第三章-高效液相色谱分析课件

3.1 高效液相色谱概述高效液相色谱概述l高效液相色谱高效液相色谱lHigh Performance Liquid Chromatography，HPLCl或或高压液相色谱高压液相色谱lHigh Pressure Liquid Chromatography l或高速液相色谱或高速液相色谱lHigh Speed Liquid Chromatographyl是在经典的柱层析、薄层层析和气相色谱的基础上发展是在经典的柱层析、薄层层析和气相色谱的基础上发展起来起来第三章第三章 高效液相色谱法高效液相色谱法3.1 高效液相色谱概述高效液相色谱第三章 高效液相色谱11、HPLC与经典与经典LC区别区别n主要区别：主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段固定相差别，输液设备和检测手段 区别区别固定相差别固定相差别输液设备输液设备检测手段检测手段用途用途LC柱内径柱内径13cm，固固定相粒径定相粒径 100m 且不均匀且不均匀常压常压输送输送流动相流动相；柱效低柱效低(H,n)分析周期分析周期长、无法长、无法在线检测在线检测仅做为一仅做为一种种分离手分离手段段HPLC柱内径柱内径26mm，固固定相粒径定相粒径BC正相（极性柱）与反相（非极性柱）的练习正相（极性柱）与反相（非极性柱）的练习正相色谱-低极性流动相 正相色谱-中极性流动相反10二、液二、液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatograph基本原理：基本原理：各组分在固定相吸附剂上竞争性各组分在固定相吸附剂上竞争性吸附吸附与与解吸解吸缺点：缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾非线形等温吸附常引起峰的拖尾固定相：固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较常使用的是固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂；流动相：流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。各种不同极性的一元或多元溶剂。特点：特点：适用于分离相对分子质量中等的适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样油溶性试样，对具，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；有官能团的化合物和异构体有较高选择性；二、液-固吸附色谱liquid-solid adsorp11三、离子对色谱三、离子对色谱ion-pair chromatograph基本原理：基本原理：离子对色谱法是分离分析离子对色谱法是分离分析强极性有机酸强极性有机酸和和有机碱有机碱的极好方法。的极好方法。将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，控制溶质离子的保留行为使其两相之疏水性离子对化合物，控制溶质离子的保留行为使其两相之间进行分配；间进行分配；阴离子分离：阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子 反相离子对色谱：反相离子对色谱：非极性的疏水固定相非极性的疏水固定相(C-18柱柱)，含有对离，含有对离子子Y+的甲醇的甲醇-水或乙腈水或乙腈-水作为流动相，试样离子水作为流动相，试样离子X-进入流动相进入流动相后，生成后，生成疏水性离子对疏水性离子对Y+X-在两相间分配。在两相间分配。三、离子对色谱ion-pair chromatograp12柠檬酸根的离子对色谱分离柠檬酸根的离子对色谱分离柠檬酸柠檬酸柠檬酸柠檬酸3-3-在在在在酸性酸性酸性酸性条件下与磷酸三丁酸反应生成具有一定疏条件下与磷酸三丁酸反应生成具有一定疏条件下与磷酸三丁酸反应生成具有一定疏条件下与磷酸三丁酸反应生成具有一定疏水性络合物水性络合物水性络合物水性络合物用用用用C-18柱分离柱分离柱分离柱分离碱性碱性碱性碱性条件下络合物解离。条件下络合物解离。条件下络合物解离。条件下络合物解离。柠檬酸柠檬酸柠檬酸柠檬酸 =柠檬酸柠檬酸柠檬酸柠檬酸3-3-3-3-+3HH+(water)(water)柠檬酸柠檬酸柠檬酸柠檬酸 +磷酸三丁酸磷酸三丁酸磷酸三丁酸磷酸三丁酸 =柠檬酸柠檬酸柠檬酸柠檬酸-磷酸三丁酸磷酸三丁酸磷酸三丁酸磷酸三丁酸(organic)(organic)碱性碱性碱性碱性酸性酸性酸性酸性QuestionQuestion：柠檬酸柠檬酸柠檬酸柠檬酸3-3-用离子交换色谱分离？用离子交换色谱分离？用离子交换色谱分离？用离子交换色谱分离？柠檬酸根的离子对色谱分离柠檬酸3-在酸性条件下与磷酸三丁酸反13四、离子交换色谱四、离子交换色谱ion-exchange chromatograph基本原理：基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换树脂（固定相）之间亲和力的大小与离子半径、与离子交换树脂（固定相）之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：阳离子交换：RSO3Na +M+=RSO3 M +Na+阴离子交换：阴离子交换：RNR4Cl +X-=RNR4 X+Cl-固定相：固定相：阴离子离子交换树脂阴离子离子交换树脂或或阳离子离子交换树脂；阳离子离子交换树脂；应用：应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。四、离子交换色谱ion-exchange chromato14五、离子色谱五、离子色谱ion chromatograph离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，对于那些如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。景电导信号掩没而无法检测。阴离子交换：阴离子交换：ROH +Na+Br-RBr+Na+OH-为了解决这一问题，为了解决这一问题，1975年年Small等人提出一种能同时测定多等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱后加一种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱，根抑制柱，抑制柱抑制柱中装填与中装填与分离柱电荷相反分离柱电荷相反的离子交换树脂的离子交换树脂五、离子色谱ion chromatograph离子色谱法15五、离子色谱五、离子色谱ion chromatograph 阳离子交换：阳离子交换：RH +Na+OH-RNa +H2O RH +Na+Br-RNa +H+Br-使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为技术称为离子色谱离子色谱。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。的强碱性阴离子交换剂。五、离子色谱ion chromatograph 阳离子交16六、排阻色谱六、排阻色谱size-exclusion chromatograph原理：原理：又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。现分离的。小分子小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中中等分子等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子大分子被排被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。固定相：固定相：凝胶凝胶(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)；可对相对分子质；可对相对分子质量在量在103-105范围内的化合物按质量分离范围内的化合物按质量分离六、排阻色谱size-exclusion chroma173.4 液相色谱法固定相液相色谱法固定相l固定相：固定相：又称柱填料，常用高效填料又称柱填料，常用高效填料510m（细粒度有利细粒度有利于减小涡流扩散效应，缩短溶质在两相间传质扩散过程）于减小涡流扩散效应，缩短溶质在两相间传质扩散过程）lHPLC：流动相为有机溶剂或水溶液，一定线速度下，流动流动相为有机溶剂或水溶液，一定线速度下，流动相对固定相表面有相当大的冲刷能力，且几乎没有一对完全相对固定相表面有相当大的冲刷能力，且几乎没有一对完全互不溶解的液体存在互不溶解的液体存在固定相流失严重固定相流失严重化学键合固定相化学键合固定相 通过化学反应把某个适当的官能团引入硅胶表面通过化学反应把某个适当的官能团引入硅胶表面各种类型的化学键合固定相占了将近各种类型的化学键合固定相占了将近78广泛地、大量使用不被溶剂抽提的，以微粒硅胶为基质的广泛地、大量使用不被溶剂抽提的，以微粒硅胶为基质的化学键合固定相，是近代化学键合固定相，是近代HPLC填料的又一特点填料的又一特点3.4 液相色谱法固定相固定相：又称柱填料，常用高效填料18固定相的分类固定相的分类多糖骨架多糖骨架微粒硅胶微粒硅胶1、按化学组成分类、按化学组成分类交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶交联琼脂糖凝胶交联琼脂糖凝胶苯乙烯与二乙烯基苯苯乙烯与二乙烯基苯共聚物、聚乙烯醇共聚物、聚乙烯醇高分子微球高分子微球微粒多孔碳微粒多孔碳2、结构和形状、结构和形状薄壳型薄壳型全孔型全孔型3-4 液相色谱法固定相液相色谱法固定相固定相的分类多糖骨架微粒硅胶1、按化学组成分类交联葡聚糖凝胶193-5 液相色谱法流动相液相色谱法流动相l又称冲洗剂、洗脱剂或载液又称冲洗剂、洗脱剂或载液流动相作用流动相作用携带样品前进携带样品前进给样品提供一个分配相给样品提供一个分配相调节选择性，使调节选择性，使混合物满意分离混合物满意分离l流动相选择要考虑分离、检测、输液系统的承受能力及色流动相选择要考虑分离、检测、输液系统的承受能力及色谱分离目的等各个方面谱分离目的等各个方面l与气相色谱法不同，当固定相选定时，流动相的种类、配与气相色谱法不同，当固定相选定时，流动相的种类、配比可显著改变组分分离状况比可显著改变组分分离状况3-5 液相色谱法流动相又称冲洗剂、洗脱剂或载液流动相作20HPLC对流动相要求对流动相要求流动相要求流动相要求黏度小黏度小提高液相传质（柱效）提高液相传质（柱效）降低柱压降降低柱压降对试样溶解度适宜对试样溶解度适宜与检测器相适应与检测器相适应 对紫外光度检测器而对紫外光度检测器而言，不能用对紫外光有言，不能用对紫外光有吸收的溶剂吸收的溶剂溶剂的纯度溶剂的纯度HPLC对流动相要求流动相要求黏度小提高液相传质（柱效）降低21l l流动相分类流动相分类流动相分类流动相分类 按流动相组成分按流动相组成分按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分；单组分和多组分；单组分和多组分；单组分和多组分；按极性分按极性分按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；按使用方式分按使用方式分按使用方式分按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗固定组成淋洗和梯度淋洗固定组成淋洗和梯度淋洗固定组成淋洗和梯度淋洗第三章-高效液相色谱分析课件22常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水、酰胺、腈、醇、酮、酯、醚、烃水、酰胺、腈、醇、酮、酯、醚、烃水、酰胺、腈、醇、酮、酯、醚、烃水、酰胺、腈、醇、酮、酯、醚、烃类类类类,etc.etc.常用溶剂：常用溶剂：常用溶剂：常用溶剂：水、乙腈、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、四氯化碳、水、乙腈、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、四氯化碳、水、乙腈、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、四氯化碳、水、乙腈、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、四氯化碳、己烷。己烷。己烷。己烷。通常根据所起的作用，流动相可分为：通常根据所起的作用，流动相可分为：通常根据所起的作用，流动相可分为：通常根据所起的作用，流动相可分为：底剂底剂底剂底剂及及及及洗脱剂洗脱剂洗脱剂洗脱剂两种两种两种两种底剂：底剂：底剂：底剂：决定基本的色谱分离情况；决定基本的色谱分离情况；决定基本的色谱分离情况；决定基本的色谱分离情况；洗脱剂：洗脱剂：洗脱剂：洗脱剂：调节试样组分的滞留并对几个组分具有选择性的分调节试样组分的滞留并对几个组分具有选择性的分调节试样组分的滞留并对几个组分具有选择性的分调节试样组分的滞留并对几个组分具有选择性的分离作用离作用离作用离作用采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。流动相选择流动相选择流动相选择流动相选择流动相选择231.液液分配色谱流动相采用采用采用采用正相液正相液正相液正相液-液分配分离液分配分离液分配分离液分配分离：底剂通常采用低极性的溶剂如：底剂通常采用低极性的溶剂如：底剂通常采用低极性的溶剂如：底剂通常采用低极性的溶剂如正己烷、苯、氯仿等，而洗脱剂则通常根据试样的性质正己烷、苯、氯仿等，而洗脱剂则通常根据试样的性质正己烷、苯、氯仿等，而洗脱剂则通常根据试样的性质正己烷、苯、氯仿等，而洗脱剂则通常根据试样的性质选取中等极性溶剂如醚、酮、醇等，若组分的保留时间选取中等极性溶剂如醚、酮、醇等，若组分的保留时间选取中等极性溶剂如醚、酮、醇等，若组分的保留时间选取中等极性溶剂如醚、酮、醇等，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。太短，降低溶剂极性，反之增加。太短，降低溶剂极性，反之增加。太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短留时间缩短留时间缩短留时间缩短反相色谱反相色谱反相色谱反相色谱中，通常以水作为流动相的主体（底剂），在中，通常以水作为流动相的主体（底剂），在中，通常以水作为流动相的主体（底剂），在中，通常以水作为流动相的主体（底剂），在洗脱时再加入不同配比的有机溶剂作为极性调节剂。洗脱时再加入不同配比的有机溶剂作为极性调节剂。洗脱时再加入不同配比的有机溶剂作为极性调节剂。洗脱时再加入不同配比的有机溶剂作为极性调节剂。1.液液分配色谱流动相采用正相液-液分配分离：底剂通常采用24人干扰素人干扰素人干扰素人干扰素-等电点等电点等电点等电点8.58.5底剂：底剂：底剂：底剂：5050mmol/L mmol/L 磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，pH8.0pH8.0洗脱剂：洗脱剂：洗脱剂：洗脱剂：5050mmol/L mmol/L 磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，pH8.0pH8.0，1mol/L NaCl1mol/L NaCl2.2.离子交换色谱流动相离子交换色谱流动相离子交换色谱流动相离子交换色谱流动相组分保留值可通过流动相中组分保留值可通过流动相中组分保留值可通过流动相中组分保留值可通过流动相中盐浓度盐浓度盐浓度盐浓度及及及及pHpHpHpH来调节来调节来调节来调节人干扰素-等电点8.52.离子交换色谱流动相253.体积排阻色谱流动相体积排阻色谱流动相l l特点：特点：特点：特点：l l组分不与固定相发生吸附，又不溶于溶解固定相。组分不与固定相发生吸附，又不溶于溶解固定相。组分不与固定相发生吸附，又不溶于溶解固定相。组分不与固定相发生吸附，又不溶于溶解固定相。l l各组分峰均在流动相的保留时间之前出峰，不能用来各组分峰均在流动相的保留时间之前出峰，不能用来各组分峰均在流动相的保留时间之前出峰，不能用来各组分峰均在流动相的保留时间之前出峰，不能用来分离大小相似、相对分子量接近的分子分离大小相似、相对分子量接近的分子分离大小相似、相对分子量接近的分子分离大小相似、相对分子量接近的分子l l固定相和流动相的选择简便，固定相和流动相的选择简便，固定相和流动相的选择简便，固定相和流动相的选择简便，不采用梯度洗脱不采用梯度洗脱不采用梯度洗脱不采用梯度洗脱3.体积排阻色谱流动相特点：263.6 高效液相色谱仪高效液相色谱仪l一、液体输送系统一、液体输送系统l二、梯度洗脱装置二、梯度洗脱装置l三、进样系统三、进样系统l四、馏分收集器四、馏分收集器l五、检测系统五、检测系统l六、色谱分离系统六、色谱分离系统3.6 高效液相色谱仪一、液体输送系统27液体输送系统液体输送系统梯度洗脱装置梯度洗脱装置进样系统进样系统馏分收集器馏分收集器检测系统检测系统色谱分离系统色谱分离系统高效液相色谱仪高效液相色谱仪液体输送系统高效液相色谱仪28一、液体输送系统一、液体输送系统高压输液泵高压输液泵用于输送流动相，由于色谱柱用于输送流动相，由于色谱柱很细很细、为了获得高柱效而使、为了获得高柱效而使用用粒度很小的固定相粒度很小的固定相（2000排阻色谱排阻色谱溶于水溶于水 水为流动相水为流动相不溶于水不溶于水 非水流动相非水流动相小结：分离类型选择小结：分离类型选择相对分子量相对分子量2000排阻色谱溶于水45第三章-高效液相色谱分析课件46第三章-高效液相色谱分析课件47