免疫细胞的分离及检测课件

第十章第十章 免疫细胞的分离和功能检测免疫细胞的分离和功能检测 1第十章 免疫细胞的分离和功能检测 1目录目录 第一节第一节 吞噬细胞的分离和收集吞噬细胞的分离和收集第二节第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化外周血单个核细胞的分离和纯化第三节第三节 淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离2目录 第一节 吞噬细胞的分离和收集2免疫细胞的分离及检测免疫细胞的分离及检测检测检测:各类免疫细胞及其亚群的数量和各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定功能测定方法：方法：体外法为主体外法为主目的：目的：判断机体免疫状态判断机体免疫状态意义：意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效免疫细胞的分离免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来细胞从血液或组织中分离出来 3免疫细胞的分离及检测检测:各类免疫细胞及其亚群的数量和功能免疫细胞种类4免疫细胞种类4 大吞噬细胞大吞噬细胞:即单核即单核-吞噬细胞系统吞噬细胞系统 小吞噬细胞小吞噬细胞:即中性粒细胞即中性粒细胞第一节第一节 吞噬细胞的分离和收集吞噬细胞的分离和收集吞噬细胞的种类吞噬细胞的种类5 大吞噬细胞:即单核-吞噬细胞系统第一节 吞噬细胞的特征性标志特征性标志 CD14CD14分离技术分离技术PecollPecoll密度梯度分离法密度梯度分离法流式细胞仪分离技术流式细胞仪分离技术免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法:为目前较常用的方法为目前较常用的方法 黏附法黏附法一、吞噬细胞的分离一、吞噬细胞的分离（一）单核细胞的分离6特征性标志 CD14一、吞噬细胞的分离（一）单核细胞的分离免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法 7免疫磁珠分离法 7斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取 （二）巨噬细胞的分离（二）巨噬细胞的分离8斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞（二）巨噬细胞的分离8聚合物加速沉降法聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞可从外周血中分离出白细胞RBC血血浆(抗凝血抗凝血)WBCRBC FicollFicoll分离法分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞（三）中性粒细胞的分离（三）中性粒细胞的分离9聚合物加速沉降法RBC血浆(抗凝血)WBCRBC FicolFicoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞密度梯度离心分离中性粒细胞10Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞10吞噬细胞的吞噬活动大体分为吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化趋化、吞噬吞噬和和胞内杀灭胞内杀灭作作用三个阶段用三个阶段,据此建立相应的检测方法。据此建立相应的检测方法。（一）中性粒细胞功能检测技术（一）中性粒细胞功能检测技术 （二）巨噬细胞功能检测技术（二）巨噬细胞功能检测技术二、相关功能检测二、相关功能检测11吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段,细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测吞噬功能的检测吞噬功能的检测杀菌功能的检测杀菌功能的检测（一）中性粒细胞功能检测（一）中性粒细胞功能检测12细胞趋化功能的检测（一）中性粒细胞功能检测12体内试验法体内试验法:皮肤窗法皮肤窗法体外试验法：滤膜渗透法体外试验法：滤膜渗透法 琼脂糖平板法琼脂糖平板法 趋化功能检测趋化功能检测检测细胞运动功能检测细胞运动功能皮肤窗法皮肤窗法 在在受检者前臂屈侧中央受检者前臂屈侧中央3 3范围内范围内,搔刮搔刮皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2 2，5 5，8 8，1212，2424，3636小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开始时间、聚集程度等。健康正常人一般始时间、聚集程度等。健康正常人一般2 23h3h后开始后开始聚集，达聚集，达5050100100个，个，6 6小时可达小时可达10001000个以上个以上。13体内试验法:皮肤窗法趋化功能检测检测细胞运动功能皮肤窗法 原理及技术要点原理及技术要点 在一特制的分上下两层的小盒在一特制的分上下两层的小盒,将趋化因子加入下将趋化因子加入下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分隔，室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分隔，3737温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室趋化因子的温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、固定、吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿越滤膜的干燥、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋化功能。移动距离，从而判断其趋化功能。滤膜渗透法滤膜渗透法14 原理及技术要点滤膜渗透法14原理及技术要点原理及技术要点 在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液,左孔加趋左孔加趋化因子，右孔加对照液，温育化因子，右孔加对照液，温育48小时后，用显微小时后，用显微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离A和向和向右孔的移动距离右孔的移动距离B，计算趋化指数。，计算趋化指数。趋化指数趋化指数=A/B趋化指数越大趋化指数越大,表明中性粒细胞运动功能越强表明中性粒细胞运动功能越强 琼脂糖平板法琼脂糖平板法15原理及技术要点趋化指数=A/B琼脂糖平板法15显微镜检查法显微镜检查法 吞噬指数=（一）中性粒细胞吞噬功能检测（一）中性粒细胞吞噬功能检测16显微镜检查法吞噬指数=（一）中性粒细胞吞噬功能检测16NBTNBT还原试验还原试验 原理原理:N-N-C +H+N=N-R-N-NH2C N=NH四氮唑基（淡黄色）四氮唑基（淡黄色）甲甲chan（紫黑色）（紫黑色）杀菌功能检测杀菌功能检测17NBT还原试验原理:N-N-N-NH2四氮唑基（淡黄色）甲c 方法方法:1.1.抗凝血抗凝血 +硝基蓝四氮唑（硝基蓝四氮唑（NBTNBT）,37,37孵育孵育25min25min。2.2.推片染色、镜检。推片染色、镜检。正常值正常值:NBTNBT阳性细胞率应阳性细胞率应95%95%NBT还原试验还原试验18 方法:1.抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT）,37孵炭粒廓清试验炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除9090炭粒炭粒,脾巨噬脾巨噬细胞约吞噬清除细胞约吞噬清除1010炭粒。据此给小鼠静脉注射定量炭粒。据此给小鼠静脉注射定量印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血，印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。判断巨噬细胞的功能。（二）巨噬细胞功能检测（二）巨噬细胞功能检测19炭粒廓清试验（二）巨噬细胞功能检测19M+CRBCM+CRBC孵育孵育涂片、染色、镜检涂片、染色、镜检计算、吞噬率、吞噬指数计算、吞噬率、吞噬指数吞噬率（吞噬吞噬率（吞噬CRBCCRBC的的M 数数/计数的计数的M 数）数）100100吞噬指数吞噬指数 M吞噬的CRBCCRBC总数总数/计数的计数的M 数数吞噬功能检测吞噬功能检测返回章目录返回章目录20M+CRBC孵育涂片、染色、镜检计算、吞噬率、吞噬指数吞PBMCPBMC包括包括:淋巴细胞、单核细胞淋巴细胞、单核细胞各种血细胞比重不同各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分利用密度梯度离心进行分离离常用分层液：常用分层液：ficollhypaque,percoll第二节第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化外周血单个核细胞的分离和纯化21PBMC包括:淋巴细胞、单核细胞第二节 外周血单个核细胞的细胞细胞比重比重血小板血小板1.0301.035PBMC1.0751.090多核白细胞多核白细胞1.092红细胞红细胞1.093外周血各细胞成分的密度22细胞比重血小板1.0301.035PBMC1.0751.Ficoll分离液法分离液法是一种单次差速密度梯度离心的分是一种单次差速密度梯度离心的分离法离法,主要用于分离外周血中的单个核细胞。主要用于分离外周血中的单个核细胞。原理原理:Ficoll分层液：密度分层液：密度1.0770.0011.0770.001离心：密度梯度离心离心：密度梯度离心分离：各类细胞按其相应密度重新分布分离：各类细胞按其相应密度重新分布一、一、Ficoll分离法分离法23 Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心Ficoll分层液分离单个核细胞示意图24Ficoll分层液分离单个核细胞示意图247898Percoll分离单个核细胞示意图返回章目录返回章目录257898Percoll分离单个核细胞示意图返回章目录25红细胞的去除红细胞的去除:低渗裂解法、氯化铵裂解法低渗裂解法、氯化铵裂解法 血小板的去除血小板的去除 ：胎牛血清梯度离心法：胎牛血清梯度离心法单核细胞的去除：黏附法单核细胞的去除：黏附法 羰基铁吞噬法（磁铁吸引法）羰基铁吞噬法（磁铁吸引法）苯丙氨酸甲酯去除法苯丙氨酸甲酯去除法 第三节第三节 淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离一、淋巴细胞的纯化一、淋巴细胞的纯化26红细胞的去除:低渗裂解法、氯化铵裂解法 第三节 淋巴细胞免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法流式细胞术分离法流式细胞术分离法 其他方法其他方法二、淋巴细胞亚群的分离二、淋巴细胞亚群的分离27免疫磁珠分离法二、淋巴细胞亚群的分离27 原理原理 将针对淋巴细胞特殊表面标志的某种特异性单克将针对淋巴细胞特殊表面标志的某种特异性单克隆抗体与磁珠结合形成隆抗体与磁珠结合形成免疫磁珠（免疫磁珠（IMBIMB）,当特异性单当特异性单克隆抗体与表达相应抗原的靶细胞结合，利用磁场可克隆抗体与表达相应抗原的靶细胞结合，利用磁场可以将以将IMBIMB所结合细胞与其他细胞分离。包被磁珠的抗所结合细胞与其他细胞分离。包被磁珠的抗体可以是第一抗体或第二抗体。体可以是第一抗体或第二抗体。免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法28 原理 免疫磁珠分离法28免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法29免疫磁珠分离法29488 nm 激光激光+-前向散射光前向散射光检测器检测器 荧光检测器荧光检测器电磁场电磁场单个细胞被分类单个细胞被分类进入检测管进入检测管流流式式细细胞胞术术分分离离原原理理示示意意图图30488 nm 激光+-前向散射光荧光检测器电磁场单个细胞被分E花环沉降法花环沉降法31E花环沉降法31T T细胞功能检测细胞功能检测B B细胞功能检测细胞功能检测NKNK细胞功能检测细胞功能检测三、相关功能检测三、相关功能检测32T细胞功能检测三、相关功能检测32T T细胞增殖试验细胞增殖试验T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验 MHC-MHC-肽四聚体技术肽四聚体技术 淋巴细胞内细胞因子检测淋巴细胞内细胞因子检测 T细胞功能检测细胞功能检测33T细胞增殖试验T细胞功能检测33淋巴细胞淋巴细胞DNADNA合成合成分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验34淋巴细胞DNA合成分化母细胞刺激物细胞变大T淋巴细胞增殖试验非特异性刺激物非特异性刺激物:PHA -TPHA -T细胞细胞 ConA-TConA-T细胞细胞 PWM -TPWM -T、B B细胞细胞 LPS -BLPS -B细胞细胞特异性刺激物：特异性刺激物：异种抗原异种抗原 同种组织抗原同种组织抗原淋巴细胞转化的刺激物淋巴细胞转化的刺激物35非特异性刺激物:淋巴细胞转化的刺激物35形态学检查法形态学检查法 3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法 MTTMTT比色法比色法 淋巴细胞转化的检测方法淋巴细胞转化的检测方法36形态学检查法 淋巴细胞转化的检测方法36形态学检查法形态学检查法37形态学检查法37 转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞 过渡型过渡型细胞大小细胞大小(直径直径m)m)12122020121216166 68 8核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、1 14 4个个有或无有或无无无有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无胞质、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征38 转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞 原理原理:刺激物刺激物3756hG1期期 S1期期 合成合成DNADNA 3H-TdR3716hDNA-3H-TdR测淋巴细胞内放射量（测淋巴细胞内放射量（cpmcpm）计算计算SISI判断淋巴细胞转化程度判断淋巴细胞转化程度外周血（外周血（T T）G G0 0期期3H-TdR掺入法掺入法39原理:刺激物3756hG1期 S1期 合成DNA 3H评价评价:该方法敏感性高、客观性强、重复性该方法敏感性高、客观性强、重复性好、可自动操作好、可自动操作;设备昂贵、放射污染设备昂贵、放射污染。刺激指数（刺激指数（stimulating index,SI stimulating index,SI）SI=SI=试验管试验管cpmcpm均值均值/对照管对照管cpmcpm均值均值3H-TdR掺入法掺入法40评价:该方法敏感性高、客观性强、重复性好、可自动操作;设备昂原理原理:外周血外周血T T细胞细胞 PHA发生增殖发生增殖 MTT含蓝色甲颗粒含蓝色甲颗粒 的的T T细胞细胞 MTT PHA 有机溶剂有机溶剂测吸光度（测吸光度（A A）值）值 计算计算SISI判定细胞增殖结果判定细胞增殖结果SI=(SI2(SI2具有意义具有意义)MTT比色法比色法41原理:外周血T细胞 PHA发生增殖 MTT含蓝色甲颗粒 原理原理:靶细胞抗原靶细胞抗原T T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTLCTL靶细胞靶细胞（三）（三）T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验42原理:靶细胞抗原T细胞观察杀伤活力致敏CTL靶细胞（三）T细 试验方法试验方法:同位素法同位素法 淋巴细胞（淋巴细胞（CTLCTL）+含含51Cr 51Cr 的肿瘤细胞的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏肿瘤细胞破坏 51Cr 51Cr 释放释放 测定测定射射线线51Cr特异释放率=100%（三）（三）T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验43 试验方法:同位素法 51Cr特异（三）（三）T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验背景无效应细胞背景无效应细胞效应细胞效应细胞/靶细胞靶细胞 1:1效应细胞效应细胞/靶细胞靶细胞 5:1效应细胞效应细胞/靶细胞靶细胞 20:1细胞溶解细胞溶解44（三）T细胞介导的细胞毒试验背景无效应细胞效应细胞/靶细胞 MHC-肽四聚体技术肽四聚体技术原理原理 根据根据T细胞活化的双识别原理细胞活化的双识别原理,用生物工程用生物工程技术将技术将MHC分子在体外组装，并结合抗原表位肽，分子在体外组装，并结合抗原表位肽，形成抗原肽形成抗原肽-MHC分子复合物，结合流式细胞仪分子复合物，结合流式细胞仪定量检测抗原特异性定量检测抗原特异性T细胞。细胞。T45MHC-肽四聚体技术原理 根据T细胞活化的双识别原理,用技术要点技术要点:1.1.在体外将特异性抗原肽段、可溶性在体外将特异性抗原肽段、可溶性MHCIMHCI类类分子重链及分子重链及2 2微球蛋白正确折叠微球蛋白正确折叠,形成形成MHC-MHC-抗原肽复合物，并纯化该复合物。抗原肽复合物，并纯化该复合物。2.2.用生物素标记用生物素标记MHC-MHC-抗原肽复合物。抗原肽复合物。3.3.生物素标记的生物素标记的MHC-MHC-抗原肽复合物与荧光标抗原肽复合物与荧光标记的亲和素以记的亲和素以4:14:1的比例相混合，即得到荧的比例相混合，即得到荧光标记的四聚体光标记的四聚体 MHC-肽四聚体技术46技术要点:MHC-肽四聚体技术46MHC-肽四聚体技术47MHC-肽四聚体技术47原理原理:用刺激剂体外激活淋巴细胞用刺激剂体外激活淋巴细胞,用蛋白转运用蛋白转运抑制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，抑制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔基体积聚，用流式细胞仪便可测出子向高尔基体积聚，用流式细胞仪便可测出淋巴细胞内的细胞因子种类，从而确定淋巴细胞内的细胞因子种类，从而确定TH1/TH1/TH2TH2细胞的百分率。细胞的百分率。淋巴细胞内细胞因子检测淋巴细胞内细胞因子检测48原理:淋巴细胞内细胞因子检测48分泌的细胞因子分泌的细胞因子 Thl Th2Thl Th2 IL-2 +-IFN-+-TNF-+IL-3 +GM-CSF +TNF-+IL-4 -+IL-5 -+IL-6 -+IL-10 -+Thl和和Th2分泌的细胞因子分泌的细胞因子49分泌的细胞因子 Thl Th2 特异性抗原皮肤试验特异性抗原皮肤试验PHAPHA皮肤试验皮肤试验体内试验体内试验50特异性抗原皮肤试验体内试验50溶血空斑试验溶血空斑试验酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验体内试验体内试验B细胞功能检测细胞功能检测51溶血空斑试验B细胞功能检测51溶血空斑试验溶血空斑试验溶血斑溶血斑补体抗血清包被抗血清包被绵羊红细胞绵羊红细胞52溶血空斑试验溶血斑补体抗血清包被52酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法抗体产生抗体产生B细胞细胞抗原抗原包被包被酶联抗酶联抗抗体抗体凝胶底物凝胶底物显色显色53酶联免疫斑点法抗体产生抗原包被酶联抗抗体凝胶底物53刺激体内抗体产生的特异性抗原有刺激体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒白喉类毒素素、破伤风类毒素破伤风类毒素、多价肺炎链球菌多价肺炎链球菌等。等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫将适量抗原皮下或肌肉注射免疫,并于免疫前并于免疫前及免疫后及免疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分别采血，分离血周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内判断受检者体内B B细胞的功能。细胞的功能。体内试验体内试验54刺激体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价染色计数染色计数离心取上清离心取上清测测LDHLDH或或AKPAKP测发光强度测发光强度测测CPMCPM值值形态法形态法酶释法酶释法放射性核素释放射性核素释放法放法流式细胞术流式细胞术靶靶细细胞胞溶溶解解常用靶细胞常用靶细胞:K562:K562细胞株细胞株NK细胞活性检测细胞活性检测返回章目录返回章目录55染色计数离心取上清测发光强度测CPM值形态法靶细胞溶解常用靶谢谢 谢！谢！56谢 谢！56