菌落。分离培养基Baird-Parker琼脂：培养基中含有卵黄亚碲14长长期保存的冷期保存的冷冻冻或干燥食品中所分离的菌落或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所比典型菌落所产产生的黑色生的黑色较较淡些，外淡些，外观观可能可能粗糙并干燥。粗糙并干燥。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色15金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌空白培养基空白培养基培养基培养基 用途用途 测试测试菌株菌株参考培养基参考培养基控制方法控制方法判定判定标标准准特性反特性反应应Baird-Baird-ParkerParker生生长长率率金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌ATCC6538ATCC6538；金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌ATCC25923ATCC25923 TSA TSA 定量定量PR0.PR0.5 5黑色黑色/灰色菌灰色菌落落带带透明透明带带选择选择性性大大肠肠埃希氏菌埃希氏菌ATCC25922ATCC25922或或87398739 -定性定性全部全部抑制抑制特异性特异性表皮葡萄球菌表皮葡萄球菌ATCC12228ATCC12228 -定性定性-黑色黑色/灰色菌灰色菌落无透明落无透明带带金黄色葡萄球菌空白培养基培养基 用途 测16分离培养基分离培养基血血琼琼脂：是一种基脂：是一种基础础培养基，含有培养基，含有5%5%的脱的脱纤维纤维血血(羊血或兔血羊血或兔血)。用于。用于观观察金黄色葡察金黄色葡萄球菌的溶血萄球菌的溶血现现象。金黄色葡萄球菌在血象。金黄色葡萄球菌在血琼琼脂平板上呈脂平板上呈溶血。溶血。金黄色葡萄球菌的菌落形金黄色葡萄球菌的菌落形态态：呈金黄色，：呈金黄色，有有时时也呈白色，大而突起，也呈白色，大而突起，圆圆形、不透明、形、不透明、表面光滑，周表面光滑，周围围有透明的有透明的溶血溶血环环。分离培养基血琼脂：是一种基础培养基，含有5%的脱纤维血(羊血17金黄色葡萄球菌的重要金黄色葡萄球菌的重要鉴鉴定定-血血浆浆凝固凝固酶酶试验试验 试验试验原理：致病性的金黄色葡萄球菌原理：致病性的金黄色葡萄球菌产产生生的血的血浆浆凝固凝固酶酶，使血，使血浆浆中中纤维纤维蛋白原蛋白原转变转变为纤维为纤维蛋白，附着于蛋白，附着于细细菌表面菌表面 ，产产生凝固。生凝固。金黄色葡萄球菌可金黄色葡萄球菌可产产生两种凝固生两种凝固酶酶：一种：一种是与是与细细胞壁胞壁结结合的凝固合的凝固酶酶，为结为结合凝固合凝固酶酶；另一种是菌另一种是菌细细胞胞释释放于培养基中，放于培养基中，为为游离游离凝固凝固酶酶。二者的抗原性不同。二者的抗原性不同。金黄色葡萄球菌的重要鉴定-血浆凝固酶试验 试验原理：致病性18血血浆浆凝固凝固酶酶试验试验 挑取挑取BairdBairdParkerParker平板或血平板上可疑菌落平板或血平板上可疑菌落1 1个或以上，分个或以上，分别别接种到接种到5mL BHI5mL BHI和和营营养养琼琼脂脂小斜面，小斜面，361361培养培养18 h18 h24 h24 h。取新取新鲜鲜配置兔血配置兔血浆浆0.5mL0.5mL，放入小，放入小试试管中，再管中，再加入可疑菌落的加入可疑菌落的BHIBHI培养物培养物0.2mL0.2mL0.3mL0.3mL，振，振荡摇荡摇匀，置匀，置361361温箱或水浴箱内，每半温箱或水浴箱内，每半小小时观时观察一次，察一次，观观察察6h6h，如呈，如呈现现凝固（即将凝固（即将试试管管倾倾斜或倒置斜或倒置时时，呈，呈现现凝凝块块）或凝固体）或凝固体积积大于原体大于原体积积的一半，判定的一半，判定为为阳性阳性结结果。果。血浆凝固酶试验 挑取BairdParker平板或血平板上可19同同时时以血以血浆浆凝固凝固酶酶试验试验阳性和阴阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉性葡萄球菌菌株的肉汤汤培养物作培养物作为对为对照。照。结结果如可疑，挑取果如可疑，挑取营营养养琼琼脂小斜脂小斜面的菌落到面的菌落到5mL BHI5mL BHI，361361培养培养18h18h48h48h，重复，重复实验实验。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对20结结果果报报告告如血如血浆浆凝固凝固酶酶试验试验阳性，可判定阳性，可判定为为金黄色葡金黄色葡萄球菌萄球菌 。报报告在告在25g25g（mLmL）样样品中品中检检出或未出或未检检出金黄色出金黄色葡萄球菌。葡萄球菌。结果报告如血浆凝固酶试验阳性，可判定为金黄色葡萄球菌。21计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。而其他细菌因不产生耐热DNA酶没有该反应。在陈旧培养物中，衰老的菌体常转为革兰氏阴性。耐热DNA酶作为除血浆凝固酶外鉴定金黄色葡萄球菌致病力的指标之一。Baird-Parker平板361培养18h24h或45h48h。金黄色葡萄球菌将所有紫红色菌落计数为金黄色葡萄球菌检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液单位：cfu/g或者cfu/mL；接种Baird-Parker平板其他依次为D、C、B和E型。易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。试验原理：致病性的金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变为纤维蛋白，附着于细菌表面，产生凝固。血浆：血浆凝固酶试验可选用人血浆或兔血浆。PetrifilmTM测试片法检验程序本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。根据对样品污染状况的估计，选择23个适宜稀释度的的样品匀液(液体样品可包括原液)，每个稀释度分别吸取1ml接种到胰酪大豆肉汤管，每稀释度接种3管。金黄色葡萄球菌可产生血浆凝固酶和耐热DNA酶。增菌培养：吸取5mL上述样品匀液，接种于50mL 7.影响血影响血浆浆凝固凝固酶酶试验试验的因素的因素血血浆浆：血：血浆浆凝固凝固酶酶试验试验可可选选用人血用人血浆浆或兔或兔血血浆浆。用人血。用人血浆浆出出现现凝固的凝固的时间时间短，短，约约93.6%93.6%的阳性菌在的阳性菌在1h1h内出内出现现凝固。用兔血凝固。用兔血浆浆1h1h内出内出现现凝固的阳性菌株凝固的阳性菌株仅仅达达86%86%，大部分，大部分菌株可在菌株可在6h6h内出内出现现凝固。凝固。若被若被检检菌菌为陈为陈旧的培养物（超旧的培养物（超过过1824h1824h），），或生或生长长不良，可能造成凝固不良，可能造成凝固酶酶活性低，出活性低，出现现假阴性。假阴性。计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌22不能使用甘露醇不能使用甘露醇氯氯化化钠琼钠琼脂上的菌落做血脂上的菌落做血浆浆凝固凝固酶酶的的实验实验，因所有高，因所有高盐盐培养基都可培养基都可以抑制以抑制A A蛋白的蛋白的产产生，造成假阴性生，造成假阴性结结果。果。不要用力振不要用力振摇试摇试管，以免凝管，以免凝块块振碎。振碎。实验实验必需必需设设阳性阳性(标标准金黄色葡萄球菌准金黄色葡萄球菌)、阴性阴性(白色葡萄球菌白色葡萄球菌)、空白、空白(肉肉汤汤)对对照。照。玻片法只能玻片法只能检测结检测结合凝固合凝固酶酶，而，而试试管法可管法可检测检测两种凝固两种凝固酶酶。因此，两种。因此，两种试验试验所得所得结结果可完全不同。果可完全不同。玻片法只用于玻片法只用于筛选筛选。不能使用甘露醇氯化钠琼脂上的菌落做血浆凝固酶的实验，因所有高23 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌计计数数 金黄色葡萄球菌计数24第一法第一法 Baird Parker Baird Parker 平板法平板法第二法第二法MPNMPN法法第三法第三法PetrifilmPetrifilmTMTM测试测试片法片法第一法 Baird Parker 平板法25第一法第一法:平板平板计计数法数法第一法:平板计数法26检验检验程序程序检样检样检样检样25g(mL)25g(mL)25g(mL)25g(mL)225mL225mL225mL225mL生理生理生理生理盐盐盐盐水或磷酸水或磷酸水或磷酸水或磷酸盐缓盐缓盐缓盐缓冲液冲液冲液冲液10101010倍稀倍稀倍稀倍稀释释释释选择选择选择选择三个三个三个三个连续连续连续连续的适宜的适宜的适宜的适宜浓浓浓浓度的度的度的度的样样样样品匀液，品匀液，品匀液，品匀液，接种接种接种接种Baird-ParkerBaird-ParkerBaird-ParkerBaird-Parker平板平板平板平板计计计计数及血数及血数及血数及血浆浆浆浆酶酶酶酶试验试验试验试验报报报报告告告告3613614548h4548h检验程序检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲27样样品的接种、培养与典型菌落的确品的接种、培养与典型菌落的确认认根据根据根据根据对样对样对样对样品品品品污污污污染状况的估染状况的估染状况的估染状况的估计计计计，选择选择选择选择23232323个适宜稀个适宜稀个适宜稀个适宜稀释释释释度度度度的的的的的的的的样样样样品匀液品匀液品匀液品匀液(液体液体液体液体样样样样品可包括原液品可包括原液品可包括原液品可包括原液)，每个稀，每个稀，每个稀，每个稀释释释释度度度度分分分分别别别别吸取吸取吸取吸取1ml1ml1ml1ml，以，以，以，以0.30.30.30.3，0.30.30.30.3，0.4ml0.4ml0.4ml0.4ml接种量，分接种量，分接种量，分接种量，分别别别别加加加加入三入三入三入三块块块块Baird-ParkerBaird-ParkerBaird-ParkerBaird-Parker平板，用平板，用平板，用平板，用L L L L棒涂布整个平板，棒涂布整个平板，棒涂布整个平板，棒涂布整个平板，(注意不要触及平板的注意不要触及平板的注意不要触及平板的注意不要触及平板的边缘边缘边缘边缘)。接种前接种前接种前接种前应应应应注意保持平板的干燥注意保持平板的干燥注意保持平板的干燥注意保持平板的干燥(可在可在可在可在2050205020502050的培养的培养的培养的培养箱中干燥箱中干燥箱中干燥箱中干燥)，通常情况下涂布后，将平板静置，通常情况下涂布后，将平板静置，通常情况下涂布后，将平板静置，通常情况下涂布后，将平板静置10min10min10min10min，如，如，如，如样样样样液不易吸收，可将平板置液不易吸收，可将平板置液不易吸收，可将平板置液不易吸收，可将平板置361361361361培养培养培养培养1h1h1h1h后，后，后，后，再反再反再反再反转转转转平板，倒置于培养箱培养。平板，倒置于培养箱培养。平板，倒置于培养箱培养。平板，倒置于培养箱培养。培养温度与培养温度与培养温度与培养温度与时间时间时间时间：361361361361，4548h4548h4548h4548h。典型菌落确典型菌落确典型菌落确典型菌落确认认认认：从典型菌落中任：从典型菌落中任：从典型菌落中任：从典型菌落中任选选选选五个菌落（小于五个菌落（小于五个菌落（小于五个菌落（小于五个全五个全五个全五个全选选选选），分），分），分），分别别别别接种到接种到接种到接种到5mLBHI5mLBHI5mLBHI5mLBHI和和和和营营营营养养养养琼琼琼琼脂小斜面，脂小斜面，脂小斜面，脂小斜面，361361361361培养培养培养培养1818181824h24h24h24h后后后后进进进进行血行血行血行血浆浆浆浆凝固凝固凝固凝固酶酶酶酶试验试验试验试验。样品的接种、培养与典型菌落的确认根据对样品污染状况的估计，选28典型菌落典型菌落计计数与数与计计算公式的算公式的应应用用n n计计数范数范围围要求：要求：选择选择合合计计菌落数在菌落数在2020020200的的平板，平板，计计数典型菌落。数典型菌落。典型菌落计数与计算公式的应用计数范围要求：选择合计菌落数在229公式一的使用范公式一的使用范围围：-最低稀最低稀释释度平板的菌落小于度平板的菌落小于20 cfu20 cfu，计计数数该该稀稀释释度平板上的典型菌落；度平板上的典型菌落；-某一稀某一稀释释度平板的菌落大于度平板的菌落大于200 cfu200 cfu且有典且有典型菌落，但上一稀型菌落，但上一稀释释度平板上没有典型菌落，度平板上没有典型菌落，计计数数该该稀稀释释度平板上的典型菌落；度平板上的典型菌落；-某一稀某一稀释释度平板的菌落大于度平板的菌落大于200 cfu200 cfu且有典且有典型菌落，且上一稀型菌落，且上一稀释释度平板上有典型菌落，度平板上有典型菌落，其平板上的菌落数不在其平板上的菌落数不在20 cfu20 cfu200 cfu200 cfu之之间间，计计数数该该稀稀释释度平板上的典型菌落；度平板上的典型菌落；公式一的使用范围：30公式一公式一T=AB/Cd T=AB/Cd T:T:样样品中金黄色葡萄球菌落数；品中金黄色葡萄球菌落数；A:A:某一稀某一稀释释度典型菌落的度典型菌落的总总数数 ；B:B:某一稀某一稀释释度血度血浆浆凝固凝固酶酶阳性的菌落数阳性的菌落数 ；C:C:某一稀某一稀释释度用于血度用于血浆浆凝固凝固酶酶试验试验的菌落数；的菌落数；d:d:某一稀某一稀释释度。度。公式一T=AB/Cd 31公式公式应应用例一用例一 公式一：公式一：T=AB/Cd T=AB/Cd T=65450.1=520 T=65450.1=520样样样样品稀品稀品稀品稀释释释释度度度度101010101 1 1 1101010102 2 2 2典型菌落数典型菌落数典型菌落数典型菌落数66666666，646464646 6 6 6，6 6 6 6用于做血用于做血用于做血用于做血浆浆浆浆凝固凝固凝固凝固酶酶酶酶菌落数菌落数菌落数菌落数5 5 5 55 5 5 5血血血血浆浆浆浆凝固凝固凝固凝固酶酶酶酶阳性菌落数阳性菌落数阳性菌落数阳性菌落数4 4 4 44 4 4 4高、低稀高、低稀释释度平板均有典型菌落，但其中高稀度平板均有典型菌落，但其中高稀释释度二平板的菌落数均不在度二平板的菌落数均不在2020020200之之间间，选择选择低稀低稀释释度的平板度的平板进进行行计计数。数。公式应用例一 公式一：T=AB/Cd 样品32N=T/1.1d N=T/1.1d TT：两个稀：两个稀释释度平板上确度平板上确认认的金黄色葡萄球菌的金黄色葡萄球菌菌落菌落总总数之和；数之和；d d：稀：稀释释因子因子(第一稀第一稀释释度度)。公式二的使用范公式二的使用范围围：平板菌落数均在：平板菌落数均在20 cfu20 cfu200 cfu200 cfu之之间间。公式引用于公式引用于ISO 6888-1:1999(E)ISO 6888-1:1999(E)公式二公式二N=T/1.1d 公式二33检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液361培养4548h。不要用力振摇试管，以免凝块振碎。分子量约为3000左右。361培养4548h。5mL，放入小试管中，再加入可疑菌落的BHI培养物0.4ml接种量，分别加入三块Baird-Parker平板，用L棒涂布整个平板，(注意不要触及平板的边缘)。黑色/灰色菌落带透明带若被检菌为陈旧的培养物（超过1824h），或生长不良，可能造成凝固酶活性低，出现假阴性。血浆凝固酶：与金黄色葡萄球菌的致病力密切相关。-最低稀释度平板的菌落小于20 cfu，计数该稀释度平板上的典型菌落；公式一：T=AB/Cd肠毒素是一种可溶性蛋白质，由单个无分枝的肽链组成。金黄色葡萄球菌将所有紫红色菌落计数为金黄色葡萄球菌用于观察金黄色葡萄球菌的溶血现象。金黄色葡萄球菌的检测程序-最低稀释度平板的菌落小于20 cfu，计数该稀释度平板上的典型菌落；在陈旧培养物中，衰老的菌体常转为革兰氏阴性。不要用力振摇试管，以免凝块振碎。计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。金黄色葡萄球菌PetrifilmTM测试片，含具有显色功能、经改良的Baird-Parker培养基，对金黄色葡萄球菌的生长有很强的选择。公式公式应应用例二用例二 公式二：公式二：N=T/1.1d N=T/1.1d T T1 1=18335=110 T=18335=110 T2 2=2145=17=2145=17 T=T1+T2=110+17=127 T=T1+T2=110+17=127 N=T/1.1d=1271.10.1=1200 N=T/1.1d=1271.10.1=1200 样样样样品稀品稀品稀品稀释释释释度度度度101010101 1 1 1101010102 2 2 2典型菌落数典型菌落数典型菌落数典型菌落数185185185185，18018018018020202020，22222222用于做血用于做血用于做血用于做血浆浆浆浆凝固凝固凝固凝固酶酶酶酶菌落数菌落数菌落数菌落数5 5 5 55 5 5 5血血血血浆浆浆浆凝固凝固凝固凝固酶酶酶酶阳性菌落数阳性菌落数阳性菌落数阳性菌落数3 3 3 34 4 4 4所有稀所有稀释释度平板合度平板合计计菌落数均在菌落数均在2020020200间间：检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液公式应34结结果果报报告告单单位：位：cfu/gcfu/g或者或者cfu/mLcfu/mL；若；若T T或或者者N N为为0 0，报报告告1d1100MPN/g1100MPN/g或或mlml的出的出现现。-方便方便MPNMPN表的表的查查找。找。注意要点MPN法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的40用接种环从有细菌生长的各管中，移取1环分别接种于Baird-Parker平板361培养4548h。金黄色葡萄球菌的菌落形态：呈金黄色，有时也呈白色，大而突起，圆形、不透明、表面光滑，周围有透明的溶血环。接种前应注意保持平板的干燥(可在2050的培养箱中干燥)，通常情况下涂布后，将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板置361培养1h后，再反转平板，倒置于培养箱培养。T1=18335=110 T2=2145=17这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。第三法PetrifilmTM测试片法4ml接种量，分别加入三块Baird-Parker平板，用L棒涂布整个平板，(注意不要触及平板的边缘)。25g(mL)检样+225mL稀释液，匀质T：两个稀释度平板上确认的金黄色葡萄球菌菌落总数之和；另一种是菌细胞释放于培养基中，为游离凝固酶。计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。C:某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数；甲基红试验、VP试验多为阳性，不产生靛基质。用人血浆出现凝固的时间短，约93.若被检菌为陈旧的培养物（超过1824h），或生长不良，可能造成凝固酶活性低，出现假阴性。易溶于水，难溶于有机溶剂。这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。T=T1+T2=110+17=127计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。选择三个连续的适宜浓度的样品匀液，接种Baird-Parker平板金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑凸起、湿润，直径约23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。第三法第三法PetrifilmPetrifilmTMTM测试测试片法片法用接种环从有细菌生长的各管中，移取1环分别接种于Baird-41适用范适用范围围PetrifilmPetrifilmTMTM测试测试片法适用于肉及其制品，奶片法适用于肉及其制品，奶制品等。制品等。适用范围PetrifilmTM测试片法适用于肉及其制品，奶制42PetrifilmPetrifilmTMTM测试测试片法片法检验检验程序程序检样检样检样检样25g(mL)+225mL25g(mL)+225mL25g(mL)+225mL25g(mL)+225mL稀稀稀稀释释释释，匀，匀，匀，匀质质质质，10101010倍系列稀倍系列稀倍系列稀倍系列稀释释释释选择适宜稀释度的样品匀液，各取选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL1mL分别加入纸片分别加入纸片361361361361242h242h242h242h判判判判读读读读没有菌落没有菌落没有菌落没有菌落只有典型紫只有典型紫只有典型紫只有典型紫红红红红色菌落色菌落色菌落色菌落将所有紫将所有紫将所有紫将所有紫红红红红色菌落色菌落色菌落色菌落计计计计数数数数为为为为金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌除典型紫除典型紫除典型紫除典型紫红红红红色菌落外其他色菌落外其他色菌落外其他色菌落外其他颜颜颜颜色的菌落色的菌落色的菌落色的菌落加入确加入确加入确加入确认认认认反反反反应应应应片，片，片，片，361361361361，培养，培养，培养，培养13h13h13h13h有粉有粉有粉有粉红红红红色菌色菌色菌色菌晕晕晕晕的菌落的菌落的菌落的菌落计计计计数数数数为为为为金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌报报报报告告告告PetrifilmTM测试片法检验程序检样25g(mL)+243第三法第三法 Petrifilm PetrifilmTMTM测试测试片法片法金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌PetrifilmPetrifilmTMTM测试测试片，含具片，含具有有显显色功能、色功能、经经改良的改良的Baird-ParkerBaird-Parker培养基，培养基，对对金黄色葡萄球菌的生金黄色葡萄球菌的生长长有有很很强强的的选择选择。金黄色葡萄。金黄色葡萄球菌在球菌在测试测试片上生成片上生成为为暗暗紫紫红红色的菌落，可以直接色的菌落，可以直接完成完成鉴鉴定和定和计计数。数。第三法 PetrifilmTM测试片法金黄色葡萄球菌Petr44金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌PetrifilmPetrifilmTMTM确确认认反反应应片片金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌PetrifilmPetrifilmTMTM确确认认反反应应片含有片含有显显色色剂剂和耐和耐热热去氧核糖核酸去氧核糖核酸(DNA)(DNA)，金黄色葡，金黄色葡萄球菌可生萄球菌可生产产耐耐热热DNADNA酶酶，此，此酶酶与反与反应应片上的片上的显显色色剂剂反反应应，形成粉，形成粉红红色色环环。而其他。而其他细细菌因菌因不不产产生耐生耐热热DNADNA酶酶没有没有该该反反应应。但在葡萄球菌。但在葡萄球菌属中，猪葡萄球菌、中属中，猪葡萄球菌、中间间葡萄球菌也会葡萄球菌也会产产生生阳性反阳性反应应。金黄色葡萄球菌PetrifilmTM确认反应片金黄色葡萄球菌45大肠埃希氏菌ATCC25922或8739样品的接种、培养与典型菌落的确认检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入纸片金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑凸起、湿润，直径约23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。培养温度与时间：361，4548h。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mL BHI，361培养18h48h，重复实验。5%氯化钠肉汤或10%胰酪胨大豆肉汤培养基内，361培养18h24h。361培养4548h。A型肠毒素引起的食物中毒较多，约占50%左右。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液耐热DNA酶作为除血浆凝固酶外鉴定金黄色葡萄球菌致病力的指标之一。-方便MPN表的查找。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液典型菌落确认：从典型菌落中任选五个菌落（小于五个全选），分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，361培养1824h后进行血浆凝固酶试验。其他依次为D、C、B和E型。Baird-Parker琼脂：培养基中含有卵黄亚碲酸钾，能抑制大多数细菌的繁殖，并能促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生黑色和晕圈。若被检菌为陈旧的培养物（超过1824h），或生长不良，可能造成凝固酶活性低，出现假阴性。培养基中的丙酮酸钠和甘氨酸也能促进金黄色葡萄球菌的生长。PetrifilmTM测试片法适用于肉及其制品，奶制品等。5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入纸片BHI肉汤和营养琼脂小斜面本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。血浆凝固酶：与金黄色葡萄球菌的致病力密切相关。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液金黄色葡萄球菌计数T：两个稀释度平板上确认的金黄色葡萄球菌菌落总数之和；公式一：T=AB/Cd若被检菌为陈旧的培养物（超过1824h），或生长不良，可能造成凝固酶活性低，出现假阴性。第三法PetrifilmTM测试片法所有稀释度平板合计菌落数均在20200间：用于做血浆凝固酶菌落数5mL，放入小试管中，再加入可疑菌落的BHI培养物0.Baird-Parker平板，血平板B:某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；其他依次为D、C、B和E型。25g(mL)检样+225mL稀释液，匀质第三法 PetrifilmTM测试片法单位：cfu/g或者cfu/mL；5%氯化钠肉汤或10%胰酪胨大豆肉汤培养基内，361培养18h24h。用于做血浆凝固酶菌落数同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。培养温度与时间：361，4548h。可产生金黄色色素，色素为脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225 mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000 r/min均质1min2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。A型肠毒素引起的食物中毒较多，约占50%左右。最适生长温度37C，最适生长pH 7.选择三个连续的适宜浓度的样品匀液，接种Baird-Parker平板T：两个稀释度平板上确认的金黄色葡萄球菌菌落总数之和；易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。公式一：T=AB/Cd接种前应注意保持平板的干燥(可在2050的培养箱中干燥)，通常情况下涂布后，将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板置361培养1h后，再反转平板，倒置于培养箱培养。血浆凝固酶：与金黄色葡萄球菌的致病力密切相关。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液Baird-Parker平板，血平板耐热，经100煮沸30min不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响。金黄色葡萄球菌PetrifilmTM测试片，含具有显色功能、经改良的Baird-Parker培养基，对金黄色葡萄球菌的生长有很强的选择。-方便MPN表的查找。2m，大小不一，平均直径约为0.金黄色葡萄球菌检验与计数耐热，经100煮沸30min不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响。本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。“样品的最高稀释度，能达到获得阴性终点”的理解：计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。公式二的使用范围：平板菌落数均在20 cfu200 cfu之间。6%的阳性菌在1h内出现凝固。公式引用于ISO 6888-1:1999(E)4ml接种量，分别加入三块Baird-Parker平板，用L棒涂布整个平板，(注意不要触及平板的边缘)。检样25g(mL)+225mL稀释，匀质，10倍系列稀释用于观察金黄色葡萄球菌的溶血现象。易溶于水，难溶于有机溶剂。T:样品中金黄色葡萄球菌落数；A型肠毒素引起的食物中毒较多，约占50%左右。MPN法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液在陈旧培养物中，衰老的菌体常转为革兰氏阴性。血浆：血浆凝固酶试验可选用人血浆或兔血浆。计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。T1=18335=110 T2=2145=175%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。典型菌落计数与计算公式的应用选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入纸片T:样品中金黄色葡萄球菌落数；金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上呈溶血。谢谢观看！大肠埃希氏菌ATCC25922或8739BHI肉汤和营养琼脂46