兔自身免疫性干眼模型制作及检测课件

兔自身免疫性干眼模型制作及兔自身免疫性干眼模型制作及检测兔自身免疫性干眼模型制作及检测兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型概要概要通通过体外分离、培养兔泪腺上皮体外分离、培养兔泪腺上皮细胞和自体外周血胞和自体外周血淋巴淋巴细胞，建立二者的共培养体系。将体外激活的胞，建立二者的共培养体系。将体外激活的自体外周血淋巴自体外周血淋巴细胞通胞通过耳耳缘静脉注射的方法静脉注射的方法诱发自身免疫性泪腺炎。从而建立自身免疫性泪腺炎。从而建立稳定的兔自身免疫性定的兔自身免疫性干眼模型，干眼模型，对干眼干眼临床指床指标及泪腺及泪腺细胞因子表达胞因子表达进行行检测。兔自身免疫性干眼模型概要兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验动物物：成年雌性新西成年雌性新西兰白兔，体白兔，体质量量kg。实验前前进行兔子行兔子临床眼科床眼科检查,排除已患有眼部炎症和其他疾病的排除已患有眼部炎症和其他疾病的动物，物，建立正常兔眼的建立正常兔眼的临床床检查指指标的基的基线水平。水平。饲养养环境符合医学境符合医学实验动物物环境的要求，境的要求，动物物饲养房温度养房温度为 252，相，相对湿度湿度 50%75%，12 小小时光照昼夜循光照昼夜循环，通，通风状况好。状况好。兔自身免疫性干眼模型实验动物：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验所用的主要所用的主要仪器、器、设备及材料及材料：生物超生物超净工作台工作台CO2恒温恒温细胞培养箱胞培养箱移液移液枪-80超低温超低温冰箱冰箱倒置相差显微镜倒置相差显微镜台式离心机台式离心机裂隙灯显微镜摄像系统裂隙灯显微镜摄像系统离心管、枪头离心管、枪头PCR仪仪实时定量实时定量PCR仪仪流式细胞仪流式细胞仪流式管流式管超纯水装置超纯水装置低温水箱低温水箱裂隙灯显微镜裂隙灯显微镜恒温水浴锅恒温水浴锅眼科手术器械眼科手术器械祸旋仪祸旋仪高压蒸汽消毒器高压蒸汽消毒器电子天平电子天平鼓风式干燥箱鼓风式干燥箱磁力搅拌器磁力搅拌器PH测量计测量计荧光显微镜荧光显微镜SY-600恒温水箱恒温水箱Nylon细胞滤网细胞滤网兔自身免疫性干眼模型实验所用的主要仪器、设备及材料：生物超兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型主要主要试剂及溶液配制及溶液配制：淋巴淋巴细胞培养基（胞培养基（CM）RPMI1640细胞培养基细胞培养基 450ml胎牛血清（胎牛血清（FBS）10%青链霉素青链霉素 100U/mlL-谷氨酰胺谷氨酰胺 2mM泪腺上皮泪腺上皮细胞培养基（胞培养基（DMEM）DMEM（1X high glucose）450ml胎牛血清（胎牛血清（FBS）10%青链霉素青链霉素 100U/mlL-谷氨酰胺谷氨酰胺 2mM兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型主要主要试剂及溶液配制及溶液配制：Hams液液Hams F-12 1LHepes 10ml/L牛血清蛋白蛋白（牛血清蛋白蛋白（BSA）100U/ml胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 50mg/L丁酸丁酸青链霉素青链霉素 100U/mlL-谷氨酰胺谷氨酰胺 2mM亚油酸亚油酸 1mg/ml 42ul各组分充分溶解于各组分充分溶解于900ml Hams F-12后调节后调节PH值至值至7.4，Hams F-12定容定容至至1000ml，0.22m 滤器过滤，滤器过滤，4冰箱保存备用冰箱保存备用。兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型主要主要试剂及溶液配制及溶液配制：Hanks液液Hanks Salts 1bottleHepes 各组分充分溶解于各组分充分溶解于900ml 超纯水超纯水后调节后调节PH值至值至7.4，超纯水定容至，超纯水定容至 1000mL，0.22m 滤器过滤，滤器过滤，4冰箱避光保存冰箱避光保存。混合消化酶（混合消化酶（CDH）胶原酶胶原酶 collagenase 450unit/ml透明质酸酶透明质酸酶 hyyaluronidase 200unit/mlDNA酶酶 25unit/ml分别称取计算好的分别称取计算好的型胶原酶和透明质酸酶，将其充分溶解于一定体积的型胶原酶和透明质酸酶，将其充分溶解于一定体积的 Hams液中，加入溶解分装好的液中，加入溶解分装好的 DNA 酶充分混匀，酶充分混匀，0.22m 滤器过滤，滤器过滤，4冰箱备用冰箱备用。兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型主要主要试剂及溶液配制及溶液配制：10%FicollFicoll 粉与粉与 DPBS 按比例配制高压灭菌按比例配制高压灭菌,分装后分装后-20C 避光保存避光保存。实时突光定量实时突光定量 PCR 试剂盒试剂盒 SYBR Green(Roche 491385001)PE-Anti-Human Foxp3(Biolegend)Anti-Rabbit CD4(Mouse anti-Rabbit Monoclonal AntibodyAbD)淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液 无无 RNA 酶水（酶水（DEPC 水）水）兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法方法：1、兔泪腺上皮兔泪腺上皮细胞分离、胞分离、纯化、培养化、培养（1）新西新西兰兰大白兔肌肉注射大白兔肌肉注射陆陆眠宁和眠宁和氯氯胺胺酮酮（两者的比例（两者的比例为为2:3，0.3-0.4ml/kg）进进行麻醉，剪去兔左眼睫毛，将生理行麻醉，剪去兔左眼睫毛，将生理盐盐水和碘伏按水和碘伏按1:1稀稀释释，充分清洗，充分清洗术术眼眼结结膜囊，再用膜囊，再用生理生理盐盐水清洗，以免碘伏刺激眼表，后用水清洗，以免碘伏刺激眼表，后用0.5%盐盐酸丁卡因滴眼液滴酸丁卡因滴眼液滴术术眼，后用无菌手眼，后用无菌手术术器械将麻醉后的兔子在超器械将麻醉后的兔子在超净净台中操作摘取兔左下泪腺台中操作摘取兔左下泪腺,将泪腺将泪腺转转移到提前配置好的移到提前配置好的装有双抗和装有双抗和Hams液的液的50ml离心管中离心管中。（2）在在细胞胞间超超净台台进行以下操作，将泪腺和少量的行以下操作，将泪腺和少量的Hams液放入培养皿中，先剔液放入培养皿中，先剔除泪腺除泪腺组织周周围的血管、脂肪的血管、脂肪组织和筋膜，无菌刀将腺体切碎至和筋膜，无菌刀将腺体切碎至约1mm1mm的的组织块，用移液，用移液枪加入加入Hanks液后吹打吹散液后吹打吹散组织块，转移到移到50ml离心管中离心管中倾斜静置斜静置15min，弃掉上清。，弃掉上清。（3）然后再加入然后再加入Hams液吹打均匀液吹打均匀倾斜静置斜静置15min，小心弃掉上清，以防，小心弃掉上清，以防组织块的的丢失。失。（4）加入配置好的消化加入配置好的消化酶（胶原（胶原酶，透明，透明质酸酸酶，DNA酶）,磁力磁力搅拌器提前拌器提前设置好置好温度和温度和转速，速，37恒温水浴消化恒温水浴消化10min。兔自身免疫性干眼模型实验方法：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法方法：1、兔泪腺上皮兔泪腺上皮细胞分离、胞分离、纯化、培养化、培养（5）取出后静置取出后静置15min，弃掉上清，加入，弃掉上清，加入10ml Hanks液反复吹打后静置液反复吹打后静置15min，弃，弃掉上清。掉上清。（6）再再加入配置好剩余的消化加入配置好剩余的消化酶酶，37水浴消化水浴消化30min，观观察察组织块组织块的大小，可适的大小，可适当的增减当的增减10min。（7）然后用）然后用Hams液浸液浸润润40m无菌无菌细细胞胞筛筛，将其置于，将其置于50ml离心管上，将稀离心管上，将稀释释后的后的混合液吹打均匀后混合液吹打均匀后过滤过滤，1000rpm离心离心6min，弃上清，弃上清。（8）加入）加入20ml Hanks液吹打均匀，离心液吹打均匀，离心1000rpm，6min，弃上清，加入，弃上清，加入5ml Hams液充分混匀。液充分混匀。（9）提前准）提前准备质量分数量分数为10%的的Ficoll（Sigma Ficoll粉与粉与 Hams液配制），用液配制），用Hams液稀液稀释到到2%、3%、4%，从下到上依次，从下到上依次为4%、3%、2%各各5ml加入加入50ml离心离心管中，将管中，将细胞胞悬液液缓慢加入到慢加入到Ficoll液面上，液面上，进行密度梯度离心，行密度梯度离心，400 rpm离心离心10min，上下加速度，上下加速度为0。兔自身免疫性干眼模型实验方法：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法方法：1、兔泪腺上皮兔泪腺上皮细胞分离、胞分离、纯化、培养化、培养（10）离心后，）离心后，细细胞在最底胞在最底层层。弃上清，用。弃上清，用PBS缓缓冲液洗两遍冲液洗两遍细细胞，洗掉胞，洗掉杂质杂质和和Ficoll，离心，离心结结束尽可能弃干束尽可能弃干净净上清。上清。（11）加入）加入DMEM完全培养基（完全培养基（10%FBS+1%双抗双抗+1%谷氨谷氨酰酰胺胺+DMEM基基础础培养基）培养基），进进行行细细胞胞计计数和数和细细胞活性胞活性观观察，察，细细胞胞计计数后取一定数量数后取一定数量105细细胞于胞于100L PBS内吹内吹打均匀，再加入打均匀，再加入100L的台盼的台盼蓝蓝，显显微微镜镜下下观观察察计计数板上数板上细细胞染色情况，胞染色情况，计录计录未着染未着染的的细细胞百分比。胞百分比。（12）将分离的泪腺上皮）将分离的泪腺上皮细细胞胞1.5105/孔放置孔放置24孔板中于孔板中于37、5%CO2、100%饱饱和和湿度的培养箱中培养。湿度的培养箱中培养。兔自身免疫性干眼模型实验方法：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法方法：2、兔外周血淋巴兔外周血淋巴细胞分离、培养胞分离、培养（1）将新西）将新西兰兰大白兔固定，兔耳中大白兔固定，兔耳中动动脉碘伏消毒后用酒精棉球擦拭使其血管脉碘伏消毒后用酒精棉球擦拭使其血管扩张扩张，用提前准用提前准备备的静脉采血的静脉采血针针和采血管采血，每只兔和采血管采血，每只兔预计预计抽大抽大约约20mL的外周血。的外周血。（2）用提前）用提前预热预热的的37的的PBS缓缓冲液将外周血稀冲液将外周血稀释释3倍后装在倍后装在50mL离心管中（每管离心管中（每管约约30ml）。）。（3）将每管）将每管约约30ml稀稀释释的外周血的外周血缓缓慢加入到慢加入到10mL淋巴淋巴细细胞分离液液面上，离心胞分离液液面上，离心2000 rpm，20min，上下加速度，上下加速度为为0。（4）离心后可）离心后可见见离心管中分三离心管中分三层层，在上、中，在上、中间层间层界面界面处处有一以淋巴有一以淋巴细细胞胞为为主的白色主的白色云云雾雾状狭窄状狭窄带带，这这一一层细层细胞即胞即为为所需要，吸取收集所需要，吸取收集该层该层淋巴淋巴细细胞胞带带放入新的放入新的50mL离离心管中。心管中。（5）加入）加入PBS缓缓冲液，离心冲液，离心2000 rpm，10min,弃上清，再加入弃上清，再加入PBS缓缓冲液离心。冲液离心。兔自身免疫性干眼模型实验方法：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法方法：2、兔外周血淋巴兔外周血淋巴细胞分离、培养胞分离、培养（6）加淋巴）加淋巴细细胞培养基（胞培养基（10%FBS+1%双抗双抗+1%谷氨谷氨酰酰胺胺+RPMI1640培养基培养基+巯巯基基乙醇），乙醇），计计数，数，进进行行细细胞胞计计数和数和细细胞活性胞活性观观察，察，细细胞胞计计数后取一定数量数后取一定数量105细细胞于胞于100LPBS内吹打均匀，再加入内吹打均匀，再加入100L的台盼的台盼蓝蓝，计录计录未着染的未着染的细细胞百分比。胞百分比。（7）分）分别别配制与泪腺上皮配制与泪腺上皮细细胞等密度的胞等密度的细细胞液。胞液。兔自身免疫性干眼模型实验方法：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法方法：3、建立自体建立自体细胞混合培养体系胞混合培养体系5个个/孔），孔），单单独培养独培养2d的泪腺上皮的泪腺上皮细细胞，胞，进进行行线线照射（照射（剂剂量量为为25Gy），使其失去反），使其失去反应应能力，成能力，成为为刺激刺激细细胞。胞。载载有泪腺上皮有泪腺上皮细细胞的胞的24孔板照完射孔板照完射线线后，每孔加入当天分离等数量的外周血淋巴后，每孔加入当天分离等数量的外周血淋巴细细胞胞1.5105个，此个，此时时泪腺上皮泪腺上皮细细胞已胞已贴贴壁，淋巴壁，淋巴细细胞胞为悬为悬浮浮细细胞，加入淋巴胞，加入淋巴细细胞胞时时候小心候小心缓缓慢加入，以防吹起已慢加入，以防吹起已贴贴壁的泪腺上皮壁的泪腺上皮细细胞，建立混合培养体系，培养胞，建立混合培养体系，培养5天。天。兔自身免疫性干眼模型实验方法：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法方法：4、自身免疫干眼模型的制备、自身免疫干眼模型的制备（1）实验实验分分组组：24只只术术前前检查检查合格的雌性新西合格的雌性新西兰兰大白兔，按照随机数表法大白兔，按照随机数表法给给兔子兔子编编号，分号，分为为2组组即正常即正常对对照照组组，干眼模型，干眼模型组组。干眼模型干眼模型组为组为静脉回静脉回输输自体激活的外周血自体激活的外周血淋巴淋巴细细胞胞诱导诱导的兔自身免疫性干眼的兔自身免疫性干眼。正常正常对对照照组为组为静脉回静脉回输输与干眼模型与干眼模型组组等体等体积积的的PBS缓缓冲液冲液。（2）干眼模型的制）干眼模型的制备备：将：将标标注好的雌性新西注好的雌性新西兰兰白兔固定，白兔固定，预预先准先准备备好好输输液器、液器、5ml、10ml针针管、酒精、碘伏，以及管、酒精、碘伏，以及预预先准先准备备好的淋巴好的淋巴细细胞（混合体系混合培养胞（混合体系混合培养5天，天，观观察察发现发现淋巴淋巴细细胞胞较较之前体之前体积变积变大，呈大，呈圆圆形，聚集性分布，周形，聚集性分布，周围围可可见围绕见围绕的泪腺上皮的泪腺上皮细细胞，胞，用用1ml枪头缓枪头缓慢吹起落在底部的淋巴慢吹起落在底部的淋巴细细胞，收集到胞，收集到50ml离心管中，在离心管中，在这这个个过过程中在程中在显显微微镜镜下下观观察察进进来避免吹起来避免吹起贴贴壁的泪腺上皮壁的泪腺上皮细细胞，用胞，用PBS缓缓冲液将冲液将24孔板洗两遍，孔板洗两遍，2000rpm离心离心10min，弃掉上清，再用，弃掉上清，再用PBS缓缓冲液洗一遍，之后加冲液洗一遍，之后加1ml的的PBS缓缓冲液冲液计计数，吹散数，吹散细细胞，尽可能不要有胞，尽可能不要有细细胞胞团块团块避免栓塞避免栓塞发发生的可能，最后按照淋巴生的可能，最后按照淋巴细细胞胞2105每只兔子的数量，每只兔子每只兔子的数量，每只兔子1ml转转移到移到50ml离心管中放在冰上保持离心管中放在冰上保持细细胞活性，胞活性，以以备备使用）。使用）。兔自身免疫性干眼模型实验方法：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法方法：4、自身免疫干眼模型的制备、自身免疫干眼模型的制备釆用静脉釆用静脉输输液器，液器，预预先将先将PBS充充满满整个静脉回整个静脉回输输装置排空空气装置排空空气预预防空气栓塞。通防空气栓塞。通过过耳耳缘缘静脉回静脉回输输激活的自体激活的外周血淋巴激活的自体激活的外周血淋巴细细胞（胞（2x106/ml，1ml）为为干眼模型干眼模型组组，耳耳缘缘静脉碘伏消毒后用静脉碘伏消毒后用2ml的注射器推注的注射器推注1mLPBS确保液体确保液体进进入静脉血管中，然后在接入静脉血管中，然后在接头处换头处换成有成有细细胞液的注射器，注射前保胞液的注射器，注射前保证证无无细细胞沉淀以防栓塞，匀速推注，最后胞沉淀以防栓塞，匀速推注，最后换换成成装有装有PBS的注射器，再的注射器，再输输入入1ml左右的左右的PBS保保证细证细胞完全胞完全进进入到血管中，以防入到血管中，以防细细胞胞丢丢失。静脉回失。静脉回输输等量等量PBS的新西的新西兰兰白兔白兔为对为对照照组组。兔自身免疫性干眼模型实验方法：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型临床指床指标的的检测：移植前和移植后移植前和移植后2周、周、4 周、周、6 周分周分别进别进行以下行以下临临床指床指标标的的观观察：察：泪液分泌量泪液分泌量实验实验（Schirmers实验实验）将兔子固定好，在非表麻条件下，将将兔子固定好，在非表麻条件下，将 Schirmers 试纸试纸条条顶顶端放置于下穹窿端放置于下穹窿结结膜膜中外中外侧侧1/3处处，检查检查者者辅辅助助闭闭合兔眼，此合兔眼，此时时尽量避免兔子第三眼尽量避免兔子第三眼睑睑遮住角膜以及遮住角膜以及试纸试纸条，条，计时计时1分分钟钟后取出后取出试纸试纸条，条，记录记录湿湿润长润长度，度，试验过试验过程中尽量避免程中尽量避免试纸试纸条条接触角膜，以免造成角膜上皮接触角膜，以免造成角膜上皮损伤损伤。泪膜泪膜稳稳定性定性实验实验（泪膜破裂（泪膜破裂时间时间tear break-up time，BUT）将兔子固定好，眼表滴将兔子固定好，眼表滴10L荧荧光素液，光素液，检查检查者者辅辅助兔眨眼助兔眨眼 3 次，次，计时计时1分分钟钟，检检查查者者辅辅助打开上下眼助打开上下眼睑睑，检查检查者用手持裂隙灯，在者用手持裂隙灯，在钴蓝钴蓝光下光下观观察角膜表面泪膜破察角膜表面泪膜破裂裂时间时间以及泪河高度，重复三次取平均以及泪河高度，重复三次取平均值值。角膜、角膜、结结膜膜荧荧光素光素钠钠染色染色实验实验将兔子固定好，复方托比卡按散瞳，等待大将兔子固定好，复方托比卡按散瞳，等待大约约十分十分钟钟，等其瞳孔完全散开后，眼，等其瞳孔完全散开后，眼表滴表滴10L荧荧光素液，光素液，计时计时1分分钟钟，使，使荧荧光素液均匀平光素液均匀平铺铺于眼表，于眼表，检查检查者者辅辅助打开助打开上下眼上下眼睑，将裂隙灯下，将裂隙灯下调至至钴蓝光，光，观察角膜、察角膜、结膜的着染情况并拍照膜的着染情况并拍照记录。兔自身免疫性干眼模型临床指标的检测：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型组织病理学病理学观察察：分分别于移植后于移植后6周从各周从各组中新西中新西兰大白兔注射戊巴比妥大白兔注射戊巴比妥钠（56mg/kg）处死兔子，分死兔子，分离上下泪腺、离上下泪腺、结膜、角膜置于膜、角膜置于10%甲甲醛溶液中固定，常溶液中固定，常规石蜡包埋，石蜡包埋，HE染色后染色后观察浸察浸润细胞的情况。胞的情况。（1）取泪腺、）取泪腺、结膜等膜等组织块，用，用 10%甲甲醛溶液固定，固定后常溶液固定，固定后常规石蜡包埋，切片。石蜡包埋，切片。（2）石蜡包埋切片后用二甲苯脱蜡，二甲苯）石蜡包埋切片后用二甲苯脱蜡，二甲苯I、二甲苯、二甲苯各各5min，100乙醇、乙醇、2min，95的乙醇、的乙醇、1min，80乙醇、乙醇、75的乙醇各的乙醇各1min，蒸，蒸馏水洗水洗2min。（3）苏木素染色木素染色5min后冲洗。后冲洗。（4）1%盐酸乙醇浸泡酸乙醇浸泡30s（数下）。（数下）。（5）自来水浸泡）自来水浸泡15min。（6）伊）伊红液染色液染色2min。（7）常）常规脱水，脱水，95乙醇乙醇I、1min，95乙醇乙醇、1min，100乙醇乙醇I、1min，100乙醇乙醇、1min，二甲苯石碳酸（，二甲苯石碳酸（3：1）1min，二甲苯透明，二甲苯，二甲苯透明，二甲苯I、1min，二甲，二甲苯苯、1min。（8）中性）中性树脂封片固定。脂封片固定。兔自身免疫性干眼模型组织病理学观察：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型泪腺泪腺组织RNA的提取的提取：（1）分）分别于移植后于移植后6周将各周将各组中新西中新西兰大白兔注射戊巴比妥大白兔注射戊巴比妥钠（56mg/kg）处死兔子，死兔子，收集上、下泪腺、收集上、下泪腺、结膜、角膜膜、角膜组织，将泪腺，将泪腺组织剪至剪至1cm的的组织块装于装于1.5mlEP管中，管中，迅速放于液氮后迅速放于液氮后转移到移到-80的冰箱中。的冰箱中。（2）将所提）将所提RNA组织找到放到液氮瓶中，找到放到液氮瓶中，现将研将研钵和研棒提前一天和研棒提前一天84液浸泡，提前液浸泡，提前2小小时18.2纯水浸泡，用水浸泡，用卫生生纸擦干后先用液氮降温，待研擦干后先用液氮降温，待研钵中的液氮中的液氮稳定后，将定后，将组织块在液氮中研磨，保在液氮中研磨，保证充足的液氮，将充足的液氮，将组织块研磨成粉末后，加入研磨成粉末后，加入1ml的的Trizol后后转移移到到1.5ml的的EP管中，充分吹打。管中，充分吹打。（3）再按每）再按每1mlTrizol加入加入0.2ml比例的比例的氯仿，盖仿，盖紧盖子，用力上下盖子，用力上下剧烈烈摇晃晃15秒，秒，呈粉色混合物。呈粉色混合物。（4）常温静置）常温静置15min，4离心机离心机12000rpm 离心离心15min，离心后可，离心后可见EP管内分管内分为三三层，最上，最上层为上清液，中上清液，中间一一层为白色膜状物，最底白色膜状物，最底层为红色沉淀物。色沉淀物。（5）将上清）将上清转移至另一新的移至另一新的标记好的好的1.5mL进口口EP管中，再加入等体管中，再加入等体积的异丙醇，的异丙醇，室温静置室温静置10min，4 离心机离心机12000rpm离心离心10min。兔自身免疫性干眼模型泪腺组织RNA的提取：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型泪腺泪腺组织RNA的提取的提取：（6）弃掉上清，加入）弃掉上清，加入1ml的的75%乙醇（提前配置：乙醇（提前配置：750uL无水乙醇无水乙醇+250uL DEPC水）水），倒置上下，倒置上下摇晃几次，晃几次，4 离心机离心机10000rpm 离心离心5min。（7）观察管底，避免察管底，避免枪头碰到管底，弃掉上清，打开管盖干燥碰到管底，弃掉上清，打开管盖干燥10min。（8）随后将）随后将RNA溶于溶于20uL的的DEPC水中，置于冰上，混匀后取水中，置于冰上，混匀后取1L在在NanoDrop ND-100上上测RNA浓度，度，测三次，取其均三次，取其均值，记录标注好并将注好并将RNA-保存在保存在80冰箱中。冰箱中。兔自身免疫性干眼模型泪腺组织RNA的提取：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型泪腺泪腺组织RNA逆转录逆转录：（1）将保存于）将保存于-80的所需的的所需的RNA置于冰上待其溶解，根据置于冰上待其溶解，根据标注好所注好所测的的浓度按照度按照1gRNA，20l体系逆体系逆转录，计算出不同算出不同RNA所加的体所加的体积。（2）先将）先将RNA所在所在EP管管涡旋离心，将旋离心，将标记好的好的EP管分管分别加入加入计算好体算好体积的的RNA，Oligo(dT)1l,DEPC水水补到到12l，涡旋离心后置于冰上待用。旋离心后置于冰上待用。（3）用）用Thermo PCR仪，提前，提前设置好温度置好温度时间，待，待PCR仪机器盖子温度升高后放入机器盖子温度升高后放入样本，本，65 5min。（4）取出）取出样本置于冰上，每个本置于冰上，每个样本按本按顺序加入序加入 5Reaction buffer 4l Inhibitor 1l Transcriptase 1l 10MmdNTP Mix 2l（5）涡旋离心混匀后，待旋离心混匀后，待PCR仪机器盖子温度升高到机器盖子温度升高到40后放入各后放入各样本，本，42 60分分钟，70 5分分钟，待反，待反应结束后即束后即EP管中的管中的为逆逆转录生成的生成的cDNA，将其逆，将其逆转录产物物cDNA置于冰上，然后用置于冰上，然后用DEPC水稀水稀释10倍，倍，涡旋离心混匀后置于旋离心混匀后置于-80冰箱保存。冰箱保存。兔自身免疫性干眼模型泪腺组织RNA逆转录：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实时定量定量PCR（quantitative real-time PCR）RT-PCR：反反应原理原理:使用美国使用美国Applied Biosystems公司的公司的实时荧光定量聚合光定量聚合酶链反反应（PCR）仪分析分析应用用 Applied Biosystems 7900HT FastReal-time PCR System，SYBR Green 法，使用法，使用 Fast SYBRGreen Master Mix。在。在PCR反反应过程中程中SYBRGreen荧光染料光染料掺入入DNA双双链后后发射射荧光信号，而不光信号，而不掺入入DNA双双链的的SYBR荧光染料不会有光染料不会有荧光信号，所以光信号，所以SYBR Green荧光信号与光信号与DNA扩增增产物的增加一致。双物的增加一致。双链DNA在在变性性过程中解开呈程中解开呈单链，没有，没有荧光光,在形成双在形成双链DNA的复性和延伸的复性和延伸过程中程中,SYBR Green发出出荧光，此光，此阶段段PCR仪器釆集器釆集荧光信号。利用此信号的光信号。利用此信号的变化化对PCR扩增反增反应中中扩增增产物物扩增量的增量的变化化进行行检测，用循，用循环数数对基因定量分析。基因定量分析。GAPDH将作将作为反反应内在参照内在参照,用内参用内参对所所检测样品所含的品所含的DNA进行定量分析的方法。相行定量分析的方法。相对定量定量结果分析采用比果分析采用比较荧光光强度达度达阈值时的循的循环数数(Ct)值法（法（2-Ct法），法），扩增的倍数增的倍数=2-Ct，Ct=（Ct目的基因目的基因-Ct内参）内参）实验组-（Ct目的基因目的基因-Ct内参）内参）对照照组。各指。各指标均重复均重复检测3次，次，取平均取平均值。本。本实验通通过实时定量定量PCR检测泪腺泪腺组织中中Th1、Th17、Treg细胞分化相关胞分化相关细胞因子及胞因子及转录因子因子mRNA相相对表达量。表达量。兔自身免疫性干眼模型实时定量PCR（quantitative兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实时定量定量PCR（quantitative real-time PCR）RT-PCR：所所测基因上下游引物序列如下：基因上下游引物序列如下：GAPDH Forward primer GGGTGGTGGACCTCATGGT Reverse primer CGGTGGTTTGAGGGCTCTTAIFN-Forward primer CTCTGCCTCATCTTGGGTTCTT Reverse primer GGTGTTCTGTTTCTCTGGTTAGTGTGTIL-10 Forward primer GGCTGAGGCTGCGACAAT Reverse primer TGCCTTGCTCTTGTTTTCACATGF-Forward primer CAAGGACCTGGGCTGGAA Reverse primer AGGCAGAAGTTGGCGTGGTAIL-6 Forward primer GCAGAAAAACCAGTGGCTGAA Reverse primer GGCCGCGCAGGATGAIL-17 Forward primer GGAATGAGGACCACCACATGA Reverse primer CTGCGTAGGACCAGGATCTCTTTNF-Forward primer AGCTTCTCGGGCCCTGAGT Reverse primer CCACTTGCGGGTTTGCTACTT-bet Forward primer GATGCGCCAGGAAGTTTCA Reverse primer TGTTGGAGGCCCCTTTATTGRORrt Forward primer GGCCTACCACGCCGA Reverse primer TCCATGCCACCGTATTTGC兔自身免疫性干眼模型实时定量PCR（quantitative兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实时定量定量PCR（quantitative real-time PCR）RT-PCR：（1）从）从-20冰箱中取出引物，置于冰上待其完全溶解，先配置冰箱中取出引物，置于冰上待其完全溶解，先配置100uM浓度的，混合度的，混合均匀，随后分装稀均匀，随后分装稀释到到4uM浓度的引物。度的引物。（2）从）从-20冰箱中取出冰箱中取出FastSYBR Green Master Mix，置于冰上避光待其完全溶解，置于冰上避光待其完全溶解待用。待用。（3）从）从-80 冰箱中取出冰箱中取出cDNA置于冰上待其完全溶解，溶解后混均匀。置于冰上待其完全溶解，溶解后混均匀。（4）8ul反反应体系包括体系包括:SYBR Green 4ul 上游引物（上游引物（4uM）lul 下游引物（下游引物（4uM）lul cDNA 2ul提前配置好提前配置好SYBR Green和上下游引物的混合液，和上下游引物的混合液，计算好所需的算好所需的cDNA的量，的量，384孔板中孔板中每孔先加入每孔先加入SYBR Green和上下游引物的混合液，再根据和上下游引物的混合液，再根据样本所本所检测加入加入cDNA。兔自身免疫性干眼模型实时定量PCR（quantitative兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实时定量定量PCR（quantitative real-time PCR）RT-PCR：（5）配制混合液和）配制混合液和384孔板的上孔板的上样操作操作过程均需避光程均需避光进行，加行，加样结束后，束后，384孔板封孔板封膜。膜。（6）先将）先将384孔板置于孔板置于祸旋器旋器涡旋旋lO秒，使其反秒，使其反应体系充分混合均匀。体系充分混合均匀。（7）提前）提前预冷离心机，再将冷离心机，再将384孔板置于离心机孔板置于离心机4000rpm，4min离心。离心。（8）再将）再将384孔板放入孔板放入Applied Biosystems 7900HT Fast Rea1-Time PCR 仪,做好做好标记,设好参数开始，好参数开始，50 2min,95 10min,40个循个循环，循，循环条件条件为95C,15s,60 1min。（9）结束后保存数据，分析束后保存数据，分析结果。果。兔自身免疫性干眼模型实时定量PCR（quantitative兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型流式流式细细胞胞检测检测 Treg 细细胞胞：泪腺组织流式细胞学检测泪腺组织流式细胞学检测（1）新西）新西兰兰大白兔用大白兔用陆陆眠宁和眠宁和氯氯胺胺酮酮麻醉后，空气栓塞麻醉后，空气栓塞处处死兔子，新西死兔子，新西兰兰大白兔大白兔处处死后，在超死后，在超净净台中摘取右下下泪腺，台中摘取右下下泪腺，转转移到含有双抗的移到含有双抗的 Hams 液的液的 50ml离心管中。离心管中。（2）在）在细细胞胞间间超超净净台台进进行以下操作，将泪腺和少量的行以下操作，将泪腺和少量的Hams液放入培养皿中，先剔除泪腺液放入培养皿中，先剔除泪腺组织组织周周围围的血管、脂肪的血管、脂肪组织组织和筋膜，无菌刀将腺体切碎至和筋膜，无菌刀将腺体切碎至约约1mm1mm的的组织块组织块，用移液，用移液枪枪加入加入Hanks液后吹打吹散液后吹打吹散组织块组织块，在，在50ml离心管中离心管中倾倾斜静置斜静置15min，弃掉上清。，弃掉上清。（3）然后再加入）然后再加入Hams液吹打均匀液吹打均匀倾倾斜静置斜静置15min，小心弃掉上清，以防，小心弃掉上清，以防组织块组织块的的丢丢失。失。（4）提前配制好胶原）提前配制好胶原酶酶消化液，将消化液，将浓浓度度为为 600U/ml 的胶原的胶原酶酶加入到泪腺加入到泪腺组织块组织块中中,其置于其置于 37水浴箱，水浴箱，（5）离心管置于水浴箱中，）离心管置于水浴箱中，约约 20min 摇摇晃离心管数二三十次，使晃离心管数二三十次，使组织块组织块充分接触消化充分接触消化酶酶，观观察察组织块组织块的大小，消化的大小，消化 3h 左右。左右。（6）将）将组织块消化的混合液加消化的混合液加 Hams 液稀液稀释，用，用 40um 的的细胞胞滤过筛过滤，过滤掉其余掉其余杂质。兔自身免疫性干眼模型流式细胞检测 Treg 细胞：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型流式流式细细胞胞检测检测 Treg 细细胞胞：泪腺组织流式细胞学检测泪腺组织流式细胞学检测（7）将）将细细胞消化液离心胞消化液离心 2000rpm,6min，离心后弃上清，用，离心后弃上清，用 PBS 缓缓冲液重冲液重悬悬后再次离心，后再次离心，2000rpm,6min，随后在倒置，随后在倒置显显微微镜镜下下观观察察细细胞形胞形态态。（8）同）同样样在在观观察察细细胞形胞形态态和和纯纯度的同度的同时进时进行行细细胞胞计计数，数，调调整整细细胞的密度，取各胞的密度，取各组组数量相等的数量相等的细细胞于流式管中胞于流式管中,离心离心 2000rpm,6min。（9）弃掉上清，每管加入）弃掉上清，每管加入 600ul 固定液，吹打均匀，固定液，吹打均匀，4C 冰箱避光保存冰箱避光保存过过夜，夜，细细胞固定打孔。胞固定打孔。（10）次日各流式管中加入）次日各流式管中加入 600ul 缓缓冲液冲液,离心离心 1500rpm,lOmin，弃上清，重复再洗一遍。，弃上清，重复再洗一遍。（11）弃上清）弃上清,每孔加入每孔加入 50ul 缓缓冲液冲液,FITC-anti Rabbit-CD4,PE-antihmnan-F0XP3各加入各加入 1ul 进进行染色，行染色，涡涡旋后，避光放入旋后，避光放入 4C 冰箱。冰箱。（13）弃上清加入）弃上清加入 600ul 缓缓冲液，离心冲液，离心 1500rpm,lOmin，弃上清加入，弃上清加入缓缓冲液冲液1500rpm,lOmin 再再次离心后。次离心后。（14）弃掉上清，用）弃掉上清，用 lOOul 缓缓冲液重冲液重悬悬，涡涡旋后上美国旋后上美国 BD 公司公司 FACS 流式流式细细胞胞仪仪上机上机检测检测。兔自身免疫性干眼模型流式细胞检测 Treg 细胞：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型流式流式细细胞胞检测检测 Treg 细细胞胞：脾脏脾脏组织流式细胞学检测组织流式细胞学检测（1）陆陆眠宁和眠宁和氯氯胺胺酮酮将兔子麻醉后，空气栓塞将兔子麻醉后，空气栓塞处处死兔子。腹部死兔子。腹部备备皮皮,并用清并用清洁洁消毒消毒铺铺巾。在超巾。在超净净台中用手台中用手术术刀打开腹腔，找到胃，并向后翻，找到脾刀打开腹腔，找到胃，并向后翻，找到脾脏组织脏组织并分离，先置并分离，先置于有双抗的于有双抗的 RPMI-1640 培养基的培养基的 50ml 离心管中。离心管中。（2）进进入入细细胞超胞超净净台，提前准台，提前准备备好好 lOOmm 细细胞培养皿，将取出的脾胞培养皿，将取出的脾脏脏和少量的和少量的 RPMI-1640 培养基一起放入培养皿中培养基一起放入培养皿中,用用 400 目的目的滤滤网碾磨。研磨完全。网碾磨。研磨完全。（3）先用培养基将固定好的棉花柱）先用培养基将固定好的棉花柱(20ml)浸浸润润湿，将吹打均匀的湿，将吹打均匀的组织悬组织悬液液过过棉花柱，棉花柱，过滤过滤到棉花柱正下方的到棉花柱正下方的 50ml 离心管中离心管中,离心离心,2000rpm,8min。（4）弃上清，用）弃上清，用 20ml 培养基重培养基重悬细悬细胞胞,吹打均匀后吹打均匀后缓缓缓缓将将细细胞胞悬悬液加入到等体液加入到等体积积的的 20ml Ficoll 液面上液面上,离心离心 2000rpm,20min，上下加速度，上下加速度为为 0。（5）离心后离心管中分三）离心后离心管中分三层层，同分离外周血淋巴，同分离外周血淋巴细细胞，吸取中胞，吸取中间层间层白色白色雾雾状的淋巴状的淋巴细细胞，离心胞，离心 2000rpm,8min，弃上清再洗一遍。，弃上清再洗一遍。（6）倒置）倒置显显微微镜镜下下观观察察细细胞形胞形态态和和纯纯度的同度的同时进时进行行细细胞胞计计数，数，调调整整细细胞的密度，取胞的密度，取各各组组数量相等的数量相等的细细胞于流式管中胞于流式管中,离心离心 2000rpm,6min。兔自身免疫性干眼模型流式细胞检测 Treg 细胞：兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型流式流式细细胞胞检测检测 Treg 细细胞胞：脾脏脾脏组织流式细胞学检测组织流式细胞学检测（7）弃掉上清，每管加入）弃掉上清，每管加入 600ul 固定液，吹打均匀，固定液，吹打均匀，4C 冰箱避光保存冰箱避光保存过过夜，夜，细细胞胞固定打孔。固定打孔。（8）次日各流式管中加入）次日各流式管中加入 600ul 缓缓冲液冲液,离心离心 1500rpm，10min，弃上清，重复再，弃上清，重复再洗一遍。洗一遍。（9）弃上清）弃上清,每孔加入每孔加入 50ul 缓缓冲液冲液,FITC-anti Rabbit-CD4,PE-antihmnan-F0XP3各加入各加入 1ul 进进行染色，行染色，涡涡旋后，避光放入旋后，避光放入 4C 冰箱孵育冰箱孵育 1 小小时时。（10）从）从 4冰箱取出后，离心冰箱取出后，离心 1500rpm,10min，（11）弃上清加入）弃上清加入 600ul 缓缓冲液，离心冲液，离心 1500rpm，10min，弃上清加入，弃上清加入缓缓冲液冲液1500rpm,lOmin 再次离心后。再次离心后。（12）弃掉上清，用）弃掉上清，用 l00ul 缓缓冲液重冲液重悬悬，涡涡旋后上美国旋后上美国 BD 公司公司 FACS 流式流式细细胞胞仪仪上机上机检测检测。兔自身免疫性干眼模型流式细胞检测 Treg 细胞：Thank You!谢谢谢谢