移植免疫及免疫学检测实用课件

移植免疫及免疫学检测移植免疫及免疫学检测1移植（移植（transplantationtransplantation）:将健康将健康细胞、胞、组织或器或器官从其原部位移植到自体或异体的一定部位、用以官从其原部位移植到自体或异体的一定部位、用以替代或替代或补偿机体所机体所丧失的失的结构和（或）功能的构和（或）功能的现代代医医疗手段。手段。移植物（移植物（graftgraft）供供 体（体（donordonor）受受 体（体（recipientrecipient）或宿主（）或宿主（hosthost）概 述移植（transplantation）:将健康细胞、组织或器2 自体移植自体移植根据移植物来源根据移植物来源 同系移植同系移植 同种异体移植同种异体移植 异种移植异种移植 原位移植原位移植根据移植部位根据移植部位 异位移植异位移植 器官移植器官移植移植物种移植物种类 支架支架组织移植移植 细胞移植胞移植移植的移植的类型型 自3组织器官移植种类和命名 移植名称移植名称 供者、受者关系供者、受者关系 举例例 自体移植自体移植 同一个体同一个体 自体断肢再植，自体皮片移植自体断肢再植，自体皮片移植 同系或同基因移植同系或同基因移植 同系或同基因同系或同基因 人的人的单卵双生子卵双生子间的器官移植的器官移植 的个体的个体间 同品系小鼠的皮片移植同品系小鼠的皮片移植 同种异基因移植同种异基因移植 同种不同基因同种不同基因 人与人之人与人之间的的肾移植移植 的个体的个体间 不同品系小鼠不同品系小鼠间的皮片移植的皮片移植 异种移植异种移植 异种异种动物物间 狗的器官移植狗的器官移植给猩猩猩猩 猪的器官移植猪的器官移植给狗狗 组织器官移植种类和命名 移植名称 4第一节 引起排斥反应的靶抗原第一节 引起排斥反应的靶抗原51 1 主要主要组织相容性抗原相容性抗原人人 HLA HLA 鼠鼠 H-2 H-2遗传特征：特征：单倍型倍型遗传高度多高度多态性性2 2 次要次要组织相容性抗原相容性抗原 主要组织相容性抗原（MHC分子）1 主要组织相容性抗原主要组织相容性抗原（MHC分子）6 父父 母母 HLAHLA是人体多是人体多态性最丰富的性最丰富的基因系基因系统。据。据19991999年的年的统计，HLAHLA复合物等位基因复合物等位基因总数已达数已达到到10311031个，其中个，其中HLA-BHLA-B等位基等位基因有因有301301个个 A9Cw3B7A2Cw2B13A1Cw1B5A3Cw4B8HLAHLA的的遗传特征特征 父 母A9A2A1A3HLA的遗传特7第二节 排斥反应的种类及发生机制第二节 排斥反应的种类及发生机制8移植排斥反应（transplantation rejection）针对移移植植抗抗原原产生生免免疫疫应答答，从从而而导致致移移植植物物功功能能丧失失或或受者机体受者机体损害的害的过程。程。分分类：超急性排斥反超急性排斥反应 急性排斥反急性排斥反应 慢性排斥反慢性排斥反应移植排斥反应（transplantation rejecti9若PRA超过5，则应进行供者淋巴细胞与受者血清的交叉配型，FK506又名他克莫司(tacrolimus)，血清肌酐值和IL-2R同时增高提示急性排斥反应的发生肝移植受者的疗效检测衡，DR位点相配的个体，通常DQ位点也相配；血清学法（受者血清、供者细胞、荧光抗人Ig）器官移植交叉配型采用补体依赖的细胞毒试验RFLP与PCR-RFLP分型法基因芯片(gene chip)是近年发展起来的一项新技术,将其与PCR-SSO结合应用于HLA分型，可使分型趋于规模化和自动化，尤其在HLA多态性和疾病遗传背景分析等方面更具优势。自身交叉配型在急性排斥反应临床症状出现前15天，T细胞总数和CD4/CD8比值升高，巨细胞病毒感染时此比值降低。1、化学性免疫抑制剂肾移植受者的疗效检测1、化学性免疫抑制剂受者血清的CRP水平在移植后发生细菌或真菌感染时更为显著。ABO血型匹配：避免急性排斥反应的首要条件自体移植1、供受者之间ABO 血型不合；机制：机制：受受者者体体内内存存有有抗抗供供者者移移植植物物的的预存存抗抗体体，与与抗抗原原结合合，激激活活补体和凝血系体和凝血系统,导致血管内凝血。致血管内凝血。预存抗体来源：存抗体来源：1 1、供受者之、供受者之间ABO ABO 血型不合；血型不合；2 2、受者反复多次、受者反复多次输血、妊娠或既往作血、妊娠或既往作过移植。移植。处理：重新移植理：重新移植预防：防：ABOABO血型配型、血型配型、细胞毒胞毒实验1.1.超急性排斥反超急性排斥反应 若PRA超过5，则应进行供者淋巴细胞与受者血清的交叉配型，102.2.急性排斥反急性排斥反应 体液性排斥体液性排斥 抗体激活抗体激活补体，并有体，并有CD4CD4+T T 细胞参与，胞参与，导致急性血管炎致急性血管炎细胞性排斥胞性排斥 CD8 CD8+CTLCTL细胞的胞的细胞毒作用、胞毒作用、CD4CD4+T T和巨噬和巨噬细胞的作用，胞的作用，导致致急性急性间质炎。炎。处理理 使用免疫抑制使用免疫抑制剂2.急性排斥反应 体液性排斥11在急性排斥反在急性排斥反应中的两条抗原提呈途径：中的两条抗原提呈途径：直直接接途途径径（direct direct pathpath）:残残留留于于供供者者移移植植物物内内的的抗抗原原提提呈呈细胞胞（过客客细胞胞）对受受者者机机体体的的免免疫疫系系统提提供供最最初初的的抗抗原原刺刺激激。这种种抗抗原原性性刺刺激激，来来自自移移植植物物中中树突突状状细胞胞和和单核核细胞胞等等表表面面富富含的含的HLA-HLA-、-类分子分子 间接接途途径径 （indirect indirect pathpath）:通通过受受者者体体内内的的抗抗原原提提呈呈细胞胞对具具有有同同种种异异基基因因HLA-HLA-、-类分分子子的的移移植植物物实质细胞胞的的识别。无无论是是供供者者还是是受受者者，其其抗抗原原提提呈呈细胞胞提提供供的的IL-1IL-1、IL-6IL-6等等刺刺激激信号，有助于触信号，有助于触发淋巴淋巴细胞的活化胞的活化 在急性排斥反应中的两条抗原提呈途径：12同种移植排斥反同种移植排斥反应的的发生机制生机制 同种移植排斥反应的发生机制 13慢性排斥反慢性排斥反应的介的介导因素：因素：T T细胞、巨噬胞、巨噬细胞等介胞等介导的的迟发型超敏反型超敏反应等免疫等免疫损伤。B B细胞胞产生的抗体活化生的抗体活化补体或通体或通过ADCCADCC破坏血管内皮破坏血管内皮细胞。胞。急性排斥反急性排斥反应反复反复发作所作所导致的移植物致的移植物组织退行性退行性变，此与，此与细胞胞 和体液免疫均有关系。和体液免疫均有关系。非免疫相关因素，非免疫相关因素，诸如局部缺血、再灌注如局部缺血、再灌注损伤、微生物感染等。、微生物感染等。受者患有高血受者患有高血压或糖尿病也可促使慢性排斥反或糖尿病也可促使慢性排斥反应的的发生生临床特征：床特征：对免疫抑制免疫抑制疗法不敏感法不敏感无特异性治无特异性治疗方法，方法，最最终需要重新需要重新进行器官移植行器官移植 3.3.慢性排斥反慢性排斥反应慢性排斥反应的介导因素：3.慢性排斥反应14定定义：在在骨骨髓髓移移植植时，供供者者骨骨髓髓中中的的免免疫疫细胞胞启启动以以受受者者细胞胞为靶靶抗抗原原的的免免疫疫应答答反反应，引引起起攻攻击受受者者的的移移植植物物抗抗宿主反宿主反应。GVHDGVHD也可也可见于脾、胸腺和小于脾、胸腺和小肠移植。移植。发生机制：生机制：T T细胞起主要作用胞起主要作用 IL-2 IL-2、IL-6IL-6、TNF-TNF-、IFN-IFN-等等 ICAM ICAM、VCAMVCAM、CD44CD44、ELAM-1ELAM-1等等4.4.移植物抗宿主反移植物抗宿主反应定义：在骨髓移植时，供者骨髓中的免疫细胞启动以受者细胞为靶抗15第三节 HLA分型方法第三节 HLA分型方法16血清学分型法应用用一一系系列列已已知知抗抗HLAHLA的的特特异异性性标准准分分型型血血清清与与待待测淋淋巴巴细胞胞混混合合，借借助助补体的生物学作用介体的生物学作用介导细胞裂解的胞裂解的细胞毒胞毒试验。操作操作简便易行、便易行、节约试剂、结果可靠、重复性好果可靠、重复性好 无需特殊无需特殊设备 耗耗时长不同批号抗血清不同批号抗血清结果常有不同果常有不同血清学分型法应用一系列已知抗HLA的特异性标准分型血清与待测17用于用于HLAHLA分型的微量分型的微量细胞毒胞毒试验 用于HLA分型的微量细胞毒试验 18血清学分型法血清学分型法死（着染）死（着染）细胞（胞（%）记分分结果判断果判断0 010101 1阴性阴性111120202 2可疑阴性可疑阴性212150504 4弱阳性弱阳性515180806 6阳性阳性80808 8强阳性阳性0 0未未试验或不能或不能读数数血清学分型法死（着染）细胞（%）记分结果判断0101阴性119移植免疫及免疫学检测实用课件20HLA是人体多态性最丰富的基因系统。粘附分子及其配体在各类细胞表达情况1、化学性免疫抑制剂比较受者接受移植物前后的细胞因子水平1、供受者之间ABO 血型不合；检测非特异的淋巴细胞抗体（自身抗体）PCR-SSO是类HLA分型应用最广泛的方法，同系或同基因移植 同系或同基因 人的单卵双生子间的器官移植HLA I类抗体的筛选T细胞：检测抗HLA I类抗体；环孢菌素A(cyclosporine A，CsA)若PRA超过5，则应进行供者淋巴细胞与受者血清的交叉配型，HLA基因扩增的特异性包括：2、受者反复多次输血、妊娠或既往作过移植。细胞学法（供、受者细胞培养）IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-等细胞因子的水平均可升高血清肌酐值和IL-2R同时增高提示急性排斥反应的发生预存抗体来源：肾组织活检，预测排斥反应的发生细胞学分型法 以混合淋巴以混合淋巴细胞培养胞培养（mixed lymphocyte culture,MLCmixed lymphocyte culture,MLC）或称混合或称混合淋巴淋巴细胞反胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLRmixed lymphocyte reaction,MLR）为基本技基本技术的的HLAHLA分分型法。能用本法型法。能用本法测定的抗原称定的抗原称为LDLD抗原抗原（lymphocyte defined lymphocyte defined antigenantigen）,包括包括HLA-DHLA-D、-DP-DP。1.1.单向向MLCMLC原理：将已知原理：将已知HLAHLA型型别的分型的分型细胞用胞用丝裂霉素裂霉素C C或或X X线照射照射预处理，使其失去理，使其失去增殖能力增殖能力仅作作为刺激刺激细胞；而以具有增殖能力的受胞；而以具有增殖能力的受检者外周血者外周血单个核个核细胞胞为反反应细胞。两者混合培养胞。两者混合培养时，反，反应细胞可胞可对刺激刺激细胞胞发生生应答而增殖，用答而增殖，用3H-TdR3H-TdR掺入法入法测定定细胞增殖胞增殖强度，从而判断受度，从而判断受检细胞的胞的HLAHLA型型别。根据根据选用的刺激用的刺激细胞胞类型分型分为：1 1阴性分型法阴性分型法 2 2阳性分型法阳性分型法 HLA是人体多态性最丰富的基因系统。细胞学分型法 以混合21 遗传型型不不同同的的两两个个个个体体淋淋巴巴细胞胞在在体体外外混混合合培培养养时，由由于于两两者者HLAHLA不不同同，能能相相互互刺刺激激导致致对方方淋淋巴巴细胞胞增增殖殖，故故称称双双向向MLCMLC。在在此此试验中中，各各自自的的淋淋巴巴细胞胞既既是是刺刺激激细胞胞，又又是是反反应细胞胞，反反应后后形形态上上呈呈现的的细胞胞转化化和和分分裂裂现象象，可可通通过形形态法法计数数转化化细胞胞。2.2.双向双向MLCMLC 遗传型不同的两个个体淋巴细胞在体外混合培养时，由于两者HL22分子生物学分型法限限制制性性片片断断长度度多多态性性（restriction restriction fragment fragment length length polymorphism,polymorphism,RFLPRFLP）分析：分析：最早建立的研究最早建立的研究HLAHLA多多态性的性的DNADNA分型技分型技术 PCR-RFLPPCR-RFLP分分型型法法：对DNADNA片片段段进行行体体外外扩增增，然然后后再再用用限限制制性性内内切切酶进行行酶切分析，可使限制性切分析，可使限制性长度分析的敏感度大大增加度分析的敏感度大大增加1.RFLP1.RFLP与与PCR-RFLPPCR-RFLP分型法分型法 分子生物学分型法1.RFLP与PCR-RFLP分型法 23 序序列列特特异异性性寡寡核核苷苷酸酸-聚聚合合酶链反反应（PCR-sequence PCR-sequence specific specific oligonucleotide,oligonucleotide,PCR-SSOPCR-SSO）是是以以PCRPCR为基基础，将将凝凝胶胶上上扩增增的的HLAHLA基基因因DNADNA转移移至至硝硝酸酸纤维膜膜或或尼尼龙膜膜，进而而用用放放射射性性核核素素或或酶、地地高高辛辛等等非非放放射射性性物物质标记的的寡寡核核苷苷酸酸探探针与与之之进行行杂交，从而交，从而对扩增增产物作出物作出HLAHLA型型别判断。判断。分分类：斑斑点点或或印印渍法法：用用扩增增的的待待测DNADNA印印渍或或点点至至固固相相支支持持物物，再再与与探探针行行杂交交，利于大量利于大量标本分型本分型反反向向斑斑点点或或印印渍法法：将将已已知知DNADNA印印渍或或点点至至固固相相支支持持物物，然然后后与与扩增增的的待待测DNADNA（预先先标记）杂交，用于少量交，用于少量标本分型本分型 PCR-SSOPCR-SSO是是类HLAHLA分型分型应用最广泛的方法，用最广泛的方法，能能够鉴定所有已知序列的定所有已知序列的HLA-DRHLA-DR、DQDQ、DPDP等位基因等位基因 2.PCR-SSO2.PCR-SSO分型法分型法 2.PCR-SSO分型法 24基基因因芯芯片片(gene(gene chip)chip)是是近近年年发展展起起来来的的一一项新新技技术,将将其其与与PCR-SSOPCR-SSO结合合应用用于于HLAHLA分分型型，可可使使分分型型趋于于规模模化化和和自自动化化，尤尤其其在在HLAHLA多多态性性和和疾疾病病遗传背背景景分分析析等等方方面面更更具具优势。HLAHLA的的基基因因芯芯片片分分型型法法，实际上上是是PCR-SSOPCR-SSO反反向向斑斑点点或或印印渍法法的的微微型型化化。目目前前，基基因因芯芯片片在在HLAHLA分分型型领域域的的应用尚属起步用尚属起步阶段。段。2.PCR-SSO2.PCR-SSO分型法分型法 基因芯片(gene chip)是近年发展起来的一项新技术,将25原原理理：应用用设计的的一一套套HLAHLA等等位位基基因因的的序序列列特特异异性性引引物物（sequence sequence specific specific primer,SSPprimer,SSP）,对待待测DNADNA进行行PCRPCR扩增，从而增，从而获得得HLAHLA型型别特异性的特异性的扩增增产物物HLAHLA基因基因扩增的特异性包括：增的特异性包括：座位特异性（座位特异性（locus-specificlocus-specific），如，如HLA-AHLA-A、B B、-DRB1-DRB1等；等；组特异性（特异性（group-specificgroup-specific），如，如DRB1-01DRB1-01、DRB1-02DRB1-02等；等；等位基因特异性（等位基因特异性（allele-specificallele-specific），如，如DRB1*0401DRB1*0401、DRB1*0402DRB1*0402等。等。3.PCR-SSP3.PCR-SSP分型法分型法 3.PCR-SSP分型法 26单链构构象象特特异异性性聚聚合合酶链反反应（PCR-single PCR-single strand strand conformation conformation polymorphism,PCR-SSCPpolymorphism,PCR-SSCP）是是以以对待待测基基因因PCRPCR扩增增为基基础，对扩增增的的单链DNADNA（ssDNAssDNA）的）的HLAHLA分型方法。分型方法。原原理理：对ssDNAssDNA进行行无无变性性剂的的聚聚丙丙烯酰凝凝胶胶电泳泳时，因因其其序序列列的的差差异异可可形形成成不不同同的的空空间构构象象而而导致致电泳泳迁迁移移率率的的差差异异，如如此此可可分分辨辨出出单一一碱碱基基的的差差异异和和检测出出DNADNA多多态性或点突性或点突变，有助于新的，有助于新的HLAHLA等位基因或突等位基因或突变体的体的发现。特特点点：PCR-SSCPPCR-SSCP作作为PCR-SSOPCR-SSO的的补充充，在在区区分分纯合合子子和和杂合合子子基基因因方方面面有有其其独独到之到之处，有利于排除，有利于排除SSOSSO杂交的假性。交的假性。4.PCR-SSCP4.PCR-SSCP分型法分型法 4.PCR-SSCP分型法 27基基于于序序列列的的HLAHLA分分型型法法（sequence-based sequence-based HLA HLA typing,SBTtyping,SBT），通通过对扩增增后后的的HLAHLA基因片段通基因片段通过核酸序列核酸序列测定来判断定来判断HLAHLA型型别。基基本本过程程：分分离离待待测细胞胞的的DNADNA，应用用座座位位、组或或等等位位基基因因特特异异性性引引物物进行行PCRPCR扩增增，扩增增产物物的的纯化化和和测序序，测出出的的基基因因序序列列与与HLAHLA基基因因库的的DNADNA已已知知序序列列比比较，判断待，判断待测的的HLAHLA型型别。5.SBT5.SBT分型法分型法 5.SBT分型法 28第四节 常见的组织或器官移植第四节 常见的组织或器官移植29肾脏移植肾脏移植，移植，创始于始于19501950年，是年，是临床开展最早、床开展最早、应用最多和效果最佳的一种器官移植。用最多和效果最佳的一种器官移植。1.1.组织配型在配型在肾脏移植中的移植中的应用用 组织配型配型是是肾脏移植前移植前选择供者的重要手段供者的重要手段 ABO ABO血型配型、血型配型、HLA HLA配型和配型和 交叉配型交叉配型肾源源选择的原的原则 以以ABOABO血型完全相同者血型完全相同者为好，至少能好，至少能够相容相容 选择最佳最佳HLAHLA配型的供者器官配型的供者器官肾脏移植肾脏移植，创始于1950年，是临床开展最早、应用最多302.2.肾移植受者的移植受者的疗效效检测 疗效效监测：受者免疫状受者免疫状态检测临床床观测项目目:T T细胞胞总数数、CD4/CD8CD4/CD8比比值和和IL-2IL-2及及其其受受体体的的检测，判判断断排排斥斥反反 应的的发生和生和评估免疫抑制估免疫抑制剂治治疗效果效果 肾组织活活检，预测排斥反排斥反应的的发生生 CsA CsA血血药浓度度检测，指，指导合理用合理用药，减少，减少肾毒性毒性 2.肾移植受者的疗效检测 疗效监测：受者免疫状态检测31肝脏移植特点：特点：HLA HLA是否匹配与肝是否匹配与肝脏移植效果无移植效果无显著差异著差异机制：机制：肝肝脏移植移植时，因，因HLAHLA不配不配仅发生生较弱的排斥反弱的排斥反应，而免疫抑制，而免疫抑制剂 的的应用有效控制了排斥反用有效控制了排斥反应的的发生生肝肝脏移植移植时仍仍应尽可能尽可能进行行HLAHLA配型配型1.1.组织配型在肝配型在肝脏移植中的移植中的应用用 肝脏移植特点：HLA是否匹配与肝脏移植效果无显著差异1.组32组织病病理理学学特特点点：肝肝移移植植术后后第第2 2天天，汇管管区区出出现明明显的的白白细胞胞浸浸润，汇管管区区和和肝肝窦的的白白细胞胞浸浸润第第7 7天天达达高高峰峰，涉涉及及到到T T细胞胞、B B细胞胞、巨巨噬噬细胞胞、嗜嗜酸酸性性和和中中性性粒粒细胞胞。在在浸浸润的的T T细胞胞中中CD8+CD8+细胞胞高高于于CD4+CD4+细胞胞，也也见有有IL-2RIL-2R和和CD25+CD25+的活化的活化T T细胞。胞。排排斥斥反反应发生生几几率率：约2/32/3的的肝肝移移植植患患者者出出现过排排斥斥反反应的的病病理理学学改改变，也有也有8 8的病例的病例术后后发生急、慢性排斥反生急、慢性排斥反应，占肝移植致死原因的，占肝移植致死原因的10%10%。2.2.肝移植受者的肝移植受者的疗效效检测 组织病理学特点：肝移植术后第2天，汇管区出现明显的白细胞浸润33心脏移植与心肺联合移植ABOABO血型匹配：血型匹配：避免急性排斥反避免急性排斥反应的首要条件的首要条件HLA IHLA I、类分子匹配：分子匹配：移植器官移植器官长期存活的重要因素。期存活的重要因素。淋巴淋巴细胞毒交叉配合和群体反胞毒交叉配合和群体反应性抗体性抗体检测1.1.组织配型在心配型在心脏和心肺和心肺联合移植中的合移植中的应用用 心脏移植与心肺联合移植ABO血型匹配：避免急性排斥反应的首要34 免疫免疫监测指指标：外周血淋巴外周血淋巴细胞胞总数数 T T、B B细胞的胞的转化能力化能力 T T细胞胞亚类百分数及比百分数及比值 CTL CTL细胞毒作用胞毒作用 细胞因子及其受体表达或胞因子及其受体表达或转录水平水平 转化生化生长因子因子 NK NK细胞数及其介胞数及其介导的自然的自然杀伤或或ADCCADCC效效应 粘附分子及其配体在各粘附分子及其配体在各类细胞表达情况胞表达情况2.2.心心脏及心肺及心肺联合移植受者的合移植受者的疗效效检测 免疫监测指标：2.心脏及心肺联合移植受者的疗效检测 35骨髓与其他来源的干细胞移植特点：特点：可同可同时发生生HVGRHVGR和和GVHRGVHR 分分类：自体骨髓移植、自体骨髓移植、同基因骨髓移植同基因骨髓移植 同种异基因骨髓移植同种异基因骨髓移植（多（多见）1.1.骨髓移植骨髓移植 病例病例较少少成功率高成功率高 骨髓移植骨髓移植实际上是造血干上是造血干细胞移植，胞移植，因此，骨髓中造血干因此，骨髓中造血干细胞的胞的质和量和量对移植的成移植的成败致关重要。致关重要。骨髓与其他来源的干细胞移植特点：可同时发生HVGR和GVHR362.2.外周血和外周血和脐血干血干细胞移植胞移植 方法：方法：使用使用药物物动员剂促使造血干促使造血干细胞从骨髓胞从骨髓释放到外周血，从中放到外周血，从中获取足量的干取足量的干细胞用于移植，可胞用于移植，可获得与骨髓移植同得与骨髓移植同样的治的治疗目的目的特点：特点：与骨髓移植相比，具有采集方便、供者不需麻醉、移植后造与骨髓移植相比，具有采集方便、供者不需麻醉、移植后造血恢复快，血恢复快，GVHRGVHR发生率和生率和严重程度不高等重程度不高等优点。点。移植前移植前检测：HLAHLA和和ABOABO血型配型、血常血型配型、血常规与骨髓与骨髓检验、性染色体、性染色体测定、造血干定、造血干细胞胞鉴定和定和GVHRGVHR征象追踪等征象追踪等肿瘤干瘤干细胞的胞的发现，提示人，提示人们在在进行干行干细胞胞应用用时应该注意生物安全性。注意生物安全性。2.外周血和脐血干细胞移植 方法：使用药物动员剂促使造血干细37l适适应于于同同种种异异型型或或异异基基因因骨骨髓髓移移植植的的疾疾病病包包括括：再再生生障障碍碍性性贫血血、慢慢性性髓髓样白白血血病病等等血血液液系系统疾疾病病，以以及及脊脊髓髓发育育不不良良、严重重联合合免免疫疫缺缺陷陷病病、Wiskott-Wiskott-AldrichAldrich综合合征征、慢慢性性肉肉芽芽肿、X-X-性性联高高IgMIgM综合合征征（CD40LCD40L缺缺陷陷）、骨骨骼骼石石化化症症等免疫缺陷性疾病。等免疫缺陷性疾病。l乳乳腺腺、卵卵巢巢、睾睾丸丸以以及及肺肺部部等等实体体瘤瘤，不不宜宜行行骨骨髓髓移移植植，多多应用用自自体体末末稍稍血血干干细胞胞移移植植治治疗，而而自自体体末末稍稍血血干干细胞胞移移植植对再再生生障障碍碍性性贫血血、慢慢性性髓髓样白白血血病病和和免疫缺陷病无效。免疫缺陷病无效。l急急性性髓髓样白白血血病病、急急性性淋淋巴巴母母细胞胞性性白白血血病病、多多发性性骨骨髓髓瘤瘤、非非何何杰杰金金淋淋巴巴瘤瘤和和何何杰杰金金病病等等，则既既是是同同种种异异型型或或异异基基因因骨骨髓髓移移植植的的适适应症症，也也可可用用自自体体末末稍稍血血干干细胞移植胞移植进行治行治疗。3.3.适于骨髓或末稍血干适于骨髓或末稍血干细胞移植的常胞移植的常见疾病疾病 适应于同种异型或异基因骨髓移植的疾病包括：再生障碍性贫血、慢38第五节 排斥反应的预防与治疗第五节 排斥反应的预防与治疗39组织配型HLAHLA是引起同种异型移植排斥反是引起同种异型移植排斥反应的主要抗原的主要抗原供者与受者的供者与受者的HLAHLA等位基因匹配程度决定了移植排斥反等位基因匹配程度决定了移植排斥反应的的强弱程度弱程度通通过HLAHLA组织配型配型(tissue typing)(tissue typing)，选择合适的供者，减合适的供者，减轻排斥反排斥反应 1.HLA1.HLA配型配型移植物存活与移植物存活与HLAHLA配型的关系是：配型的关系是：供、受者供、受者HLA-AHLA-A和和HLA-BHLA-B相配的位点数越多，移植物存活机率越高；相配的位点数越多，移植物存活机率越高；供、受者供、受者HLA-DRHLA-DR位点相配更重要，因位点相配更重要，因为HLA-DRHLA-DR和和DQDQ基因有很基因有很强的的连锁不平不平 衡，衡，DRDR位点相配的个体，通常位点相配的个体，通常DQDQ位点也相配；位点也相配；不同地区不同地区HLAHLA匹配程度与移植匹配程度与移植结果的关系有着不同的果的关系有着不同的预测价价值，在欧洲，在欧洲HLAHLA 匹配的程度匹配的程度对移植移植结果的果的预测性比美国高，因性比美国高，因为欧洲人群的近交程度欧洲人群的近交程度较高高 ，导致致HLAHLA位点位点连锁不平衡性削弱。不平衡性削弱。组织配型HLA是引起同种异型移植排斥反应的主要抗原1.HLA40交叉配型采用交叉配型采用补体依体依赖的的细胞毒胞毒试验 阳性阳性对照照:阳性阳性对照血清可用淋巴照血清可用淋巴细胞免疫家兔胞免疫家兔获得得 阴性阴性对照照:阴性血清可采用无受血史的阴性血清可采用无受血史的ABAB血型男性血清血型男性血清根据反根据反应时参与的参与的细胞成分分胞成分分类：淋巴淋巴细胞交叉配型胞交叉配型 T T细胞淋巴胞淋巴细胞毒性交叉配型胞毒性交叉配型 B B细胞淋巴胞淋巴细胞毒性交叉配型胞毒性交叉配型 流式流式细胞法交叉配型胞法交叉配型 自身交叉配型自身交叉配型 结果判度果判度:交叉配型阳性交叉配型阳性:表明受者表明受者预存有抗供体的抗体存有抗供体的抗体临床意床意义:交叉配型阳性交叉配型阳性:即使即使组织配型好，也不宜配型好，也不宜进行移植，易行移植，易发生超急性排斥反生超急性排斥反应。在做受体在做受体选择时，组织配型差，但交叉配型配型差，但交叉配型为阴性，仍可阴性，仍可实施移植。施移植。交叉配型常用于交叉配型常用于肾脏移植移植2.HLA2.HLA交叉配型与交叉配型与预存抗体的存抗体的检测交叉配型采用补体依赖的细胞毒试验2.HLA交叉配型与预存抗体41方法方法方法方法类型与参与成分型与参与成分需需时应用用组织配型配型补体依体依赖的淋巴毒的淋巴毒试验血清学法（血清学法（HLAHLA抗血清、抗血清、补体、待体、待测细胞）胞）3h3hHLAHLA、类抗原抗原鉴定定交叉配型交叉配型PBLPBL交叉配型交叉配型血清学法血清学法（受着血清、供者（受着血清、供者细胞、胞、补体、有体、有/无无AHGAHG）3h3h检测受者血清中已存在的抗供者受者血清中已存在的抗供者抗体抗体TBTB交叉配型交叉配型血清学法（血清学法（纯化的供者化的供者T/BT/B细胞、受者血清、胞、受者血清、AHGAHG）3-6h3-6hT T细胞：胞：检测抗抗HLA IHLA I类抗体；抗体；B B细胞：胞：检测HLA IHLA I、IIII类抗体抗体MLCMLC试验细胞学法（供、受者胞学法（供、受者细胞培养）胞培养）6d6dHLA IIHLA II类抗原相容性抗原相容性CMLCML试验细胞学法（受者胞学法（受者细胞、供者刺激胞、供者刺激细胞作胞作为靶靶细胞）胞）4h4h抗供者抗供者CTLCTL检测FCCFCC血清学法（受者血清、供者血清学法（受者血清、供者细胞、胞、荧光抗人光抗人IgIg）3-4h3-4h检测非常弱的和无非常弱的和无细胞毒性的抗胞毒性的抗供者抗体供者抗体自身交叉配型自身交叉配型血清学法（受者血清学法（受者PBLPBL、T T和和B B细胞以及血清）和胞以及血清）和FCCFCC3-4h3-4h检测非特异的淋巴非特异的淋巴细胞抗体（自胞抗体（自身抗体）身抗体）HLAHLA抗体抗体筛选HLA IHLA I类抗体的抗体的筛选血清学法（受者血清、相血清学法（受者血清、相应的的HLAHLA类型型T T细胞或胞或PBLPBL）3h603h60细胞胞HLA IHLA I类抗体抗体检测，抗体特异性，抗体特异性鉴定定HLA IIHLA II类抗体的抗体的筛选血清学法血清学法（吸附（吸附过的受者血清、用作的受者血清、用作HLA-DR/DQHLA-DR/DQ分型的分型的B B细胞）胞）4h604h60细胞数加吸附胞数加吸附时间HLA IIHLA II类抗体抗体检测，抗体特异性，抗体特异性鉴定定CMLCML：细胞介胞介导的淋巴的淋巴细胞溶解胞溶解试验方法方法类型与参与成分需时应用组织配型补体依赖的淋巴毒试验血42可采用溶血法或比浊法进行检测。移植（transplantation）:将健康细胞、组织或器心脏移植与心肺联合移植ICAM、VCAM、CD44、ELAM-1等疗效监测：受者免疫状态检测08时:发生感染的可能性很大。RFLP与PCR-RFLP分型法若进行动态监测，对急性排斥反应和感染具有鉴别诊断的意义2 次要组织相容性抗原心脏移植与心肺联合移植2、受者反复多次输血、妊娠或既往作过移植。衡，DR位点相配的个体，通常DQ位点也相配；补体的裂解产物，如C3a、C3b、C3d等的测定受者体内存有抗供者移植物的预存抗体，与抗原结合，激活补体和凝血系统,导致血管内凝血。座位特异性（locus-specific），如HLA-A、B、-DRB1等；若PRA超过5，则应进行供者淋巴细胞与受者血清的交叉配型，斑点或印渍法：用扩增的待测DNA印渍或点至固相支持物，再与探针行杂交，利于大量标本分型外周血T细胞及其亚类的计数群体反应性抗体（panel reactive antibody,PRA）：指用40-60人含已知HLA的T细胞或T、B混合细胞，检测待移植受者血清所得到的抗体阳性百分数。HLA配型和T细胞总数、CD4/CD8比值和IL-2及其受体的检测，判断排斥反 应的发生和评估免疫抑制剂治疗效果群体反群体反应性抗体（性抗体（panel reactive antibody,PRApanel reactive antibody,PRA）：指用指用40-6040-60人含已人含已知知HLAHLA的的T T细胞或胞或T T、B B混合混合细胞，胞，检测待移植受者血清所得到的抗体阳性待移植受者血清所得到的抗体阳性百分数。百分数。检测意意义:用于判断器官移植用于判断器官移植时受体的敏感程度受体的敏感程度 高高PRAPRA血清血清:可可针对多个多个HLAHLA抗原抗原发生反生反应，受体，受体对所接受的移植器所接受的移植器 官或官或组织威威胁大大注意注意:应考考虑在不同在不同HLAHLA上可能出上可能出现的的共同表位或称共同表位或称公共抗原（公共抗原（public public antigensantigens）与受体血清与受体血清发生的交叉反生的交叉反应3.3.群体反群体反应性抗体的性抗体的检测可采用溶血法或比浊法进行检测。群体反应性抗体（panel r431.1.移植物的移植物的预处理理不同的不同的组织器官的移植，其移植物的器官的移植，其移植物的处理不尽相同理不尽相同首首先先是是从从移移植植术的的角角度度对离离体体组织器器官官进行行外外科科修修整整，然然后后根根据据不不同同器器官的要求采取相官的要求采取相应的的预处理理移植物与受体的预处理1.移植物的预处理不同的组织器官的移植，其移植物的处理不尽相44组织配型或交叉配型配型或交叉配型移植前移植前应用一定用一定剂量的免疫抑制量的免疫抑制剂，其用量，其用量视组织配型的配型的结果而定果而定术前前输血血,视患者的需要患者的需要进行行 受体的准受体的准备 组织配型或交叉配型受体的准备 45人工人工调节受者机体的免疫状受者机体的免疫状态是控制移植是控制移植术后排斥反后排斥反应发生的主要途径生的主要途径采取的措施有：采取的措施有：使用免疫抑制使用免疫抑制剂:以此控制受者的免疫以此控制受者的免疫应答，降低答，降低对移植物的排斥能力移植物的排斥能力 诱导免疫耐受免疫耐受:诱导受者受者对移植抗原的特异性免疫耐受移植抗原的特异性免疫耐受免疫抑制措施免疫抑制措施人工调节受者机体的免疫状态是控制移植术后排斥反应发生的主要途46参与移植排斥反参与移植排斥反应的免疫的免疫细胞以胞以T T细胞胞为主，主，T T细胞功能抑制分胞功能抑制分类：1.1.免疫抑制免疫抑制剂的的应用用1 1、化学性免疫抑制、化学性免疫抑制剂 3 3、生物性免疫抑制、生物性免疫抑制剂 2 2、某些中草、某些中草药 环孢菌素菌素A(cyclosporine AA(cyclosporine A，CsA)CsA)糖皮糖皮质激素，激素，硫硫唑嘌呤，呤，环磷磷酰胺，胺，FK506FK506又名又名他克莫司他克莫司(tacrolimus)(tacrolimus)，霉酚酸霉酚酸酯(mycophendate mofetil,MMF(mycophendate mofetil,MMF)抗淋巴抗淋巴细胞球蛋白胞球蛋白(ALG)(ALG)或或抗胸腺抗胸腺细胞球蛋白胞球蛋白(ATG)(ATG),细胞性胞性单克隆抗体，克隆抗体，某些融合蛋白某些融合蛋白,反反义寡核苷酸寡核苷酸(antisence oligonucleotide)(antisence oligonucleotide),参与移植排斥反应的免疫细胞以T细胞为主，1.免疫抑制剂的应用47常见免疫抑制剂作用位点常见免疫抑制剂作用位点 常见免疫抑制剂作用位点 48新的研究思路：新的研究思路：诱导同种抗原的特异性免疫耐受同种抗原的特异性免疫耐受:通通过将同种抗原置入子将同种抗原置入子宫或注射或注射给新生儿而新生儿而诱导诱导免免疫疫耐耐受受:应用用大大剂量量天天然然可可溶溶性性或或人人工工合合成成的的供供者者HLAHLA分分子子，封封闭同同种种抗抗原原特特异异性性T T细胞的胞的TCRTCR，以，以诱导受者特异性受者特异性T T细胞凋亡，胞凋亡，产生免疫耐受生免疫耐受诱导T T细胞胞无无能能：使使用用可可溶溶性性CTLA-4CTLA-4以以阻阻断断移移植植物物细胞胞的的B7B7与与受受者者T T细胞胞表表面面CD28CD28的的结合，干合，干扰共刺激信号的形成。共刺激信号的形成。CTLA-4CTLA-4与与IgFcIgFc段的融合蛋白也具有相似的作用段的融合蛋白也具有相似的作用阻碍阻碍T T细胞活化：胞活化：阻断阻断CD40-CD40LCD40-CD40L、CD2-LFA3CD2-LFA3等膜分子的相互作用等膜分子的相互作用诱导特异性耐受：特异性耐受：借助基因工程技借助基因工程技术，制，制备基因修基因修饰的免疫的免疫细胞胞T T细胞胞疫疫苗苗（T T cell cell vaccine,TCVvaccine,TCV）：诱导抗抗独独特特型型抗抗体体的的产生生，破破坏坏针对移移植植物物的的特特异性异性T T细胞，胞，诱导免疫耐受。免疫耐受。2.2.对移植抗原特异性免疫耐受移植抗原特异性免疫耐受诱导新的研究思路：2.对移植抗原特异性免疫耐受诱导49第六节 排斥反应的免疫监测第六节 排斥反应的免疫监测50体液免疫与细胞免疫水平检测的临床意义 特异性抗体水平的特异性抗体水平的检测 相关免疫指相关免疫指标：ABO ABO等血型和等血型和HLAHLA抗体抗体 抗供者抗供者组织细胞抗体胞抗体 血管内皮血管内皮细胞抗体胞抗体 冷凝集素冷凝集素 测定方法定方法:交叉配型、交叉配型、补体依体依赖的的细胞毒性胞毒性试验 血清血清PRAPRA水平水平:判断器官移植判断器官移植时受体受体对移植物的敏感程度，移植物的敏感程度，基于基于细胞毒性胞毒性试验的的PRAPRA测定，被作定，被作为心心脏移植前的常移植前的常规项目，目，若若PRAPRA超超过5 5，则应进行供者淋巴行供者淋巴细胞与受者血清的交叉配型，胞与受者血清的交叉配型，1.1.体液免疫水平体液免疫水平检测的的临床意床意义体液免疫与细胞免疫水平检测的临床意义 特异性抗体水平的检测151补体水平的体水平的检测补体活性与急性移植排斥反体活性与急性移植排斥反应的的发生有关生有关当移植物遭受排斥当移植物遭受排斥时，补体成分的消耗增加体成分的消耗增加可采用溶血法或比可采用溶血法或比浊法法进行行检测。补体活性的体活性的检测补体的裂解体的裂解产物，如物，如C3aC3a、C3bC3b、C3dC3d等的等的测定定常用的常用的检测方法有免疫方法有免疫电泳、免疫泳、免疫标记技技术 补体水平的检测522.2.细胞免疫水平胞免疫水平检测的的临床意床意义外周血外周血T T细胞及其胞及其亚类的的计数数 免疫免疫荧光法或流式光法或流式细胞胞仪测定定T T细胞及其胞及其亚群，群，在急性排斥反在急性排斥反应临床症状出床症状出现前前1 15 5天，天，T T细胞胞总数和数和CD4/CD8CD4/CD8比比值升高，巨升高，巨细胞胞病毒感染病毒感染时此比此比值降低。降低。CD4/CD8 CD4/CD8比比值大于大于1.201.20时:预示急性排斥即将示急性排斥即将发生，生，CD4/CD8 CD4/CD8比比值小于小于1.081.08时:发生感染的可能性很大。生感染的可能性很大。若若进行行动态监测，对急性排斥反急性排斥反应和感染具有和感染具有鉴别诊断的意断的意义NKNK细胞活性胞活性测定定 免疫抑制免疫抑制剂抑制了受者机体抑制了受者机体杀伤细胞的活性，但在急性排斥胞的活性，但在急性排斥时明明显升高升高 混合淋巴混合淋巴细胞反胞反应:刺激刺激细胞胞:灭活的供者的淋巴活的供者的淋巴细胞胞 反反应细胞胞:受者淋巴受者淋巴细胞胞 结果果显示的是示的是CTLCTL和和NKNK细胞共同作用的胞共同作用的结果。果。动态监测NKNK细胞活性胞活性则意意义更大更大2.细胞免疫水平检测的临床意义外周血T细胞及其亚类的计数53血清血清细胞胞细胞因子胞因子测定定 IL-1IL-1、IL-2IL-2、IL-4IL-4、IL-6IL-6、IFN-IFN-等等细胞因子的水平均可升高胞因子的水平均可升高 个体个体间血清血清IL-2RIL-2R的含量差的含量差别显著著粘附分子及其配体的粘附分子及其配体的检测免疫免疫细胞以及血管内皮胞以及血管内皮细胞等胞等细胞膜表面粘附分子及其配体的表达，与急性排斥胞膜表面粘附分子及其配体的表达，与急性排斥反反应的的发生密切相关。生密切相关。诸如如ELAM-1ELAM-1、VCAMVCAM、ICAMICAM和和HLAHLA分子等分子等比比较受者接受移植物前后的受者接受移植物前后的细胞因子水平胞因子水平环孢霉素霉素A A具有具有肾毒性，血清肌毒性，血清肌酐值增高，而增高，而IL-2RIL-2R却明却明显降低降低血清肌血清肌酐值和和IL-2RIL-2R同同时增高提示急性排斥反增高提示急性排斥反应的的发生生巨巨细胞病毒感染胞病毒感染时，IL-2RIL-2R血清含量的升高将更血清含量的升高将更为明明显血清细胞细胞因子测定比较受者接受移植物前后的细胞因子水平54尿微量蛋白检测的临床意义 尿微量蛋白尿微量蛋白检测意意义：判断大器官移植、尤其是判断大器官移植、尤其是肾脏移植移植时排斥反排斥反应的的发生生 检测免疫抑制免疫抑制药的肝的肝肾毒副作用毒副作用 1-1-微球蛋白是能微球蛋白是能较早反映早反映肾功能功能损害的指害的指标 尿尿-1-1微球蛋白和尿微球蛋白和尿IgGIgG与与肾移植受者短期移植受者短期肾功能关系密切功能关系密切尿微量蛋白种尿微量蛋白种类：血血浆蛋蛋白白：包包括括白白蛋蛋白白（AibAib）、IgGIgG、IgAIgA、IgMIgM、轻链（）、2-2-微微球球蛋蛋白白（2M2M）、补体体C3C3、11微微球球蛋蛋白白（1M1M）、22巨巨球球蛋蛋白白（2M2M）、转铁蛋蛋白白（TRFTRF）、游游离离血血红蛋蛋白白（HbHb）、肌肌红蛋蛋白白（MbMb）及及其他血其他血浆蛋白和蛋白和酶 非非血血浆蛋蛋白白：肾脏的的Tamm-HorsfallTamm-Horsfall蛋蛋白白（THPTHP）、SIgASIgA、肾小小球球基基底底膜（膜（GBMGBM）抗原等）抗原等尿微量蛋白检测的临床意义 尿微量蛋白检测意义：55急性时相反应物质检测的临床意义 C C反反应蛋蛋白白(C-reactive(C-reactive protein,protein,CRP)CRP)、IL-1IL-1、IL-6IL-6、TNFTNF以以及及HSPHSP等等炎炎症症分分子子，是是发生生炎炎症症反反应的的标志志性性分分子子，在在发生生感感染染性性疾疾病病和和自自身身免免疫性疾病疫性疾病时均有不同程度的增高。均有不同程度的增高。受者血清的受者血清的CRPCRP水平在移植后水平在移植后发生生细菌或真菌感染菌或真菌感染时更更为显著。著。CRPCRP水水平平与与肝肝、肾移移植植后后并并发症症的的发生生相相关关，且且CRPCRP水水平平似似乎乎比比白白细胞胞计数或数或发烧更能敏感地反映更能敏感地反映发生并生并发症的可能症的可能急性时相反应物质检测的临床意义 C反应蛋白(C-reacti56