紫外--可见分光光度法课件

紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法(Ultraviolet and Visible Spectrophotometry,UV-Vis)1紫外-可见分光光度法1基本内容：基本内容：(1)紫外紫外可见光谱的产生及基本原理。可见光谱的产生及基本原理。(2)有机化合物的电子跃迁规律以及与分子结构的关系有机化合物的电子跃迁规律以及与分子结构的关系(3)各类有机化合物的紫外各类有机化合物的紫外可见光谱。可见光谱。(4)影响紫外影响紫外可见吸收光谱的因素。可见吸收光谱的因素。(5)紫外紫外可见分光度计。可见分光度计。(6)紫外紫外可见吸收光谱的应用。可见吸收光谱的应用。2基本内容：2一、分子光谱概述一、分子光谱概述电磁辐射电磁辐射速度速度;折射率为折射率为n的介质中的光速为的介质中的光速为V=n V。振荡频率：振荡频率：(Hz)。波长波长：电磁波相邻波峰间的距离为波长：电磁波相邻波峰间的距离为波长。波数波数：波长的倒数。每厘米内波的数目：波长的倒数。每厘米内波的数目(cm-1)光的粒子性是指光可以看成是由一系列量子化的能量子（即光子）组成。光的粒子性是指光可以看成是由一系列量子化的能量子（即光子）组成。光子能量为光子能量为E Eh hn n=hc/n=hc/n。h h 为为PlankPlank常数，常数，h=6.62610h=6.62610-34-34JsJs。光的本质是电磁辐射，光的基本特性是波粒二象性光的本质是电磁辐射，光的基本特性是波粒二象性(wave and corpuscle duality)(wave and corpuscle duality)。3一、分子光谱概述电磁辐射速度电磁辐射与光谱分析法电磁辐射与光谱分析法物质具有能量，是诱电体。物质与光的作用可看成是光子对能量的授受，即物质具有能量，是诱电体。物质与光的作用可看成是光子对能量的授受，即 h hn n=E=E1 1-E-E0 0,该原理广泛应用于光谱解析。电磁辐射与物质的作用本质是物质吸该原理广泛应用于光谱解析。电磁辐射与物质的作用本质是物质吸收光能后发生跃迁。跃迁是指物质吸收光能后自身能量的改变。因这种改变收光能后发生跃迁。跃迁是指物质吸收光能后自身能量的改变。因这种改变是量子化的，故称为跃迁。不同波长的光是量子化的，故称为跃迁。不同波长的光,能量不同，跃迁形式也不同，因能量不同，跃迁形式也不同，因此有不同的光谱分析法。此有不同的光谱分析法。光谱分析法光谱分析法波长区域波长区域波数区域波数区域,cm-1,cm-1跃迁类型跃迁类型g g 射线发射射线发射0.005-1.40.005-1.4 核核X X射线吸收，发射，衍射射线吸收，发射，衍射0.1-100 0.1-100 内层电子内层电子 真空紫外吸收真空紫外吸收10-180 nm10-180 nm1101106 6 to 510 to 5104 4价电子价电子紫外紫外-可见吸收，发射，荧光可见吸收，发射，荧光180-780 nm180-780 nm5105104 4 to 1.310 to 1.3104 4价电子价电子红外吸收，拉曼散射红外吸收，拉曼散射0.78-300 0.78-300 m mm m1.3101.3104 4 to 3.310 to 3.3101 1分子振动分子振动/转动转动微波吸收微波吸收0.75-3.75 0.75-3.75 m mm m13-2713-27分子转动分子转动电子自旋共振电子自旋共振3cm3cm0.330.33电子磁场中的自旋电子磁场中的自旋核磁共振核磁共振0.6-10 m0.6-10 m1.7101.710-2-2 to 110 to 110-3-3核磁场中的自旋核磁场中的自旋4电磁辐射与光谱分析法物质具有能量，是诱电体。物质与光的作用可分子紫外分子紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱分子的紫外分子的紫外可见吸收光谱法是基于分子内电子跃迁产生的吸收光谱进行分析的可见吸收光谱法是基于分子内电子跃迁产生的吸收光谱进行分析的一种光学分析方法。一种光学分析方法。紫外紫外-可见光谱区域可见光谱区域5分子紫外-可见吸收光谱分子的紫外可见吸收光谱法是基于分子内吸收与分子能级变化吸收与分子能级变化A：转动能级跃迁：转动能级跃迁(远红外区远红外区)B：转动：转动/振动能级跃迁振动能级跃迁(近红外区近红外区)C：转动：转动/振动振动/电子能级跃迁电子能级跃迁(紫外紫外-可见区可见区)吸光后，分子总能量变化：吸光后，分子总能量变化：E=Eel+Evib+ErotErot为为0.005-0.05evEvib为为0.05-1evEel为为1-20evEelEvibErot定定性性分分析析具具体体做做法法是是让让不不同同波波长长的的光光通通过过待待测测物物，经经待待测测物物吸吸收收后后，测测量量其其对对不不同同波波长长光光的的吸吸收收程程度度(吸吸光光度度A)A)，以以吸吸光光度度A A为为纵纵坐坐标标，辐辐射射波波长长为为横横坐坐标标作作图图，得得到到该该物物质质的的吸吸收收光光谱谱或或吸吸收收曲曲线线，据据吸吸收收曲曲线线的的特特性性(峰峰强强度度、位位置置及及数数目目等等)研研究究分分子结构。子结构。吸收谱带的位置吸收谱带的位置，即吸收频率或波长，是由产生谱带的跃迁能级间的能量差决定的，即吸收频率或波长，是由产生谱带的跃迁能级间的能量差决定的，反映了分子内能级的分布状况。反映了分子内能级的分布状况。吸收谱带的强度吸收谱带的强度，即在给定频率的摩尔吸收系数，是由分子两能级之间的跃迁几率决，即在给定频率的摩尔吸收系数，是由分子两能级之间的跃迁几率决定的。定的。紫外紫外可见光谱不具有红外光谱那样的精细结构，不可见光谱不具有红外光谱那样的精细结构，不如红外光谱广泛用于有机化合物鉴定如红外光谱广泛用于有机化合物鉴定分子结构与吸收光谱分子结构与吸收光谱6吸收与分子能级变化吸光后，分子总能量变化：Erot为0.0-胡罗卜素胡罗卜素咖啡因咖啡因阿斯匹林阿斯匹林丙酮丙酮几几种种有有机机化化合合物物的的分子吸收光谱图。分子吸收光谱图。7-胡罗卜素咖啡因阿斯匹林丙酮几种有机化合物的分子1.可能的跃迁类型可能的跃迁类型有机分子包括有机分子包括:成键轨道成键轨道、；反键轨道反键轨道*、*非键轨道非键轨道n二、紫外可见吸收光谱跃迁类型二、紫外可见吸收光谱跃迁类型有机分子能级跃迁有机分子能级跃迁81.可能的跃迁类型二、紫外可见吸收光谱跃迁类型有机分子能电子能级及跃迁示意图电子能级及跃迁示意图 *、p*、p*所需能量较大，位于远紫外区，没有实际意义。所需能量较大，位于远紫外区，没有实际意义。各轨道能级高低顺序：各轨道能级高低顺序：n*（分子轨道理论计算结果）（分子轨道理论计算结果）；可可能的跃迁类型：能的跃迁类型：-*；-*；-*；n-*；-*；n-*9电子能级及跃迁示意图*、p*、p*跃迁跃迁能量很大能量很大吸收光谱在真空紫外区吸收光谱在真空紫外区多为饱和烃多为饱和烃甲烷甲烷125nm乙烷乙烷135nm10*跃迁甲烷125nm10n*跃迁跃迁所需能量小于所需能量小于 *跃迁（跃迁（150-250nm）含有未共用电子对（含有未共用电子对（n电子）原子的饱和化合物都可发生电子）原子的饱和化合物都可发生含有含有S，N，O，Cl,Br，I电负性越小，电子越易被激发，激发波长越长。电负性越小，电子越易被激发，激发波长越长。跃迁的摩尔吸光系数比较小，一般在跃迁的摩尔吸光系数比较小，一般在100-3000L/molcm化合物化合物 max maxH2O1671480CH3OH184150CH3Cl173200(CH3)2O184252011n*跃迁化合物maxmax11 *和和n*跃迁跃迁 *和和n*跃迁能量低（跃迁能量低（200nm）含有不饱和键的有机分子易发生这类跃迁含有不饱和键的有机分子易发生这类跃迁C=CC=C;N=N;C=O有机化合物的紫外有机化合物的紫外-可见吸收光谱分析多以这两类可见吸收光谱分析多以这两类跃迁为基础跃迁为基础12*和n*跃迁C=CC例子：例子：1）乙醛分子在）乙醛分子在160,180,290nm处产生吸收，它们对应的电子跃迁类型分别是：处产生吸收，它们对应的电子跃迁类型分别是：2）环戊烯（）环戊烯（190nm）、甲醚（）、甲醚（185nm）、三乙胺（）、三乙胺（195nm）分别对应的跃迁类型是：）分别对应的跃迁类型是：3）一化合物可能是）一化合物可能是=N-CH2-CH2-CH3或或=N-CH=CH2其紫外吸收光谱为：其紫外吸收光谱为：该化合物是何种化合物？该化合物是何种化合物？170200250171nm/A13例子：200250-*和和n-*跃迁跃迁生色团（生色团（Chromogenesisgroup）：）：分子中含有非键或分子中含有非键或 键的电子体系，能吸收键的电子体系，能吸收特征特征外来辐射时并引起外来辐射时并引起n-*和和-*跃跃迁，可产生此类跃迁或吸收的结构单元，称为生色团。迁，可产生此类跃迁或吸收的结构单元，称为生色团。14-*和n-*跃迁生色团（Chromogenesisg助色团助色团（Auxochromousgroup）：含有孤对电子，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能含有孤对电子，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团，称之为助色团。常见助色团助色顺序为：团，称之为助色团。常见助色团助色顺序为：-F-CH3-Br-OH-OCH3-NH2-NHCH3-NH(CH3)2-NHC6H5200200K(EK(E2 2)共轭多烯、共轭多烯、-C=C-C=O-C=C-C=O-等的吸收等的吸收10,00010,000B B芳香环、芳香杂环化合物的芳香环、芳香杂环化合物的芳香环吸收。有的具有精细结构芳香环吸收。有的具有精细结构100100nn*R R含含COCO，NONO2 2等等n n电子基团的吸收电子基团的吸收10010)104 4l/molcml/molcm，因此含，因此含有这类结构的分子测定灵敏度高。有这类结构的分子测定灵敏度高。hv电子接受体电子接受体电子给予体电子给予体19电荷转移吸收谱带涉及的是给予体的一个电子向接受体的一个电子轨金属离子影响下的配体金属离子影响下的配体 *跃迁跃迁金属离子与有机物配合后使配体的共轭结构发生变化，导金属离子与有机物配合后使配体的共轭结构发生变化，导致吸收光谱蓝移或红移。致吸收光谱蓝移或红移。偶氮氯瞵偶氮氯瞵III偶氮氯瞵偶氮氯瞵IIIU（VI）配合物）配合物500600700/nmA20金属离子影响下的配体*跃迁金属离子与有机物配合过过渡渡元元素素的的d 轨轨道道为为简简并并轨轨道道(Degeneration orbit)，当当与与配配位位体体配配合合时时，轨轨道道简简并并解解除除，d 轨轨道道发发生生能能级级分分裂裂。如如果果轨轨道道未未充充满满，则则低低能能量量轨轨道道上上的的电电子子吸吸收收外外来来能能量量时时，将将会会跃跃迁到高能量的迁到高能量的d 轨道，从而产生吸收光谱。轨道，从而产生吸收光谱。d电子跃迁吸收谱带电子跃迁吸收谱带21过渡元素的d轨道为简并轨道(Degenerationo无配场无配场八面体场八面体场四面体场四面体场平面四面形场平面四面形场d d 轨轨道道电电子子云云分分布布及及在在配配场场下下的的分分裂示意图裂示意图谱带出现在可见区，吸收系数 max 较小(102)，很少用于定量分析；多用于研究配合物结构及其键合理论。为分裂能为分裂能其大小既依赖于金属离子价其大小既依赖于金属离子价态，也依赖于配位场的强弱态，也依赖于配位场的强弱配位体一定时，配位体一定时，E E的值增大的值增大顺序为：顺序为：M2+2+M3+3+M4+4+；3 3d44d5-N(CH3)2-NH2-OH-OCH3-NHCOCH3-OCOCH3-CH2CH2COOH-H吸电子基的作用强度顺序是：吸电子基的作用强度顺序是：-N+(CH3)3-NO2-SO3H-COH-COO-COOH-COOCH3-Cl-Br-I取代苯的取代苯的-*跃迁吸收特性跃迁吸收特性取代苯取代苯K-K-吸收带吸收带B-B-吸收带吸收带 maxmax(nm)(nm)maxmax maxmax(nm)(nm)maxmaxC C6 6H H5 5-H-H2042047,4007,400254254204204C C6 6H H5 5-CH-CH3 32072077,0007,000261261225225C C6 6H H5 5-OH-OH2112116,2006,2002702701,4501,450C C6 6H H5 5-NH-NH2 22302308,6008,6002802801,4301,430C C6 6H H5 5-NO-NO2 2268268C C6 6H H5 5-COCH-COCH3 3278.5278.5C C6 6H H5 5-N(CH-N(CH3 3)2 225125114,00014,0002982982,1002,100283）取代基：红移或蓝移。给电子基或吸电子基，极化现象显著增加4）溶剂效应：红移或蓝移或使吸收峰的振动精细结构消失）溶剂效应：红移或蓝移或使吸收峰的振动精细结构消失5）pH值：红移或蓝移值：红移或蓝移苯酚在酸性或中性水溶液中，有苯酚在酸性或中性水溶液中，有210.5nm及及270nm两个吸收带；而在碱两个吸收带；而在碱性溶液中，则分别红移到性溶液中，则分别红移到235nm和和287nm294）溶剂效应：红移或蓝移或使吸收峰的振动精细结构消失5）pH三、三、吸收光谱的测量吸收光谱的测量-Lambert-Beer定律定律几个术语几个术语 当当强强度度为为I0的的入入射射光光束束(Incident beam)通通过过装装有有均均匀匀待待测测物物的的介介质质时时，该该光光束束将将被被部部分分吸吸收收，未未被被吸吸收收的的光光将将透透过过(Emergent)待待测测物物溶溶液液以以及及通通过过散散射射(Scattering)、反反射射(Reflection),包包括括在在液液面面和和容容器器表表面面的的反射反射)而损失，这种损失有时可达而损失，这种损失有时可达10%，那么，那么，I0=Ie+Is+I r因此，因此，在样品测量时必须同时采用参比池和参比溶液扣除这些影响在样品测量时必须同时采用参比池和参比溶液扣除这些影响！术语、符号术语、符号定义定义其它方法其它方法辐射能辐射能P，P01S内内 照照 在在 1cm2面面 积积 上上 的的 能能 量量(erg)光强光强I0，I吸光度吸光度Alg(P/P0)或或lg(I0/I)光学密度；消光值光学密度；消光值E透过率透过率TI/I0透射比，透光度透射比，透光度光程光程l待测物液层厚度待测物液层厚度b,d吸光系数吸光系数aA/bc(c,g/L)吸收系数吸收系数吸光系数吸光系数A/bc(c,mol/L)摩尔吸光系数摩尔吸光系数30三、吸收光谱的测量-Lambert-Beer定律IoIbSdxLambert-Beer 定律定律（定量分析的基础）（定量分析的基础）31IoIbSdxLambert-Beer定律（定量分析的基础IxdIxdIxIx吸收光强吸收光强入射光强入射光强吸收率吸收率任一截面的吸收率任一截面的吸收率dx32IxdIxdIx吸收光强入射光强吸收率任一截面的吸收率dx3adnds=adn截面为截面为S的区域内的区域内俘获光的有效面积俘获光的有效面积从分子吸收的角度考虑从分子吸收的角度考虑33adnds=adn截面为S的区域内俘获光的有效面积从分子因此俘获光的几率应为：因此俘获光的几率应为：34因此俘获光的几率应为：34a1dn1dn2dn3a3a2ds=a1dn1+a2dn2+a3dn335a1dn1dn2dn3a3a2ds=a1dn1+a2dn-dIx/Ix=dS/S(1)(2)(3)由吸光由吸光度定义：度定义：对于单一组分：对于单一组分：若浓度以重量浓度表示：若浓度以重量浓度表示：36-dIx/Ix=dS/S(1偏离偏离L-B 定律的因素定律的因素样样品品吸吸光光度度A 与与光光程程b 总总是是成成正正比比。但但当当b 一一定定时时，A 与与c 并并不不总总是是成成正比，即偏离正比，即偏离L-B 定律！这种偏离由样品性质和仪器决定。定律！这种偏离由样品性质和仪器决定。1.样品性质影响样品性质影响a）待测物高浓度）待测物高浓度-吸收质点间隔变小吸收质点间隔变小质点间相互作用质点间相互作用对特定辐射对特定辐射的吸收能力发生变化的吸收能力发生变化-变化；变化；b）试液中各组份的相互作用，如缔合、离解、光化反应、异构化、配）试液中各组份的相互作用，如缔合、离解、光化反应、异构化、配体数目改变等，会引起待测组份吸收曲线的变化；体数目改变等，会引起待测组份吸收曲线的变化；c）溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响；）溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响；d）胶体、乳状液或悬浮液对光的散射损失。）胶体、乳状液或悬浮液对光的散射损失。37偏离L-B定律的因素1.样品性质影响37 x i AxAi2.仪器因素仪器因素仪器因素包括光源稳定性以及入射光的单色性等。仪器因素包括光源稳定性以及入射光的单色性等。a）入射光的非单色性：不同光对所产生的吸收不同，可导致测定偏差。）入射光的非单色性：不同光对所产生的吸收不同，可导致测定偏差。38xiAx2.仪器因素假假设设入入射射光光由由测测量量波波长长 x和和干干扰扰 i波波长长组组成成，据据Beer定定律律，溶液对在溶液对在 x和和 i的光的吸光度分别为：的光的吸光度分别为：当两种波长同时存在时，当两种波长同时存在时，当当 x=i时，或者说当时，或者说当 x=i时，有时，有A=xbc,符合符合L-B定律；定律；当当 xi时，或者说当时，或者说当 xi时，则吸光度与浓度是非线性的。二者差别越大，时，则吸光度与浓度是非线性的。二者差别越大，则偏离则偏离L-B越大；越大；当当 x i，测得的吸光度比在，测得的吸光度比在“单色光单色光”x处测得的低，产生负偏离；反之，当处测得的低，产生负偏离；反之，当 x i，则产生正偏离。，则产生正偏离。39假设入射光由测量波长x和干扰i波长组成，据Beer定律，AC011+240AC011+240特别是存在非吸收线特别是存在非吸收线(或吸收很小或吸收很小,杂散光杂散光)和和浓度较大时，浓度较大时，I变的变的很小，很小，Iib）谱谱带带宽宽度度与与狭狭缝缝宽宽度度：“单单色色光光”仅仅是是理理想想情情况况，经经分分光光元元件件色色散散所所得得的的“单单色色光光”实实际际上上是是有有一一定定波波长长范范围围的的光光谱谱带带(即即谱谱带带宽宽度度)。单单色色光光的的“纯纯度度”与与狭狭缝缝宽宽度度有有关，狭缝越窄，它所包含的波长范围越小，单色性越好。关，狭缝越窄，它所包含的波长范围越小，单色性越好。41特别是存在非吸收线(或吸收很小,杂散光)和浓度较大时，I变的紫外紫外-可见吸收光谱的灵敏度可见吸收光谱的灵敏度=0.4343Naiai=1x10-15cm2N=6.02x1023因为因为 为摩尔吸光系数为摩尔吸光系数ai的单位是的单位是cm2（cm3是是ml,变成变成L除除1000）所以所以=0.4343Nai=0.4343x6.02x1023x1x10-15/1000=10542紫外-可见吸收光谱的灵敏度=0.4343Nai因为若若1%吸收吸收A=0.0044b=1C=A0.0044 b100000=4.4x10-8(M)此即为方法的理论灵敏度此即为方法的理论灵敏度思考题思考题UV-VIS的理论灵敏度为的理论灵敏度为4.4x10-8M，这一极限，这一极限值能够从哪几个方面突破？请你提出有效的方法。值能够从哪几个方面突破？请你提出有效的方法。43若1%吸收A=0.0044A0.0044光源光源单色器单色器狭狭缝缝样品室样品室检测器检测器四、四、紫外紫外-可见光度计可见光度计44光源单色器狭样品室检测器四、紫外-可见光度计44紫外紫外-可见光度计仪器由光源、可见光度计仪器由光源、单色器、吸收池和检测器四部单色器、吸收池和检测器四部分组成。分组成。光源光源对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。随波长变化小。1.钨及碘钨灯：钨及碘钨灯：3402500 nm，多用在可见光区；，多用在可见光区；2.氢灯和氘灯：氢灯和氘灯：160375nm，多用在紫外区。，多用在紫外区。45紫外-可见光度计仪器由光源、单色器、吸收池和检测器四部分组成100400800 山山气灯气灯钨丝灯钨丝灯相对辐射功率46100400800D2 灯H2 灯200 250 300/nm相对辐射功率47D2灯H2灯200250单色器单色器(Mnochromator)在在UV-Vis光光度度计计中中，单单色色器器通通常常置置于于吸吸收收池池的的前前面面！（可可防防止止强强光光照照射射引引起吸收池中一些物质的分解）起吸收池中一些物质的分解）通常由入射狭缝、准直镜、色散元件、通常由入射狭缝、准直镜、色散元件、物镜和出射狭缝组成物镜和出射狭缝组成48单色器(Mnochromator)通常由入射狭缝、准直镜、色吸收池吸收池(Cell，Container)：用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。检测器：检测器：硒光电池、光电倍增管、二极管阵列检测器硒光电池、光电倍增管、二极管阵列检测器1cm5cm石英石英玻璃玻璃49吸收池(Cell，Container)：1cm5cm石英2.紫紫外外-可可见见光光度度计计工工作作原理原理分分光光光光度度计计分分为为单单波波长长和双波长仪器。和双波长仪器。1.单波长分光光度计单波长分光光度计(a)单光束单光束(b)双光束双光束(c)特点：特点：(d)双双光光束束方方法法因因光光束束几几乎乎同同时时通通过过样样品品池池和和参参比比池池，因因此此可可消消除除光源不稳产生的误差。光源不稳产生的误差。502.紫外-可见光度计工作原理50光源光源检测器检测器单色器单色器单色器单色器切光器切光器吸收池吸收池双波长分光光度计示意图双波长分光光度计示意图2.双波长分光度计双波长分光度计通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差 A。AB1和和 AB2分分别别为为在在 1和和 2处处的的背背景景吸吸收收，当当 1和和 2相相近近时时，背背景景吸吸收收近近似似相相等等。二二式式相相减，得减，得这表明，试样溶液浓度与两个波长处的吸光度差成正比。这表明，试样溶液浓度与两个波长处的吸光度差成正比。特点：特点：可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数光谱、不需参比液可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数光谱、不需参比液(消除了由于参比消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差池的不同和制备空白溶液等产生的误差)、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。51光源检测器单色器单色器切光器吸收池双波长分光光度计示意图2.用于悬浊液和悬浮液的测定，消除背景吸收。用于悬浊液和悬浮液的测定，消除背景吸收。用于吸收峰相互重叠的混合组分的同时测定。用于吸收峰相互重叠的混合组分的同时测定。设有混合组分设有混合组分X、Y：52用于悬浊液和悬浮液的测定，消除背景吸收。用于吸收峰相互重叠的3.分光光度计的校正分光光度计的校正当当光光度度计计使使用用一一段段时时间间后后其其波波长长和和吸吸光光度度将将出出现现漂漂移移，因因此此需需要要对对其进行校正。其进行校正。波长标度校正：波长标度校正：使使用用镨镨-钕钕玻玻璃璃（可可见见光光区区）和和钬钬玻玻璃璃（紫紫外外光光区区）进进行行校校正正。因因为为二者均有其各自的特征吸收峰。二者均有其各自的特征吸收峰。吸光度标度校正：吸光度标度校正：采采用用K2CrO4 标标准准液液校校正正（在在25oC时时，于于不不同同波波长长处处测测定定0.04000g/L的的KOH 溶液溶液（0.05mol/L）的吸光度的吸光度A，调整光度计使其，调整光度计使其A。533.分光光度计的校正53五、分光光度测定方法五、分光光度测定方法1.分光光度滴定分光光度滴定以一定的标准溶液滴定待测物溶液，测定以一定的标准溶液滴定待测物溶液，测定滴定中溶液的吸光度变化，通过作图法求滴定中溶液的吸光度变化，通过作图法求得滴定终点，从而计算待测组分含量的方得滴定终点，从而计算待测组分含量的方法称为分光光度滴定。法称为分光光度滴定。间接滴定法间接滴定法直接滴定法直接滴定法选择被滴定物、滴定剂或反应生成物之一选择被滴定物、滴定剂或反应生成物之一摩尔吸光系数最大的物质的摩尔吸光系数最大的物质的 maxmax为吸收波为吸收波长进行滴定。长进行滴定。间接滴定法需使用指示剂。间接滴定法需使用指示剂。光度滴定与通过指示剂颜色变化用肉眼确定滴定终点的普通滴定法相比，准光度滴定与通过指示剂颜色变化用肉眼确定滴定终点的普通滴定法相比，准确性、精密度及灵敏度都要高。光度滴定已用于酸碱滴定、氧化还原滴定、确性、精密度及灵敏度都要高。光度滴定已用于酸碱滴定、氧化还原滴定、沉淀滴定和络合滴定。沉淀滴定和络合滴定。54五、分光光度测定方法1.分光光度滴定间接滴定法直接滴定法选2.差式分光光度法差式分光光度法透光率透光率A A在在0.2-0.80.2-0.8范围内误差最小。超范围内误差最小。超出此范围，如高浓度或低浓度溶液，其出此范围，如高浓度或低浓度溶液，其吸光度测定误差较大。尤其是高浓度溶吸光度测定误差较大。尤其是高浓度溶液，更适合用差示法。液，更适合用差示法。一般分光光度测定选用试剂空白或溶液一般分光光度测定选用试剂空白或溶液空白作为参比，差示法则选用一已知浓空白作为参比，差示法则选用一已知浓度的溶液作参比。该法的实质是相当于度的溶液作参比。该法的实质是相当于透光率标度放大。透光率标度放大。552.差式分光光度法透光率A在0.2-0.8范围内误差最小。高吸收法高吸收法在测定高浓度溶液时使用。选用在测定高浓度溶液时使用。选用比待测溶液浓度稍低的已知浓度溶液作标准比待测溶液浓度稍低的已知浓度溶液作标准溶液，调节透光率为溶液，调节透光率为100%100%。低吸收法低吸收法在测定低浓度溶液时使用。选在测定低浓度溶液时使用。选用比待测液浓度稍高的已知浓度溶液作用比待测液浓度稍高的已知浓度溶液作标准溶液，调节透光率为标准溶液，调节透光率为0 0。最精密法最精密法是同时用浓度比待测液浓度稍高或是同时用浓度比待测液浓度稍高或稍低的两份已知溶液作标准溶液，分别调节稍低的两份已知溶液作标准溶液，分别调节透光率为透光率为0 0或或100%100%。56高吸收法在测定高浓度溶液时使用。选用比待测溶液浓度稍低的已知设试样浓度为设试样浓度为C Cx x，以溶剂作参比时，其吸光度为，以溶剂作参比时，其吸光度为A Ax0 x0。若选浓度为。若选浓度为C Cs s(其以溶其以溶剂为参比时吸光度为剂为参比时吸光度为A AS0S0)的已知溶液作参比，调节透光率为的已知溶液作参比，调节透光率为100%100%。根据。根据吸收定律，有：吸收定律，有：以溶剂作参比时：以溶剂作参比时：Ax0=Ax-A0;AS0=AS-A0差示法，以已知浓度为差示法，以已知浓度为Cs的溶液作参比时：的溶液作参比时：Ax=Ax0-AS0=b(Cx-Cs)=bC57设试样浓度为Cx，以溶剂作参比时，其吸光度为Ax0。若选浓度1 1）定义：将吸光度信号转化为对波长的导数信号的方法。导数光谱是解）定义：将吸光度信号转化为对波长的导数信号的方法。导数光谱是解决干扰物质与被测物光谱重叠，消除胶体等散射影响和背景吸收，提高决干扰物质与被测物光谱重叠，消除胶体等散射影响和背景吸收，提高 光谱分辨率的一种数据处理技术。光谱分辨率的一种数据处理技术。2 2）原理：）原理：已知已知 ，对波长求一阶导数，得对波长求一阶导数，得可见，一阶导数信号与浓度成正比。可见，一阶导数信号与浓度成正比。同样可得到二阶、三阶同样可得到二阶、三阶.n 阶导数信号亦与浓度成正比。阶导数信号亦与浓度成正比。3.3.导数光谱法导数光谱法581）定义：将吸光度信号转化为对波长的导数信号的方法。导数光谱随随导导数数阶阶数数的的增增加加，峰峰形形越越来来越越尖尖锐锐，因因而而导数光谱法分辨率高（右图）。导数光谱法分辨率高（右图）。吸收峰数为：导数阶数吸收峰数为：导数阶数+1，即，即n+110ppm苯的乙醇液苯的乙醇液1ppm苯的乙醇液苯的乙醇液0ppm纯乙醇纯乙醇1ppm苯的乙醇溶液，苯的乙醇溶液，一阶导数光谱一阶导数光谱基本光谱基本光谱1ppm苯的乙醇溶液，苯的乙醇溶液，四阶导数光谱四阶导数光谱选选择择性性及及灵灵敏敏度度均均提提高高（苯的导数信号）（苯的导数信号）59随导数阶数的增加，峰形越来越尖锐，因而导数光谱3）导数峰高测量方法）导数峰高测量方法测量方法有三，如下图：测量方法有三，如下图：正切法：相邻峰正切法：相邻峰(极大或极小极大或极小)切线中点至相邻峰切线切线中点至相邻峰切线(极小或极大极小或极大)的距离的距离d；峰谷法：两相邻峰值峰谷法：两相邻峰值(极大或极小极大或极小)间的距离间的距离p1或或p2；峰零法：极值峰至零线间的距离峰零法：极值峰至零线间的距离Z。603）导数峰高测量方法604.4.动力学分光光度法动力学分光光度法动力学分光光度法是以测定反应速度为基础的。氧化还原反应、络合催化交换动力学分光光度法是以测定反应速度为基础的。氧化还原反应、络合催化交换反应与酶催化反应。反应与酶催化反应。设有一个反应速度较慢的显色反应，为催化剂设有一个反应速度较慢的显色反应，为催化剂H催化而加速催化而加速:若若F F为在紫外为在紫外-可见区有吸收的化合物，则可见区有吸收的化合物，则F F的生成反应速度可表示为：的生成反应速度可表示为：上式积分，得上式积分，得由吸光度定义：由吸光度定义：614.动力学分光光度法动力学分光光度法是以测定反应速度为基固定时间法。固定时间法。t t为常数时，为常数时，A=kA=k1 1C CH H。选择一系列。选择一系列C CH H的的标准溶液，并测定固定时间标准溶液，并测定固定时间t t时的吸光度时的吸光度A A，绘制，绘制A-A-C CH H工作曲线，由待测样在工作曲线，由待测样在t t时的吸光度值求得时的吸光度值求得C CH H。测定测定C CH H的方法有：的方法有：固定浓度法。固定浓度法。测量显色产物测量显色产物F F达到一定吸光度值达到一定吸光度值时所需的时间。时所需的时间。C CF F为常数时，为常数时，C CH H=K/t=K/t。配制一系。配制一系列不同浓度列不同浓度C CH H的标准溶液，测定达到一定吸光度的标准溶液，测定达到一定吸光度A A时的时间时的时间t t，绘制，绘制C CH H-1/t-1/t工作曲线，由待测样经工作曲线，由待测样经反应达到反应达到A A时所需要的时间时所需要的时间t t求得求得C CH H。斜率法。斜率法。由吸光度由吸光度A A随反应时间的变化速率随反应时间的变化速率 A/A/t t来来测定测定C CH H。因为。因为 A/A/t=kCt=kCH H，配制标准溶液具有不同，配制标准溶液具有不同的的C CH H，分别测定，分别测定A-tA-t曲线，求得曲线斜率曲线，求得曲线斜率 A/A/t t，再，再绘制绘制 A/A/t-Ct-CH H工作曲线。对待测样亦同样测定工作曲线。对待测样亦同样测定A-tA-t曲线，求得曲线斜率曲线，求得曲线斜率 A/A/t t，从，从 A/A/t-Ct-CH H工作曲线工作曲线上求得上求得C CH H。斜率法实验数据多，准确度高。斜率法实验数据多，准确度高。动力学分光光度法的特点是灵敏度高动力学分光光度法的特点是灵敏度高(10(10-6-6-10-10-9-9g/mlg/ml，有的可达，有的可达1010-12-12g/ml)g/ml)。但由于影响因素多，不易严格控制，测定误差较大。但由于影响因素多，不易严格控制，测定误差较大。62固定时间法。t为常数时，A=k1CH。选择一系列CH的标准溶5.反射光谱法反射光谱法反射光谱法测定的是从样品表面反射回来的辐射能量大小。反射光谱法测定的是从样品表面反射回来的辐射能量大小。反射率定义为：反射率定义为：R%=I/I R%=I/I0 0100100。I I为被反射的辐射强度，为被反射的辐射强度，I I0 0为从某些标准表为从某些标准表面反射回来的辐射强度。面反射回来的辐射强度。635.反射光谱法反射光谱法测定的是从样品表面反射回来的辐射能六、紫外六、紫外-可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用1)定性分析定性分析判断异构体：判断异构体：紫外吸收光谱的重要应用在于测定共轭分子。共轭体系紫外吸收光谱的重要应用在于测定共轭分子。共轭体系越大，吸收强度越大，波长红移。越大，吸收强度越大，波长红移。前者有紫外吸收，后者的前者有紫外吸收，后者的 maxmax200nm200nm。酮式酮式 烯醇式烯醇式 maxmax=275 nm,=275 nm,=100 =100 maxmax=245 nm,=245 nm,=18,000=18,00064六、紫外-可见分光光度法的应用1)定性分析判断异构体：紫外判断共轭状态：判断共轭状态：可以判断共轭生色团的所有原子是否共平面等。可以判断共轭生色团的所有原子是否共平面等。如二苯乙烯（如二苯乙烯（ph-CH=CH-phph-CH=CH-ph）顺式比反式不易共平面，因此反式结构的最）顺式比反式不易共平面，因此反式结构的最大吸收波长及摩尔吸光系数要大于顺式。大吸收波长及摩尔吸光系数要大于顺式。顺式顺式:maxmax=280 nm,=280 nm,=13,500;=13,500;反式反式:maxmax=295 nm,=295 nm,=27,000=27,000 已知化合物的验证：已知化合物的验证：与标准谱图比对，紫外与标准谱图比对，紫外-可见吸收光谱可以作为有机化合可见吸收光谱可以作为有机化合物结构测定的一种辅助手段。物结构测定的一种辅助手段。65判断共轭状态：可以判断共轭生色团的所有原子是否共平面等。顺式2)定量分析定量分析a.a.单组份定量方法单组份定量方法标准曲线法标准曲线法标准加入法标准加入法样品组成比较复杂，难于制备组成匹配的标样品组成比较复杂，难于制备组成匹配的标样时用标准加入法。将待测试样分成若干等样时用标准加入法。将待测试样分成若干等份，分别加入不同已知量份，分别加入不同已知量0,C0,C1 1,C,C2 2,C,Cn n的的待测组分配制溶液。由加入待测试样浓度由待测组分配制溶液。由加入待测试样浓度由低至高依次测定上述溶液的吸收光谱，作一低至高依次测定上述溶液的吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，得到一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，得到一条直线。若直线通过原点，则样品中不含待条直线。若直线通过原点，则样品中不含待测组分；若不通过原点，将直线在纵轴上的测组分；若不通过原点，将直线在纵轴上的截距延长与横轴相交，交点离开原点的距离截距延长与横轴相交，交点离开原点的距离为样品中待测组分的浓度。为样品中待测组分的浓度。662)定量分析样品组成比较复杂，难于制备组成匹配的标样时用标b.b.多组分定量方法多组分定量方法由于吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个组份。由于吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个组份。设设试试样样中中有有两两组组份份X 和和Y，将将其其显显色色后后，分分别别绘绘制制吸吸收收曲曲线线，会会出出现现如如图图所所示示的的三种情况：三种情况：图图a)：X,Y 组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。图图b)和和c)：X,Y 相互干扰，此时可通过解联立方程组求得相互干扰，此时可通过解联立方程组求得X和和Y的浓度：的浓度：其其中中，X,Y 组组份份在在波波长长 1 和和 2 处处的的摩摩尔尔吸吸光光系系数数 可可由由已已知知浓浓度度的的X,Y 纯纯溶溶液液测得。解上述方程组可求得测得。解上述方程组可求得cx 及及cy。67b.多组分定量方法67c.分析条件选择分析条件选择可用于可用于测定的最短波定的最短波长(nm)(nm)常常见溶溶剂200200蒸馏水，乙腈，环己烷蒸馏水，乙腈，环己烷220220甲醇，乙醇，异丙醇，醚甲醇，乙醇，异丙醇，醚250250二氧六环，氯仿，醋酸二氧六环，氯仿，醋酸270270N,N-N,N-二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺(DMF)(DMF)，乙酸乙酯，四氯化碳，乙酸乙酯，四氯化碳290290苯，甲苯，二甲苯苯，甲苯，二甲苯335335丙酮，甲乙酮，吡啶，二硫化碳丙酮，甲乙酮，吡啶，二硫化碳 所选择的溶剂应易于溶解样品并不与样品作用，且在测定波长区间内所选择的溶剂应易于溶解样品并不与样品作用，且在测定波长区间内吸收小，不易挥发。吸收小，不易挥发。溶剂的选择溶剂的选择68c.分析条件选择可用于测定的最短波长(nm)常见溶剂200测定浓度的选择测定浓度的选择当分析高浓度的样品时，误差大。当分析高浓度的样品时，误差大。通常可通过调节溶液浓度或改变光程通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控来控制制A的读数在的读数在0.20.8范围内。范围内。由由L-B定律：定律：微分后得：微分后得：将上两式相比，并将将上两式相比，并将dT 和和dc 换为换为 T 和和 c，得，得当相对误差当相对误差 c/c最小时，求得最小时，求得T=?或或A=?。69测定浓度的选择通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控制A的3)弱酸离解常数的测定弱酸离解常数的测定设有一元弱酸设有一元弱酸HB，其离解反应如下：，其离解反应如下：若测出若测出B-和和HB，即可求出，即可求出Ka。测定时，配制三份不同测定时，配制三份不同pH值的溶液。一份为强碱性，一份为强酸性，分别值的溶液。一份为强碱性，一份为强酸性，分别在在B-和和HB的最大吸收波长处测定吸光度，求出各自的摩尔吸光系数。第三份为的最大吸收波长处测定吸光度，求出各自的摩尔吸光系数。第三份为已知已知pH值的缓冲溶液，分别在值的缓冲溶液，分别在B-和和HB的最大吸收波长处测得总吸光度，解联立的最大吸收波长处测得总吸光度，解联立方程求得方程求得B-和和HB，然后按前式求出，然后按前式求出pKa或或Ka。703)弱酸离解常数的测定设有一元弱酸HB，其离解反4)4)配合物组成和稳定常数测定配合物组成和稳定常数测定1）摩尔比法）摩尔比法(饱和法饱和法)具具体体做做法法：固固定定cM，增增加加cR，并并测测定定一一系系列列MRn的的吸吸光光度度A，以以cR/cM比比值值对对A作图，得如图所示曲线。其中，曲线拐点处对应的值为配合比作图，得如图所示曲线。其中，曲线拐点处对应的值为配合比n。设设MRn 的电离度为的电离度为，则，则714)配合物组成和稳定常数测定设MRn的电离度为，则712）等摩尔连续变化法）等摩尔连续变化法(Job法法)具具体体做做法法：保保持持cR+cM=c 恒恒定定，但但改改变变cM与与cR的的相相对对比比例例，若若以以cM/c对对吸吸光光度度A作作图图，当当达达最最大大吸吸光光度度时时cM/cR之之比比即即为为配配位位比比。由由两两曲曲线线外外推推的的交交点点所所对对应应的的cM/c亦亦可可得得出出配配位位比比。若若比比值值为为0.5，则则配配位位比比n为为1:1；若若比比值值为为0.33，则则配配位位比比n为为1:2或者或者n=(1-cM/c)/(cM/c)00.20.40.60.81.0AAAcM/c该法适于离解度小、配合比低的配合物组成测定。该法适于离解度小、配合比低的配合物组成测定。722）等摩尔连续变化法(Job法)00.20.40.60.813）斜率比法求配合比）斜率比法求配合比配制两个系列的溶液：配制两个系列的溶液：络合剂络合剂R的初使浓度保持过量并恒定的初使浓度保持过量并恒定改变加入金属离子的浓度形成改变加入金属离子的浓度形成MRn溶液溶液1金属离子金属离子M的初使浓度保持过量并恒定的初使浓度保持过量并恒定改变络合剂改变络合剂R的浓度形成的浓度形成MRn溶液溶液2M=M0-MRn=0A=bMRn=bM0R=R0-nMRn=0A=bMRn=bnR0K1=bK2=bnn=K2/K1M0R0733）斜率比法求配合比配制两个系列的溶液：络合剂R的初使浓度保5)5)半导体材料吸光性能及能带结构测定半导体材料吸光性能及能带结构测定/nmUV-vis DRS spectra of TiO2/SiO2 and ZnO-TiO2/SiO2 catalystsUV-vis DRS of SiO2,TiO2 and TiSiO 745)半导体材料吸光性能及能带结构测定/nmUV-viUV-vis DRS spectra of TiO2/SiO2 and ZnO-TiO2/SiO2catalystsa.TiO2/SiO2,b.5%ZnO-TiO2/SiO2,b.c.10%ZnO-TiO2/SiO2,d.20%ZnO-TiO2/SiO2F(R)ligand-metal charge transfer(LMCT)Ti atoms in isolated TiO4 Zn-O-Ti75UV-visDRSspectraofTiO2/SiO半导体材料禁带宽度的测定半导体材料禁带宽度的测定/nm76半导体材料禁带宽度的测定/nm76UV-visDRSspectraofcatalystsa.VSO-2b.VSO-4c.VSO-8b.d.VSO-12e.VSO-16f.VSO-20UV-visDRSspectraofcatalystsa.VSO-8b.Bi-VSO-8b.c.Ce-VSO-8d.Mn-VSO-8表面物种测定表面物种测定77UV-visDRSspectraofcatalyst表面物种含量测定表面物种含量测定78表面物种含量测定781.(CH3)3N其其max出现在出现在227nm处，试问若在酸中测定时，该峰会怎样变化处，试问若在酸中测定时，该峰会怎样变化?为什么为什么?课堂练习：课堂练习：2.某化合物在已烷溶液中其某化合物在已烷溶液中其max出现在出现在305nm，而在乙醇溶液中其，而在乙醇溶液中其max出现在出现在307nm，试问：该吸收是由，试问：该吸收是由n*还是由还是由*跃迁引起的跃迁引起的?为什么？为什么？3.请给出右面四种同分异构体的请给出右面四种同分异构体的max的的大小顺序？大小顺序？4.1.0l0-3mol/L的的K2Cr2O7溶液在波长溶液在波长450nm和和530nm处的吸光度分别为处的吸光度分别为0.200和和0.050;1.0l0-4mol/L的的KMO4溶液在溶液在450nm处无吸收，在处无吸收，在530nm处吸光度为处吸光度为0.420,今今测得测得K2Cr2O7和和KMO4的混合液在的混合液在450nm和和530nm处吸光度分别为处吸光度分别为0.380和和0.710，试，试计算该混合液中计算该混合液中K2Cr2O7和和KMO4的浓度的浓度?(假设吸收池厚度为假设吸收池厚度为10mm)791.(CH3)3N其max出现在227nm处，试问若在