基因工程在食品工业中的应用课件

第二章第二章 基因工程原理及其在食基因工程原理及其在食品工业中的应用品工业中的应用 2021/7/232021/7/231 1第二章 基因工程原理及其在食品工业中的应用 2021/7/2第一节第一节 基因工程基础基因工程基础（一）基因工程的定义（一）基因工程的定义（一）基因工程的定义（一）基因工程的定义 1.1.基因（基因（genegene）DNA DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质最小功能单位。遗传物质最小功能单位。2.2.基因组（基因组（geneomegeneome）一个生物体的全部基因序列。一个生物体的全部基因序列。一、基因工程的定义、基本操作程序一、基因工程的定义、基本操作程序一、基因工程的定义、基本操作程序一、基因工程的定义、基本操作程序2021/7/232021/7/232 2第一节 基因工程基础（一）基因工程的定义一、基因工程的定义 3.3.基因表达（基因表达（gene expressiongene expression）遗传信息转录和翻译的过程。遗传信息转录和翻译的过程。（1 1）转录。在）转录。在DNADNA分子上合成出与其核苷酸顺序相分子上合成出与其核苷酸顺序相对应的对应的RNARNA的过程。的过程。（2 2）翻译。在）翻译。在RNARNA的控制下，根据核苷酸链上每三的控制下，根据核苷酸链上每三个核苷酸决定一个氨基酸的三联体密码规则，合成出具个核苷酸决定一个氨基酸的三联体密码规则，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链过程。有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链过程。（3 3）逆转录。以）逆转录。以RNARNA为模板，按照为模板，按照RNARNA中的核苷酸顺中的核苷酸顺序合成序合成DNADNA的过程。的过程。2021/7/232021/7/233 3 3.基因表达（gene expression）202 4.4.重组重组DNADNA技术（技术（recombinant DNA techniquerecombinant DNA technique）利用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同的利用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同的DNADNA进行体外切割、连接构成新的进行体外切割、连接构成新的DNADNA分子的技术。分子的技术。5.5.基因工程（基因工程（gene engineeringgene engineering）运用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同运用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同DNADNA进进行体外切割、连接构成重组行体外切割、连接构成重组DNADNA，再将重组，再将重组DNADNA经生物介经生物介导或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达，导或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达，从而改变生物遗传性以创造生物新种质，或通过大量扩从而改变生物遗传性以创造生物新种质，或通过大量扩增为人类提供有用产品等的技术。增为人类提供有用产品等的技术。6.6.食品基因工程食品基因工程 利用基因工程的技术和手段，在分子水平上定向重利用基因工程的技术和手段，在分子水平上定向重组遗传物质，以改良食品的品质和性状，提高食品的营组遗传物质，以改良食品的品质和性状，提高食品的营养价值、贮藏价格性状以及感官性状的技术。养价值、贮藏价格性状以及感官性状的技术。2021/7/232021/7/234 4 4.重组DNA技术（recombinant DNA 2021/7/232021/7/235 52021/7/235（二）基因工程的基本操作程序（二）基因工程的基本操作程序（二）基因工程的基本操作程序（二）基因工程的基本操作程序 1.1.运用合适的方法从生物体中分离或通过化学合成运用合适的方法从生物体中分离或通过化学合成制备目的基因。制备目的基因。2.2.采用合适的方法将目的基因与合适的载体进行体采用合适的方法将目的基因与合适的载体进行体外连接，构建重组外连接，构建重组DNADNA。3.3.利用合适的方法将重组利用合适的方法将重组DNADNA导入受体生物细胞以导入受体生物细胞以获得转化体。获得转化体。4.4.采用合适的方法筛选出重组转化体阳性克隆。采用合适的方法筛选出重组转化体阳性克隆。5.5.运用合适的方法对重组转化体阳性克隆进一步分运用合适的方法对重组转化体阳性克隆进一步分析以及操作，使目的基因在受体生物细胞中高效表达。析以及操作，使目的基因在受体生物细胞中高效表达。2021/7/232021/7/236 6（二）基因工程的基本操作程序2021/7/236（三）基因工程的三大理论和三大技术基础（三）基因工程的三大理论和三大技术基础（三）基因工程的三大理论和三大技术基础（三）基因工程的三大理论和三大技术基础 1.1.三大理论基础三大理论基础 （1 1）19401940年代年代AveryAvery等人的肺炎球菌的转化试验证明等人的肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是了生物的遗传物质是DNADNA。（2 2）19501950年代年代WatsonWatson和和CrickCrick发现了发现了DNADNA分子的双螺分子的双螺旋结构及旋结构及DNADNA半保留复制机理。半保留复制机理。（3 3）19601960年代年代CrickCrick关于遗传中心法则的确立，即生关于遗传中心法则的确立，即生物体中遗传信息是按物体中遗传信息是按DNARNADNARNA蛋白质方向进行传递。蛋白质方向进行传递。2.2.三大技术基础三大技术基础 （1 1）如何从生物体庞大的双链）如何从生物体庞大的双链DNADNA分子中将所需要的分子中将所需要的基因片段切割下来（限制性内切核酸酶）。基因片段切割下来（限制性内切核酸酶）。（2 2）如何将获得的基因片段进行连接（）如何将获得的基因片段进行连接（DNADNA连接酶）。连接酶）。（3 3）如何将切割下来的基因片段进行繁殖扩增（基）如何将切割下来的基因片段进行繁殖扩增（基因载体）。因载体）。2021/7/232021/7/237 7（三）基因工程的三大理论和三大技术基础2021/7/237二、基因工程的工具酶二、基因工程的工具酶二、基因工程的工具酶二、基因工程的工具酶 工具酶工具酶工具酶工具酶：基因工程的操作，是依赖于一些重要的酶：基因工程的操作，是依赖于一些重要的酶（例如，限制酶、聚合酶、连接酶等）作为工具来对基（例如，限制酶、聚合酶、连接酶等）作为工具来对基因进行切割和拼接等操作，这些酶被称为工具酶。因进行切割和拼接等操作，这些酶被称为工具酶。2021/7/232021/7/238 8二、基因工程的工具酶 工具酶：基因工程的操作，是依赖（一）限制性内切核酸酶与（一）限制性内切核酸酶与（一）限制性内切核酸酶与（一）限制性内切核酸酶与DNADNADNADNA甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶 1.1.限制作用与修饰作用限制作用与修饰作用 限制作用限制作用限制作用限制作用（restrictionrestriction）：指一定类型的细菌可以）：指一定类型的细菌可以通过其限制性内切核酸酶的作用，切割降解入侵的外源通过其限制性内切核酸酶的作用，切割降解入侵的外源DNADNA，使得外源，使得外源DNADNA的入侵受到限制的现象。的入侵受到限制的现象。修饰作用修饰作用修饰作用修饰作用（modificationmodification）：指在）：指在DNADNA甲基化酶作用甲基化酶作用下，生物体自身下，生物体自身DNADNA分子在分子在特定碱基特定碱基特定碱基特定碱基的特定位置上发生甲的特定位置上发生甲基化而得到修饰，从而免遭自身限制性内切核酸酶降解基化而得到修饰，从而免遭自身限制性内切核酸酶降解的现象。的现象。2021/7/232021/7/239 9（一）限制性内切核酸酶与DNA甲基化酶 2021/7/239 2.2.限制性内切核酸酶与限制性内切核酸酶与DNADNA甲基化酶甲基化酶 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（restriction endonucleaserestriction endonuclease）：）：简称限制酶，指一类能够识别和切割双链简称限制酶，指一类能够识别和切割双链DNADNA分子内核苷分子内核苷酸序列的内切核酸酶。酸序列的内切核酸酶。DNA DNA DNA DNA甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶（DNA methylaseDNA methylase）：简称甲基化酶，）：简称甲基化酶，指一类能够识别指一类能够识别DNADNA特定序列，并在其特定碱基的特定位特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶。置上引入甲基而发生修饰作用的酶。2021/7/232021/7/231010 2.限制性内切核酸酶与DNA甲基化酶2021/7/2 3.3.限制性内切核酸酶的类型限制性内切核酸酶的类型 （1 1）型型型型。由由三三种种不不同同亚亚基基组组成成；辅辅助助因因子子为为ATPATP、MgMg2+2+及及S-S-腺腺苷苷甲甲硫硫氨氨酸酸；切切割割位位点点距距其其识识别别位位点点至至少少1 1 000bp000bp；切切割割作作用用随随机机。型型限限制制酶酶不不宜宜作作为为基基因因工工程程的的工工具酶。具酶。（2 2）型型型型。由两个相同亚基组成；辅助因子仅为。由两个相同亚基组成；辅助因子仅为MgMg2+2+；识别位点常具；识别位点常具旋转对称性旋转对称性旋转对称性旋转对称性；切割位点与其识别位点重叠；切割位点与其识别位点重叠或在其附近；切割作用特异性强。或在其附近；切割作用特异性强。型限制酶是基因工程型限制酶是基因工程型限制酶是基因工程型限制酶是基因工程理想的工具酶理想的工具酶理想的工具酶理想的工具酶。（3 3）型型型型。由由两两种种不不同同亚亚基基组组成成；辅辅助助因因子子为为ATPATP和和MgMg2+2+，也也受受S-S-腺腺苷苷甲甲硫硫氨氨酸酸激激活活，但但并并非非必必需需；切切割割位位点点一一般般在在距距其其识识别别位位点点33端端242426bp26bp处处。型型限限制制酶酶在在基基因因工工程中也不常用。程中也不常用。2021/7/232021/7/231111 3.限制性内切核酸酶的类型2021/7/2311 限限限限制制制制性性性性内内内内切切切切核核核核酸酸酸酸酶酶酶酶没没没没有有有有种种种种属属属属特特特特异异异异性性性性，即即限限制制性性内内切切核核酸酸酶酶识识别别、切切割割特特定定序序列列的的能能力力同同底底物物DNADNA的的来来源源无无关关，它可识别、切割各种来源的它可识别、切割各种来源的DNADNA。DNADNADNADNA甲基化酶具有种属特异性甲基化酶具有种属特异性甲基化酶具有种属特异性甲基化酶具有种属特异性，生物体的，生物体的DNADNA甲基化甲基化酶只修饰保护自己的酶只修饰保护自己的DNADNA，而不修饰保护非己的，而不修饰保护非己的DNADNA。生。生物体的限制性内切核酸酶不能降解自身被修饰保护的物体的限制性内切核酸酶不能降解自身被修饰保护的DNADNA，而只能降解外源的，而只能降解外源的DNADNA。2021/7/232021/7/231212 限制性内切核酸酶没有种属特异性，即限制性内切核酸酶识表表4-1 4-1 限制性内切核酸酶的类型及主要特性限制性内切核酸酶的类型及主要特性 主要特性主要特性型型型型 型型型型 型型型型 酶蛋白构成酶蛋白构成三种不同亚基三种不同亚基 两个相同亚基两个相同亚基 两种不同亚基两种不同亚基 酶活辅助因子酶活辅助因子ATPATP、MgMg2+2+及及S-S-腺苷甲腺苷甲硫氨酸硫氨酸 MgMg2+2+ATPATP、MgMg2+2+识别序列特性识别序列特性EcoB:TGANEcoB:TGAN8 8TGCTTGCTEcoK:AACNEcoK:AACN6 6GTGCGTGC旋转对称旋转对称旋转对称旋转对称EcoP:AGACCEcoP:AGACCEcoPEcoP1515:CAGCAG:CAGCAG切割位点切割位点距其特异识别位点至距其特异识别位点至少少1000bp1000bp处随机切割处随机切割在特异切割位在特异切割位点上或其附近点上或其附近特异切割特异切割距其识别位点距其识别位点33端端242426bp26bp处处 特特异切割异切割2021/7/232021/7/231313表4-1 限制性内切核酸酶的类型及主要特性 主要特性型 4.4.型限制性内切核酸酶的切割方式型限制性内切核酸酶的切割方式 在识别序列双链在识别序列双链DNADNA两条链的对称轴上同时切断磷酸两条链的对称轴上同时切断磷酸二酯键，形成二酯键，形成双链平齐末端双链平齐末端双链平齐末端双链平齐末端。在识别序列双链在识别序列双链DNADNA两条链的对称轴两侧同时从两条链的对称轴两侧同时从33端端切断磷酸二酯键，形成切断磷酸二酯键，形成3-3-3-3-羟基羟基羟基羟基端端2 25 5个核苷酸突出个核苷酸突出单链单链单链单链黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端。在识别序列双链在识别序列双链DNADNA两条链的对称轴两侧同时从两条链的对称轴两侧同时从55端端切断磷酸二酯键，形成切断磷酸二酯键，形成5-5-5-5-磷酸磷酸磷酸磷酸端端2 25 5个核苷酸突出个核苷酸突出单链单链单链单链黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端。2021/7/232021/7/231414 4.型限制性内切核酸酶的切割方式2021/7/232021/7/232021/7/2315152021/7/2315 5.5.影响限制性核酸内切酶活性的主要因素影响限制性核酸内切酶活性的主要因素 （1 1）底物）底物DNADNA制备物的纯度制备物的纯度 蛋白质、十二烷基硫酸钠（蛋白质、十二烷基硫酸钠（SDSSDS）、乙二胺四乙酸）、乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）、酚、氯仿、乙醇及高浓度的盐离子等污染物）、酚、氯仿、乙醇及高浓度的盐离子等污染物都会抑制限制酶的活性。都会抑制限制酶的活性。（2 2）底物）底物DNADNA的甲基化程度的甲基化程度 dam dam dam dam甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶：特异地催化：特异地催化DNADNA分子中分子中5GATC35GATC3序序列中的列中的腺嘌呤腺嘌呤腺嘌呤腺嘌呤N N N N7 7 7 7位置的甲基化。位置的甲基化。dcm dcm dcm dcm甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶：催化：催化DNADNA分子中分子中5CCAGG35CCAGG3或或5CCTGG35CCTGG3序列中的序列中的胞嘧啶胞嘧啶胞嘧啶胞嘧啶C C C C5 5 5 5位置的甲基化。位置的甲基化。2021/7/232021/7/231616 5.影响限制性核酸内切酶活性的主要因素2021/7/（3 3）底物）底物DNADNA的结构构型的结构构型 环环状状双双螺螺旋旋DNADNA较较线线性性DNADNA稳稳定定。在在用用限限制制酶酶酶酶解解同同样样分分子子质质量量的的DNADNA时时，环环状状双双螺螺旋旋DNADNA所所需需酶酶量量为为线线性性DNADNA所所需需酶量的酶量的10102020倍。倍。（4 4）酶反应缓冲液的组成）酶反应缓冲液的组成 酶反应体系中常含酶反应体系中常含MgClMgCl2 2、NaClNaCl或或KClKCl、三羟甲基氨基、三羟甲基氨基甲烷（甲烷（TrisTris）-HCl-HCl、-巯基乙醇、二硫苏糖醇（巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTTDTT）、）、牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（BSABSA）等。）等。Tris-HClTris-HCl的作用在于使反应液的的作用在于使反应液的pHpH值稳定于酶活性所要求的最佳范围内，而后三者均有稳值稳定于酶活性所要求的最佳范围内，而后三者均有稳定酶的作用。定酶的作用。2021/7/232021/7/231717 （3）底物DNA的结构构型2021/7/2317 （5 5）酶反应的最适温度）酶反应的最适温度 大多数限制酶反应的最适温度为大多数限制酶反应的最适温度为3737，少数限制酶反，少数限制酶反应的最适温度高于或低于此温度。反应温度高于或低于其应的最适温度高于或低于此温度。反应温度高于或低于其最适温度，酶的活力均会下降。应根据各限制酶反应的最最适温度，酶的活力均会下降。应根据各限制酶反应的最适温度作相应调整。适温度作相应调整。2021/7/232021/7/231818 （5）酶反应的最适温度2021/7/2318 6.6.限制酶的主要用途限制酶的主要用途 （1 1）在特异位点上切割）在特异位点上切割DNADNA，产生特异的限制酶切割的，产生特异的限制酶切割的DNADNA片段。片段。（2 2）建立）建立DNADNA分子的限制酶图谱。分子的限制酶图谱。限制酶图谱限制酶图谱限制酶图谱限制酶图谱（restriction maprestriction map）:指一系列限制酶的特指一系列限制酶的特异识别序列在异识别序列在DNADNA链上的出现频率和它们之间的相对位置。链上的出现频率和它们之间的相对位置。（3 3）构建基因文库。）构建基因文库。基因工程中，将某种生物的全部基因组的遗传信息，贮基因工程中，将某种生物的全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因组遗传信息的应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因组遗传信息的材料，称为材料，称为基因文库基因文库基因文库基因文库（gene librarygene library）（4 4）用限制酶切出相同的黏性末端，以便重组）用限制酶切出相同的黏性末端，以便重组DNADNA。2021/7/232021/7/231919 6.限制酶的主要用途2021/7/23192021/7/232021/7/2320202021/7/23202021/7/232021/7/2321212021/7/2321（二）（二）（二）（二）DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 依赖于依赖于依赖于依赖于DNADNADNADNA的的的的DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶（全酶）；大肠杆菌（全酶）；大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶大片段（大片段（KlenowKlenow片段）、耐热的片段）、耐热的DNADNA聚合酶（聚合酶（Taq DNATaq DNA聚聚合酶）等。合酶）等。依赖于依赖于依赖于依赖于RNARNARNARNA的的的的DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶（即逆转录酶）（即逆转录酶）优先以优先以RNARNA为模板，也可以为模板，也可以DNADNA为模板。逆转录酶能以为模板。逆转录酶能以RNARNA为模板催化合成双链为模板催化合成双链DNADNA。末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）（简称末端转移酶）不以不以DNADNA或或RNARNA为模板，而只是将核苷酸加到已有为模板，而只是将核苷酸加到已有DNADNA分分子的末端。子的末端。2021/7/232021/7/232222（二）DNA聚合酶 2021/7/2322 DNADNADNADNA聚合酶作用的条件聚合酶作用的条件聚合酶作用的条件聚合酶作用的条件 （1 1）要有底物）要有底物4 4种脱氧核苷酸三磷酸（种脱氧核苷酸三磷酸（dNTPdNTP）为前）为前体催化合成体催化合成DNADNA，接受模板指导，产物的性质与模板编，接受模板指导，产物的性质与模板编码相同。码相同。（2 2）不能起始合成新的）不能起始合成新的DNADNA链，要有引物链，要有引物3-3-羟基羟基的存在。的存在。（3 3）催化）催化dNTPdNTP加到生长中的加到生长中的DNADNA链的链的3-3-羟基末端。羟基末端。（4 4）催化）催化DNADNA合成的方向是合成的方向是53 53。2021/7/232021/7/232323 DNA聚合酶作用的条件2021/7/2323 1.1.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶（全酶）（全酶）一一种种从从大大肠肠杆杆菌菌中中分分离离出出的的一一条条分分子子质质量量为为109KDa109KDa的的多肽链（球蛋白）。多肽链（球蛋白）。具有三种活性具有三种活性具有三种活性具有三种活性：53DNA53DNA聚合酶活性，以单链聚合酶活性，以单链DNADNA为模板，以带为模板，以带33自由羟基的自由羟基的DNADNA片段为引物；片段为引物；5353外切核酸酶活性，从外切核酸酶活性，从55端既降解双链端既降解双链DNADNA，也，也降解降解RNA-DNARNA-DNA杂交体中的杂交体中的RNARNA链（链（RNARNA酶酶H H活性）；活性）；3535外切核酸酶活性，底物为带外切核酸酶活性，底物为带33自由羟基的双链自由羟基的双链DNADNA或单链或单链DNADNA。主要用于主要用于主要用于主要用于：以切刻平移法标记以切刻平移法标记DNADNA；对对DNADNA分子的分子的33突出尾进行末端标记。突出尾进行末端标记。2021/7/232021/7/232424 1.大肠杆菌DNA聚合酶（全酶）2021/7/232021/7/232021/7/2325252021/7/2325 2.2.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶大片段（大片段（KlenowKlenow片段）片段）一一条条分分子子质质量量为为76KDa76KDa的的多多肽肽链链，一一般般由由大大肠肠杆杆菌菌DNADNA聚聚合合酶酶I I全全酶酶经经枯枯草草杆杆菌菌蛋蛋白白酶酶水水解解获获得得，也也可可通通过过克克隆隆技术获得。技术获得。具有两种活性具有两种活性具有两种活性具有两种活性：53DNA53DNA聚合酶活性，以单链聚合酶活性，以单链DNADNA为模板，以带为模板，以带33自由羟基的自由羟基的DNADNA片段为引物。片段为引物。3535外切核酸酶活性，底物为带外切核酸酶活性，底物为带33自由羟基的双自由羟基的双链链DNADNA或单链或单链DNADNA。2021/7/232021/7/232626 2.大肠杆菌DNA聚合酶大片段（Klenow片段）2021/7/232021/7/2327272021/7/2327 3.Taq DNA 3.Taq DNA聚合酶聚合酶 最最初初来来源源于于水水生生栖栖热热菌菌（Thermus Thermus aquaticusaquaticus），现现可可由由基基因因工工程程途途径径来来生生产产。分分子子质质量量为为65KDa65KDa，是是一一种种非非常耐热的依赖于常耐热的依赖于DNADNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。具具具具有有有有一一一一种种种种活活活活性性性性：53DNA53DNA聚聚合合酶酶活活性性，以以单单链链DNADNA为模板，以带为模板，以带33自由羟基的自由羟基的DNADNA片段为引物。片段为引物。主要用于主要用于主要用于主要用于：对对DNADNA进行测序。进行测序。通过聚合酶链式反通过聚合酶链式反应（应（polymerase chain reactionpolymerase chain reaction，PCRPCR）对）对DNADNA分子的特分子的特定序列进行体外扩增。定序列进行体外扩增。2021/7/232021/7/232828 3.Taq DNA聚合酶2021/7/2328 4.4.逆转录酶（依赖于逆转录酶（依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶）聚合酶）常常常常用用用用的的的的逆逆逆逆转转转转录录录录酶酶酶酶有有有有两两两两种种种种：一一种种来来自自禽禽成成髓髓细细胞胞瘤瘤病病毒毒（AMVAMV），由由两两条条多多肽肽链链组组成成，分分子子质质量量为为170KDa170KDa。一一种种来来自自鼠鼠白白血血病病病病毒毒（MLVMLV）逆逆转转录录酶酶基基因因的的大大肠肠杆杆菌菌，由单链多肽组成，分子质量为由单链多肽组成，分子质量为84KDa84KDa。具有两种活性具有两种活性具有两种活性具有两种活性：53DNA53DNA聚合酶活性，以聚合酶活性，以RNARNA或者或者DNADNA为模板，以带为模板，以带33自由羟基的自由羟基的RNARNA或或DNADNA片段为引片段为引物。物。RNARNA酶酶H H活性，即活性，即53 53 外切核糖核酸酶活性，外切核糖核酸酶活性，特异地降解特异地降解RNA-DNARNA-DNA杂交体中的杂交体中的RNARNA。逆转录酶无逆转录酶无3535外切核酸酶活性，即无校对功外切核酸酶活性，即无校对功能，其催化的聚合反应容易出错。能，其催化的聚合反应容易出错。2021/7/232021/7/232929 4.逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）2021/72021/7/232021/7/2330302021/7/2330 5.5.末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）来来源源于于小小牛牛胸胸腺腺，分分子子质质量量为为60KDa60KDa，是是一一种种不不需需要要模板的特殊的模板的特殊的DNADNA聚合酶。聚合酶。具有一种活性具有一种活性具有一种活性具有一种活性：即末端转移酶活性，在二价阳离子存：即末端转移酶活性，在二价阳离子存在下，其催化在下，其催化dNTPdNTP加于加于DNADNA分子的分子的3-3-羟基端。羟基端。主要用于主要用于主要用于主要用于：给载体给载体DNADNA或或cDNAcDNA加上互补的同聚尾。加上互补的同聚尾。以以3232P P标记的一种标记的一种dNTPdNTP或一种或一种rNTPrNTP来标记来标记DNADNA片段的片段的33端端。2021/7/232021/7/233131 5.末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）2021/7/（三）连接酶、磷酸酶（三）连接酶、磷酸酶（三）连接酶、磷酸酶（三）连接酶、磷酸酶 1.T 1.T4 4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶 来源于来源于T T T T4 4 4 4噬菌体感染的大肠杆菌，分子质量为噬菌体感染的大肠杆菌，分子质量为68KDa68KDa。具具具具有有有有一一一一种种种种活活活活性性性性：即即催催化化DNADNA的的55磷磷酸酸基基与与33羟羟基基之之间间形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键。该该酶酶的的核核酸酸底底物物为为黏黏性性末末端端DNADNA、平平齐末端齐末端DNADNA等。等。主要用于主要用于主要用于主要用于：连接带匹配黏性末端的连接带匹配黏性末端的DNADNA分子。分子。使使平齐末端的双链平齐末端的双链DNADNA分子互相连接或与合成接头相连接。分子互相连接或与合成接头相连接。2021/7/232021/7/233232（三）连接酶、磷酸酶2021/7/2332 2.2.碱性磷酸酶碱性磷酸酶 来来源源于于大大肠肠杆杆菌菌及及牛牛小小肠肠。包包括括细细细细菌菌菌菌碱碱碱碱性性性性磷磷磷磷酸酸酸酸酶酶酶酶（bacterial bacterial alkaline alkaline phosphatasephosphatase，BAPBAP）和和牛牛牛牛小小小小肠肠肠肠碱碱碱碱性性性性磷磷磷磷酸酸酸酸酶酶酶酶（calf calf intestinal intestinal alkaline alkaline phosphatasephosphatase，CIPCIP）。）。具具磷磷磷磷酸酸酸酸酶酶酶酶活活活活性性性性，催催化化去去除除55磷磷酸酸的的反反应应。底底物物为为单单链或双链链或双链DNADNA及及RNARNA、dNTPdNTP。主要用于主要用于主要用于主要用于：在用在用3232P P标记标记55末端前，去除末端前，去除DNADNA或或RNARNA分子的分子的55磷酸。磷酸。去除去除DNADNA片段片段55磷酸，以防自身环化。磷酸，以防自身环化。2021/7/232021/7/233333 2.碱性磷酸酶2021/7/2333三、基因工程的载体三、基因工程的载体三、基因工程的载体三、基因工程的载体 载体载体载体载体（vectorvector）：携带外源基因进入受体细胞的运）：携带外源基因进入受体细胞的运载工具。载工具。基因工程载体的特性基因工程载体的特性基因工程载体的特性基因工程载体的特性:（1 1）能在宿主细胞内进行独立和稳定的）能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNADNA自我复制。自我复制。在插入外源基因后，仍然保持着稳定的复制状态和遗传在插入外源基因后，仍然保持着稳定的复制状态和遗传特性。特性。（2 2）易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。）易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。（3 3）DNADNA序列中有适当的限制性内切酶位点，最好是序列中有适当的限制性内切酶位点，最好是单一酶切位点，并位于单一酶切位点，并位于DNADNA复制的非必需区内，可以在这复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源些位点上插入外源DNADNA，但不影响载体自身，但不影响载体自身DNADNA的复制。的复制。（4 4）具有能够观察到的表型特征，在插入外源）具有能够观察到的表型特征，在插入外源DNADNA后，后，这些特征可以作为重组这些特征可以作为重组DNADNA选择的标志。选择的标志。2021/7/232021/7/233434三、基因工程的载体 载体（vector）：携带外源基 载体的报告基因载体的报告基因载体的报告基因载体的报告基因（标记基因）：基因工程中利用载体（标记基因）：基因工程中利用载体上引入的一些具有特殊标志意义的基因，可用来证明载体上引入的一些具有特殊标志意义的基因，可用来证明载体已经进入宿主细胞，并可用来将含有目的基因的宿主细胞已经进入宿主细胞，并可用来将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来，这种具有标志意义从其他细胞中识别区分甚至挑选出来，这种具有标志意义的基因称为报告基因（的基因称为报告基因（reporter genereporter gene）或标记基因。）或标记基因。最常用的报告基因有抗药性基因（例如，抗氨苄青霉最常用的报告基因有抗药性基因（例如，抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素等抗生素抗性基因），素、抗四环素、抗氯霉素等抗生素抗性基因），此外，还此外，还有氯霉素乙酰转移酶基因（有氯霉素乙酰转移酶基因（CATCAT基因）、基因）、-半乳糖苷酶基半乳糖苷酶基因（因（lacZlacZ）、）、-球蛋白基因和人生长激素基因等。球蛋白基因和人生长激素基因等。2021/7/232021/7/233535 载体的报告基因（标记基因）：基因工程中利用载体上引入 按照介导的作用目的，可将基因工程载体主要分为按照介导的作用目的，可将基因工程载体主要分为克克克克隆载体隆载体隆载体隆载体和和表达载体表达载体表达载体表达载体。克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体：有一个松弛性复制系统，能使外源：有一个松弛性复制系统，能使外源DNADNA在受在受体生物细胞中扩增复制。（例如，细菌质粒载体、体生物细胞中扩增复制。（例如，细菌质粒载体、噬菌体噬菌体载体、柯氏质粒载体）载体、柯氏质粒载体）表达载体表达载体表达载体表达载体：有一个受体生物细胞所要求的包括启动子序：有一个受体生物细胞所要求的包括启动子序列在内的调控系统，能使外源基因在受体生物细胞中进行功列在内的调控系统，能使外源基因在受体生物细胞中进行功能表达。（例如，能表达。（例如，TiTi质粒、质粒、SVSV4040猴状病毒）猴状病毒）按照导入的受体生物，一般可将基因工程载体分为按照导入的受体生物，一般可将基因工程载体分为大肠大肠大肠大肠杆菌（原核细胞）载体杆菌（原核细胞）载体杆菌（原核细胞）载体杆菌（原核细胞）载体、酵母载体酵母载体酵母载体酵母载体、植物载体植物载体植物载体植物载体、动物载体动物载体动物载体动物载体等。等。2021/7/232021/7/233636 按照介导的作用目的，可将基因工程载体主要分为克隆载体（一）大肠杆菌载体（一）大肠杆菌载体（一）大肠杆菌载体（一）大肠杆菌载体 1.1.质粒载体质粒载体 质质质质粒粒粒粒:指指细细菌菌等等生生物物细细胞胞内内一一类类独独立立于于染染色色体体外外而而能能自我复制的遗传物质。自我复制的遗传物质。质质质质粒粒粒粒拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数（plasmid plasmid copy copy numbernumber）：一一种种质质粒粒在在一个细胞中存在的数目。一个细胞中存在的数目。2021/7/232021/7/233737（一）大肠杆菌载体 2021/7/2337（1 1）质粒的生物学特性）质粒的生物学特性 一般为一般为双链双链双链双链的的共价闭合环状共价闭合环状共价闭合环状共价闭合环状DNADNADNADNA（ccc DNAccc DNA），质粒），质粒分子的长度一般为分子的长度一般为1 1200 kb200 kb。不同质粒的分子质量差异。不同质粒的分子质量差异显著，小质粒的分子质量约为显著，小质粒的分子质量约为10103 3KDaKDa，仅能编码，仅能编码2 23 3种种中等大小的蛋白质；而大质粒的分子质量可达中等大小的蛋白质；而大质粒的分子质量可达10105 5KDaKDa。2021/7/232021/7/233838（1）质粒的生物学特性2021/7/2338 （2 2）质粒的分类）质粒的分类 根据复制控制类型：一般可将大肠杆菌质粒分为根据复制控制类型：一般可将大肠杆菌质粒分为严紧严紧严紧严紧型复制控制质粒型复制控制质粒型复制控制质粒型复制控制质粒和和松弛型复制控制质粒松弛型复制控制质粒松弛型复制控制质粒松弛型复制控制质粒。严紧型复制控制质粒严紧型复制控制质粒严紧型复制控制质粒严紧型复制控制质粒:复制与宿主染色体的复制同步，复制与宿主染色体的复制同步，并与宿主蛋白质的合成有关，而与并与宿主蛋白质的合成有关，而与DNADNA聚合酶聚合酶的活性无关。的活性无关。如果宿主蛋白质的合成终止，质粒与宿主染色体的复制也如果宿主蛋白质的合成终止，质粒与宿主染色体的复制也停止。每个宿主细胞中只能达到停止。每个宿主细胞中只能达到1 1至数个拷贝。至数个拷贝。松弛型复制控制质粒松弛型复制控制质粒松弛型复制控制质粒松弛型复制控制质粒:复制与宿主染色体的复制不同步，复制与宿主染色体的复制不同步，其与其与DNADNA聚合酶聚合酶的活性有关，而与蛋白质的合成无关。当的活性有关，而与蛋白质的合成无关。当宿主蛋白质的合成终止时，质粒仍可复制。每个宿主细胞宿主蛋白质的合成终止时，质粒仍可复制。每个宿主细胞中的质粒拷贝数可达中的质粒拷贝数可达1010200200个。个。2021/7/232021/7/233939 （2）质粒的分类 2021/7/2339 （3 3）质粒克隆载体的条件）质粒克隆载体的条件 分子结构中具有多个单一限制酶切位点，具有易被分子结构中具有多个单一限制酶切位点，具有易被检测的选择标记基因，且切点位于选择标记基因上。检测的选择标记基因，且切点位于选择标记基因上。能插入、运载一定大小的外源基因。能插入、运载一定大小的外源基因。在携带外源基因前后在宿主细胞内均能自主复制。在携带外源基因前后在宿主细胞内均能自主复制。在与外源基因构建重组质粒后具有在与外源基因构建重组质粒后具有转化功能转化功能转化功能转化功能。分子质量小，易于操作，一般为分子质量小，易于操作，一般为松弛型复制控制松弛型复制控制松弛型复制控制松弛型复制控制。容易控制，安全可靠。容易控制，安全可靠。现已通过现已通过DNADNA重组技术构建了许多质粒克隆载体供基重组技术构建了许多质粒克隆载体供基因工程应用，例如，因工程应用，例如，pBR322pBR322、pUCpUC系列等。系列等。2021/7/232021/7/234040 （3）质粒克隆载体的条件2021/7/23402021/7/232021/7/2341412021/7/2341 （4 4）质粒）质粒pBR322pBR322 组成组成组成组成 氨苄青霉素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因（ampampr r）四环素抗性基因（四环素抗性基因（tettetr r）DNA DNA复制起始点（复制起始点（oriori）优点优点优点优点 分子质量小。分子质量小。具有两种抗菌素抗性基因可供作具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子转化子转化子转化子的选择标记。的选择标记。较高的拷贝数。较高的拷贝数。2021/7/232021/7/234242 （4）质粒pBR3222021/7/23422021/7/232021/7/2343432021/7/2343 （5 5）pUCpUC质粒载体质粒载体 组成组成组成组成 来自来自pBR322pBR322的复制起始点（的复制起始点（oriori）大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZlacZ）的启动子及）的启动子及其编码其编码-肽链的肽链的DNADNA序列，此结构称为序列，此结构称为lacZlacZ基因。基因。氨苄青霉素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因（ampampr r），但其核苷酸序列有），但其核苷酸序列有变化，不含原来内切限制酶的单位识别位点。变化，不含原来内切限制酶的单位识别位点。位于位于lacZlacZ基因中的靠近基因中的靠近55端的一段端的一段多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点（MCSMCS）区，但它并不破坏该基因的功能。）区，但它并不破坏该基因的功能。优点优点优点优点 更小的分子质量和更高的拷贝数。更小的分子质量和更高的拷贝数。适用于组织化学方法检测重组体。适用于组织化学方法检测重组体。有多克隆区位点。有多克隆区位点。2021/7/232021/7/234444 （5）pUC质粒载体2021/7/23442021/7/232021/7/2345452021/7/2345 2.2.噬菌体载体噬菌体载体 （1 1）噬菌体的生物学特性）噬菌体的生物学特性 不不同同种种类类的的噬噬菌菌体体（颗颗粒粒）在在外外形形上上差差别别很很大大。大大多多数数噬噬菌菌体体颗颗粒粒由由呈呈2020面面体体的的头头部部及及尾尾部部构构成成，例例如如，噬噬菌菌体体；还还有有一一些些噬噬菌菌体体颗颗粒粒为为线线状状体体形形，例例如如，M M1313。在在结结构上，噬菌体颗粒比质粒复杂。构上，噬菌体颗粒比质粒复杂。噬噬菌菌体体颗颗粒粒的的外外壳壳是是蛋蛋白白质质，内内部部是是核核酸酸。该该核核酸酸最最常常见见的的构构型型是是线线线线状状状状双双双双链链链链DNADNADNADNA，此此外外，还还有有环环状状双双链链DNADNA、线线状单链状单链DNADNA、环状单链、环状单链DNADNA等。等。2021/7/232021/7/234646 2.噬菌体载体2021/7/23462021/7/232021/7/2347472021/7/2347 （2 2）噬菌体载体噬菌体载体 噬菌体颗粒由头与尾两部分组成。头部装载了其整噬菌体颗粒由头与尾两部分组成。头部装载了其整个基因组个基因组DNADNA。DNA DNA为一长度约为一长度约48.5 kb48.5 kb的线状双链的线状双链DNADNA分子，可以分子，可以分为三个区段：左臂、中央区和右臂。在左臂和右臂的分为三个区段：左臂、中央区和右臂。在左臂和右臂的55处各有处各有1212个碱基长的互补单链（从而构成黏性末端）。个碱基长的互补单链（从而构成黏性末端）。当当噬菌体感染宿主细胞时，噬菌体感染宿主细胞时，DNADNA被注入宿主细胞后会被注入宿主细胞后会迅速通过黏性末端的互补作用形成迅速通过黏性末端的互补作用形成环状双链环状双链环状双链环状双链DNADNADNADNA分子分子分子分子。2021/7/232021/7/234848 （2）噬菌体载体2021/7/2348 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体载载载载体体体体的的的的优优优优点点点点：可可携携带带较较长长的的外外源源DNADNA片片段段。重重组组后后的的DNADNA分分子子可可在在体体外外被被包包装装成成噬噬菌菌体体颗颗粒粒。重重组的噬菌体容易筛选和贮存。组的噬菌体容易筛选和贮存。噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的必必必必要要要要基基基基因因因因：DNADNA至至少少包包括括6161个个基基因因。其其中中大大约约半半数数基基因因参参与与噬噬菌菌体体生生命命周周期期活活动动，位位于于其其左左臂臂和右臂，这类基因称作和右臂，这类基因称作噬菌体的必要基因噬菌体的必要基因噬菌体的必要基因噬菌体的必要基因。噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的非非非非必必必必要要要要基基基基因因因因：另另一一部部分分基基因因在在被被外外源源基基因因取取代代后后并并不不影影响响噬噬菌菌体体的的生生命命周周期期活活动动，位位于于其其中中央央区，这类基因称作区，这类基因称作噬菌体的非必要基因噬菌体的非必要基因噬菌体的非必要基因噬菌体的非必要基因。cos cos cos cos位点位点位点位点（cohesive-end sitecohesive-end site）：由黏性末端结合）：由黏性末端结合形成的双链区段。形成的双链区段。2021/7/232021/7/234949 噬菌体载体的优点：可携带较长的外源DNA片段。噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体载载载载体体体体的的的的分分分分类类类类：根根据据插插入入方方式式，一一般般可可将将噬菌体载体分为噬菌体载体分为插入型载体插入型载体插入型载体插入型载体和和置换型载体置换型载体置换型载体置换型载体。插入型载体插入型载体插入型载体插入型载体（insertion vectorinsertion vector）：指在基因组的）：指在基因组的非必要基因区内有一种或不止一种限制酶的单一酶切位非必要基因区内有一种或不止一种限制酶的单一酶切位点可供外源点可供外源DNADNA插入，而不缺失其本身任何片段的插入，而不缺失其本身任何片段的噬菌噬菌体载体。由插入型载体得到的重组体载体。由插入型载体得到的重组DNADNA分子都比原载体长。分子都比原载体长。插入型载体可容纳的外源插入型载体可容纳的外源DNADNA片段相对较小，一般在片段相对较小，一般在10 kb10 kb以内。广泛应用于以内。广泛应用于cDNAcDNA以及小片段以及小片段DNADNA的克隆。的克隆。2021/7/232021/7/235050 噬菌体载体的分类：根据插入方式，一般可将噬菌体载 置置置置换换换换型型型型（取取取取代代代代型型型型）载载载载体体体体（replacement replacement vectorvector）：指指在在基基因因组组的的非非必必要要基基因因区区内内两两个个或或两两个个以以上上的的限限制制酶酶切切位位点点间间的的DNADNA区区段段可可被被插插入入的的外外源源DNADNA片片段段所所置置换换的的噬噬菌菌体体载体。载体。置置换换型型载载体体容容纳纳外外源源DNADNA片片段段大大小小的的范范围围一一般般在在9 922 22 kbkb之间。之间。有些有些有些有些噬菌体载体兼有插入和置换两种外源噬菌体载体兼有插入和置换两种外源噬菌体载体兼有插入和置换两种外源噬菌体载体兼有插入和置换两种外源DNADNADNADNA片段的片段的片段的片段的插入方式插入方式插入方式插入方式，这具体取决于载体与外源这具体取决于载体与外源这具体取决于载体与外源这具体取决于载体与外源DNADNADNADNA末端匹配的限制酶末端匹配的限制酶末端匹配的限制酶末端匹配的限制酶切位点的种类和数目等切位点的种类和数目等切位点的种类和数目等切位点的种类和数目等。2021/7/232021/7/235151 置换型（取代型）载体（replacement vec2021/7/232021/7/2352522021/7/2352 3.3.柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（Cosmid vectorCosmid vector）也也称称黏黏粒粒载载体体，指指一一类类由由人人工工构构建建的的含含有有抗抗性性基基因因、单单一一克克隆隆位位点点、DNADNA的的coscoscoscos位位位位点点点点和和质质粒粒复复复复制制制制子子子子的的特特殊殊类类型型的质粒载体。分子质量较小，一般为的质粒载体。分子质量较小，一般为4 46kb6kb。（1 1）柯斯质粒载体的组成）柯斯质粒载体的组成 1 1个质粒复制起始区域个质粒复制起始区域复制子复制子复制子复制子（基因组中能独立进（基因组中能独立进行复制的单位）；行复制的单位）；至少至少1 1个抗药性选择标记基因；个抗药性选择标记基因；至少至少1 1个限制酶的单一识别切割位点；个限制酶的单一识别切割位点；1 1个个噬菌体黏性末端片段噬菌体黏性末端片段coscos位点。位点。2021/7/232021/7/235353 3.柯斯质粒载体（Cosmid vector）202 （2 2）柯斯质粒载体的特点）柯斯质粒载体的特点 具有质粒载体的特性具有质粒载体的特性具有质粒载体的特性具有质粒载体的特性：它带有质粒的复制子，能像：它带有质粒的复制子，能像质粒质粒DNADNA一样在宿主细胞内复制，也能在氯霉素的作用下一样在宿主细胞内复制，也能在氯霉素的作用下进行扩增。带有抗生素抗性基因，有些还带有基因插入失进行扩增。带有抗生素抗性基因，有些还带有基因插入失活的克隆位点，为重组体的筛选提供了简便的标记。活的克隆位点，为重组体的筛选提供了简便的标记。具有具有具有具有噬菌体载体的特性噬菌体载体的特性噬菌体载体的特性噬菌体载体的特性：它在与适宜长度的外源：它在与适宜长度的外源DNADNA片段重组后，可在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效片段重组后，可在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效地转入对地转入对噬菌体敏感的大肠杆菌宿主细胞。进入宿主细噬菌体敏感的大肠杆菌宿主细胞。进入宿主细胞后，也能像胞后，也能像噬菌体一样进行环化。噬菌体一样进行环化。具有高容量的克隆能力具有高容量的克隆能力具有高容量的克隆能力具有高容量的克隆能力：质粒载体的克隆容量一般：质粒载体的克隆容量一般为为10 kb10 kb，噬菌体载体的克隆容量理论极限值是噬菌体载体的克隆容量理论极限值是23 kb23 kb，一般为一般为15 kb15 kb左右，而柯斯质粒载体的克隆极限可达左右，而柯斯质粒载体的克隆极限可达45 kb 45 kb 左右。左右。2021/7/232021/7/235454 （2）柯斯质粒载体的特点2021/7/23542021/7/232021/7/2355552021/7/2355（一）基本原理（一）基本原理（一）基本原理（一）基本原理 在在模模板板DNADNA、引引物物和和4 4种种脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸存存在在的的条条件件下下，利用利用DNADNA聚合酶催化合成反应，体外扩增特异聚合酶催化合成反应，体外扩增特异DNADNA片段。片段。在进行在进行PCRPCR扩增时，通常需要设计合成一对与目的扩增时，通常需要设计合成一对与目的DNADNA片段两侧翼序列分别互补的寡核苷酸引物。其中一引物与片段两侧翼序列分别互补的寡核苷酸引物。其中一引物与目的区段上游一条模板链的序列相互补，而另一引物与目目的区段上游一条模板链的序列相互补，而另一引物与目的区段下游另一条模板链的序列相互补。的区段下游另一条模板链的序列相互补。四、多聚酶链式反应（四、多聚酶链式反应（四、多聚酶链式反应（四、多聚酶链式反应（PCRPCRPCRPCR）技术）技术）技术）技术2021/7/232021/7/235656（一）基本原理四、多聚酶链式反应（PCR）技术2021/7/将热变性后分开的两条模板链与摩尔数大大过量的将热变性后分开的两条模板链与摩尔数大大过量的两个引物共同温育复性产生的模板引物杂交体作为作两个引物共同温育复性产生的模板引物杂交体作为作用底物，利用耐热的用底物，利用耐热的Taq DNATaq DNA聚合酶催化延伸合成反应。聚合酶催化延伸合成反应。在第一轮扩增完毕后，将反应混合物再加热使新构成的在第一轮扩增完毕后，将反应混合物再加热使新构成的双链双链DNADNA变性，然后再度温育使模板链与引物复性，进变性，然后再度温育使模板链与引物复性，进入第二轮特异性合成。由于耐热的入第二轮特异性合成