HPV基因诊断试剂盒课件

子宫颈癌子宫颈癌及及人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒（HPVHPV）的研究进展）的研究进展1子子宫颈宫颈癌及人乳癌及人乳头头瘤病毒瘤病毒1一、宫颈癌的概述及其病因学研究进展一、宫颈癌的概述及其病因学研究进展二、二、HPV的生物学研究的生物学研究三、宫颈癌的早期筛查三、宫颈癌的早期筛查四、宫颈病变的治疗四、宫颈病变的治疗2一、一、宫颈宫颈癌的概述及其病因学研究癌的概述及其病因学研究进进展展2一、宫颈癌的概述及其病因学研究进展一、宫颈癌的概述及其病因学研究进展3一、一、宫颈宫颈癌的概述及其病因学研究癌的概述及其病因学研究进进展展3宫颈癌最常见的妇科恶性肿瘤宫颈癌最常见的妇科恶性肿瘤据世界范围内统计，每年大约有50万左右的宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的5%，其中80%的病例发生在发展中国家。我国每年宫颈癌新发病例约13.15万，占世界宫颈癌新发病例总数的28.8%，发病率发病率仅次于乳腺癌位居第二。随着筛查制度的建立，世界宫颈癌的发病率和死亡率已经大幅下降。我国由70年代的10.28/10万下降到90年代的3.25/10万，但在高发病区，死亡率仍高居不下。地区地区死亡率死亡率(/10万）万）世界8.00中国3.25北京2.54上海3.8山西阳城36.004宫颈宫颈癌最常癌最常见见的的妇妇科科恶恶性性肿肿瘤地区死亡率瘤地区死亡率(/10万）世界万）世界8患病年龄更趋于年轻化（发病年龄提前到45岁），发病史缩短。如吉林省在80年代统计宫颈癌患者中小于35岁的妇女占4.8，而2000年已经占到34.15患病年患病年龄龄更更趋趋于年于年轻轻化（化（发发病年病年龄龄提前到提前到45岁岁），），发发病史病史缩缩子宫颈癌的危险因素：子宫颈癌的危险因素：v 行为危险因素：如性生活过早、多个性伴侣、多孕多产、社会经济地位低下、营养不良及性混乱等；v 生物学因素：如细菌、病毒和衣原体等各种微生物的感染。v 目前仅有少量研究表明宫颈癌可能存在着家族聚集现象。6子子宫颈宫颈癌的危癌的危险险因素：因素：6宫颈癌的生物学病因研究进展宫颈癌的生物学病因研究进展：*早在十九世纪四十年代，一位意大利医生RegoniStern最早提出结婚及否与宫颈癌的发生可能有关；*6070年代，人们的主要研究对象是HSV,HCMV等病原体；*1974年zurHausen首次提出HPV感染与宫颈肿瘤有密切关系；*1977年Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在人乳头状瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）颗粒；*1995年IARC专题讨论会：高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要病因。-99.7的宫颈癌患者都能发现高危型HPV感染。7宫颈宫颈癌的生物学病因研究癌的生物学病因研究进进展展：*早在十九世早在十九世纪纪四十年代，一位四十年代，一位二、二、HPV的生物学研究的生物学研究8二、二、HPV的生物学研究的生物学研究8人乳头瘤病毒（Human Papillomaviruses,HPV）双链双链DNA无包膜病毒无包膜病毒环状DNA，约8Kb；病毒颗粒直径为5055nm；依靠宿主细胞进行复制、转录和翻译。HPV病毒电镜图9人乳人乳头头瘤病毒（瘤病毒（HumanPapillomaviruses,型别：型别：已发现100多种不同的亚型（如果DNA序列同源性小于90，则定为新的亚型）。其中超过35种可以感染人类的生殖器官，约30种及肿瘤有关。1）低危型低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（HPV 6、11、42）；2）高危型高危型：宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66及68）；分布分布：有些亚型和地区、宫颈癌的病理类型有关。有些亚型和地区、宫颈癌的病理类型有关。HPV45在非洲西部很常见，HPV39和59在美洲中部和南部常见，HPV52，58在中国常见。在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16（占51），在腺癌和腺鳞癌中HPV18分别占56和39。型别型别及及分布分布10型型别别：已：已发现发现100多种不同的多种不同的亚亚型（如果型（如果DNA序列同序列同表表 HPV型别型别及及宫颈病变宫颈病变常见常见HPV型别型别宫颈病变宫颈病变6，11湿疣，CIN I16CIN,18CIN30，40，58，69CIN31，33，35，39CIN45，51，52，56CIN I42，43，44CIN I53正常宫颈上皮54尖锐湿疣55鲍温样丘疹病59VIN61，62，64，67VaIN66鳞癌70外阴乳头状瘤11表表HPV型型别别及及宫颈宫颈病病变变常常见见HPV型型别宫颈别宫颈病病变变6，1HPV在欧洲的常见分型和感染率最常见的低危型（HPV6、11）最常见的高危型（HPV16、18、31、33、45、58）HPV16HPV18HPV45HPV31HPV33Other宫颈癌患者中高危型HPV感染率(欧州2000年资料)12HPV在欧洲的常在欧洲的常见见分型和感染率最常分型和感染率最常见见的低危型（的低危型（HPV6、11深深圳圳不不同同HPV亚亚型型的的检检出出频频率率统统计计 （WHO项目）项目）注：1.本表统计样本数为1153例，其中阳性样本数为119例；由于检测样本中存在复合感染，故亚型的检出频率（该亚型的检出次数/所有亚型的检出次数）100，所有亚型检出次数为226。2.本表统计数据由WHO深圳项目提供，HPV分型基因检测试剂由亚能生物技术（深圳）有限公司提供。13深圳不同深圳不同HPV亚亚型的型的检检出出频频率率统计统计（WHO项项目）目）浙江12000例HPV检测初步结果分型情况：16型占26%左右，其他依次为58、33、52、45、18。及其他地区的统计有明显差异。高危人群阳性率在30%左右，普通人群在11%左右。温州地区丽水地区阳性率明显高于省内其他地区。进一步的研究正在进行中。14浙江浙江12000例例HPV检测检测初步初步结结果分型情况：果分型情况：16型占型占26%左左HPV基因结构基因结构 按功能可分为早期区按功能可分为早期区(E区区)、晚期区、晚期区(L区区)和非编码区和非编码区（LCR）三个区域。）三个区域。E区分为E1E7开放阅读框架，主要编码及病毒复制、转录、调控和细胞转化有关的蛋白（HPV无E3）。L区分L1和L2，分别编码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白。LCR是E区与L区间-6.41.0Kb的DNA片段，可负责转录和复制的调控15HPV基因基因结结构构按功能可分按功能可分为为早期区早期区(E区区)、晚期区、晚期区(L区区HPV的致癌机理的致癌机理HPV以游离态感染上皮细胞后，可以持续存在于染色体外，不引起任何病变，或引起良性病变和低度病变，如尖锐湿疣或轻度不典型增生等。而癌变则及病毒DNA整合入宿主染色体密切相关。高危型HPV DNA链通常在E1或E2的开放读码框内断裂，使HPV DNA整合入染色体脆弱区。E6和E7具有促进和维持整合状态的功能。HPV E6蛋白间接抑制 p53活性，阻碍细胞对DNA损伤的反应。（负向调节细胞的生长和分化）HPV E7蛋白与pRb结合后使其功能失活，改变细胞周期的正常调控。16HPV的致癌机理的致癌机理16国内对不同亚型感染致病性研究近况北京大学第一临床医院赵健等对1715例患者研究表明：在高危型中，致癌性最强的是16型，其次是33和31型。（十五攻关资助项目）。在北京中日友好医院进行的591例研究中，发现多重感染患者发生宫颈癌的危险性明显高于单一感染者，对放疗敏感性差，无进展生存期和带瘤生存期比单一感染者明显缩短。17国内国内对对不同不同亚亚型感染致病性研究近况北京大学第一型感染致病性研究近况北京大学第一临临床医院床医院赵赵健等健等对对HPV感染途径及危险因素感染途径及危险因素感染途径：感染途径：主要为性传播和直接皮肤接触主要为性传播和直接皮肤接触特别案例：母亲分娩过程中传播至婴儿的口腔特别案例：母亲分娩过程中传播至婴儿的口腔危险因素：危险因素：1、年龄因素：、年龄因素：30岁以后岁以后HPV感染率下降，但危险性提高。感染率下降，但危险性提高。2、性行为的影响：初次性交年龄越小，性伴侣数量越多，感染率越高；、性行为的影响：初次性交年龄越小，性伴侣数量越多，感染率越高；3、避孕方法：尚无一致意见；、避孕方法：尚无一致意见；4、免疫抑制状态使、免疫抑制状态使HPV感染的危险性增加：如感染的危险性增加：如HIV感染后、肾移植等。感染后、肾移植等。18HPV感染途径及危感染途径及危险险因素感染途径：因素感染途径：18三、宫颈癌的早期筛查三、宫颈癌的早期筛查19三、三、宫颈宫颈癌的早期癌的早期筛查筛查19未见上皮内病变鳞状上皮细胞异常腺上皮细胞异常未见上皮内病变鳞状上皮细胞异常腺上皮细胞异常ASC（Atypical Squamous Cells)：非典型鳞状上皮细胞ASC-US（ASC of Undetermined Signification）:意义不明确的非典型鳞状上皮细胞ASC-H（ASC cannot exclude HSIL）：意义不明确的非典型鳞状上皮细胞不除外高度鳞状上皮内病变L-SIL（Lowgrade Squamous Intraepithelial Lesion）：低度鳞状上皮内病变HPV感染、CIN IH-SIL（Highgrade SIL）：高度鳞状上皮内病变及CIN II、CIN III或原位癌含义一致SCC（Squamous Cell Carcinoma）：鳞状细胞癌AGC（Atypical Glandular Cells)：非典型腺上皮细胞AIS（Adenocarcinoma In Situ)：腺原位癌ACA（Adenocarcinoma）：腺癌组织学检查的分类：组织学检查的分类：CIN（Cervical Intraepithelial Neoplasm)：宫颈上皮内瘤变CIN I：轻度不典型增生 CIN II：中度不典型增生 CINIII：重度不典型增生、原位癌2001年版年版TBS（The Bethesda System)报告分类中报告分类中常见的细胞学诊断宫颈癌前病变的几个术语解释：常见的细胞学诊断宫颈癌前病变的几个术语解释：20未未见见上皮内病上皮内病变变鳞鳞状上皮状上皮细细胞异常腺上皮胞异常腺上皮细细胞异常胞异常2001正常妇女HPV暴露主要是性传播感染几率：40HPV年龄30岁平均824个月CIN I（组织学）CIN II/III（组织学）无细胞学改变/HPV消除子宫颈浸润癌机体免疫机制辅助致癌因素图图 HPV感染感染及及宫颈病变的自然过程宫颈病变的自然过程潜伏感染期 亚临床感染期 临床症状期 HPV相关肿瘤期810年21正常正常妇妇女女HPV暴露主要是性暴露主要是性传传播播HPV年年龄龄10阳性病变风险系数122.5349备注：13年筛查间隔比较安全，随着筛查间隔的增加，风险大幅度增加。表：筛查间隔时间表：筛查间隔时间及及阳性病变风险系数表阳性病变风险系数表23筛查间筛查间隔隔时间时间1233551010阳性病阳性病变风险变风险系数系数122表：表：不同的不同的筛查频率，可以降低的率，可以降低的宫颈癌的累癌的累积发病率病率 筛查频率累积发病率的降低（）每年筛查一次90-93每两年筛查一次86-91每三年筛查一次75-88一生筛查5次61-74一生筛查3次35-55一生筛查2次29-42一生筛查一次17-32摘自：Goldie SJ,et al.2001.13；筛查策略所应用方法包括：1-VIA检查，2-HPV检测，3-巴氏涂片。24表：不同的表：不同的筛查频筛查频率，可以降低的率，可以降低的宫颈宫颈癌的累癌的累积发积发病率病率筛查频筛查频率累率累筛查对象：三年以上性行为或21岁以上有性行为的妇女。起始年龄：经济发达地区：2530岁，经济欠发达地区：3540岁，高危人群起始年龄应相应提前。终止年龄：65岁以上危险性极低。筛查间隔：每年一次，若连续两次HPV和细胞学筛查均为正常，可延长筛查间隔时间至58年。发达国家：1668岁，HPV+TCT，间隔35年。中国癌症研究基金会（CCRF）宫颈癌筛查及早诊早治指南25筛查对筛查对象：三年以上性行象：三年以上性行为为或或21岁岁以上有性行以上有性行为为的的妇妇女。中国癌症女。中国癌症中国癌症研究基金会（CCRF）宫颈癌筛查及早诊早治指南筛查方案：基本方案：肉眼观察冰醋酸试验（碘液试验）（农村普查）一般方案：HPV+papsmear检测（二级及以上医院）最佳方案：HPV+TCT检测（发达地区）检查后随访对象：细胞学低度病变、CIN I以上者、“特殊职业”妇女人群、年龄 30 岁以上的高危HPV感染者，每年定期随访检查。注意事项：1、月经来潮后1018天为最佳检查时间 2、检查前48h内不要做阴道冲洗，不用使用阴道内用药物 3、检查前48h内不要行性生活26中国癌症研究基金会（中国癌症研究基金会（CCRF）宫颈宫颈癌癌筛查筛查及早及早诊诊早治指南早治指南筛查筛查2727宫颈癌的常规临床检测方法临床检查：如肉眼观察、阴道镜等 操作简便，但准确率和特异性有待提高（50-70）细胞学检测：观察宫颈上皮细胞的变异，常见方法有：巴氏涂 片、LCT、TCT等（70%以上）1）长期宫颈糜烂可导致宫颈上皮细胞形态变异，但非HPV引起的细胞形态异常及宫颈癌病变没有直接联系。2）在感染早期，细胞往往不会出现形态变化，但此时HPV对细胞内遗传物质的损伤可能已经产生。病毒学检测：HPV DNA检测（PCR方法），常见方法有：基因芯 片分型检测、HC-2、荧光PCR等 特异性强、灵敏度高，操作简便快捷 (98%)28宫颈宫颈癌的常癌的常规临规临床床检测检测方法方法28宫颈分泌物宫颈分泌物HPVHPV结果结果注：亚能和凯普均以13种高危型别统计若以23种型别计算，亚能HPV阳性129例，阳性率为11.3。共剔除18例13种型别以外的型别29宫颈宫颈分泌物分泌物HPV结结果注：果注：亚亚能和能和凯凯普均以普均以13种高危型种高危型别统计别统计29HPV基因分型快速诊断试剂 应用膜杂交技术建立的敏感、特异、简便的检测方法，可同时对23种HPV亚型(18种高危型及5种低危型)进行检测。30HPV基因分型快速基因分型快速诊诊断断试剂试剂应应用膜用膜杂杂交交基因芯片（基因芯片（G GeneC Chip）就是将大量不同序列）就是将大量不同序列的探针分子固定于支持物的不同位置上，然后的探针分子固定于支持物的不同位置上，然后及及已做标记的样本进行杂交，通过检测杂交信已做标记的样本进行杂交，通过检测杂交信号的强度和分布来进行分析。号的强度和分布来进行分析。高度的灵敏性和准确性高度的灵敏性和准确性快速简便快速简便同时检测多种疾病同时检测多种疾病31基因芯片（基因芯片（GeneChip）就是将大量不同序列的探）就是将大量不同序列的探HPV基因分型快速诊断试剂操作流程采集样本提取DNAPCR扩增杂交显色32HPV基因分型快速基因分型快速诊诊断断试剂试剂操作流程采集操作流程采集样样本提取本提取DNAPCR扩扩3333结果判断检测结果：检测结果：HPV16、HPV43检测结果：检测结果：HPV33、HPV3534结结果判断果判断检测结检测结果：果：HPV16、HPV43检测结检测结果：果：HPV33 （一）宫颈病变的筛查一）宫颈病变的筛查 1、HPV检测的最大优势之一在于发现高危型HPV阳性而细胞学涂片正常的妇女，因为这一人群中10会在四年内发展成CIN。2、筛查并浓缩高风险人群，便于进行有效监控，早期发现宫颈癌。3、HPV检测的阴性预测值为99，可将筛查间隔延长至3年一次，大大地降低了检查成本。敏感性：敏感性：88100 特异性：特异性：98 阴性预测值：几乎阴性预测值：几乎100HPV检测的临床意义检测的临床意义35（一）（一）宫颈宫颈病病变变的的筛查筛查HPV检测检测的的临临床意床意义义35图：图：德、法、英三个国家研究数据总概德、法、英三个国家研究数据总概HPV（）是宫颈病变的重要依据，持续的（）是宫颈病变的重要依据，持续的HPV感染是感染是CINII/CIN III的重要条件，的重要条件，相对于相对于TCT检测，检测，HPV检测敏感度更高，更有临床意义，在欧洲已经作为首选筛查检测敏感度更高，更有临床意义，在欧洲已经作为首选筛查方法。方法。36图图：德、法、英三个国家研究数据德、法、英三个国家研究数据总总概概HPV（）是（）是宫颈宫颈病病变变的的GC-HPV及及TCT的差异的差异GC-HPVGC-HPVTCTTCT两种检测的差异两种检测的差异病原学检测病原学检测细胞学检测细胞学检测两种检测对宫颈两种检测对宫颈癌筛查的提示癌筛查的提示全程提示全程提示即时提示即时提示临床意义临床意义提示有患癌的可能，提示有患癌的可能，确定已经发生细胞形确定已经发生细胞形态改变者的病因态改变者的病因判断是否进入亚判断是否进入亚临床期或临床期临床期或临床期37GC-HPV及及TCT的差异的差异GC-HPVTCT两种两种检测检测的差异病的差异病（二）（二）ASCUS和低度病变的分流和低度病变的分流 1、HPV检测通过排除可疑的或低度病变，从而提高诊断的可信度，降低漏诊的风险。2、把具有潜在宫颈癌风险的妇女从低风险的妇女中区分出来，指导阴道镜的合理使用。3、比起复查细胞学，HPV检测提供了更快捷的结果，从而很有信心地把HPV阴性的妇女重新放回常规筛查人群中。38（二）（二）ASCUS和低度病和低度病变变的分流的分流1、HPV检测检测通通过过排除可疑排除可疑病例数：3000例，图显示HPV的相对风险随CIN 的级别上升而明显增加39病例数：病例数：3000例，例，图显图显示示HPV的相的相对风险对风险随随CIN的的级别级别上上（三）（三）HPV检查提供了检查提供了CIN治疗后随诊手段治疗后随诊手段 1、可预测病变恶化或术后复发的风险，有效指导术后追踪。2、术后6个月、12个月检测HPV阴性，提示病灶切除干净，可最大限度减少病人的焦虑。3、若术后HPV检测阳性，提示有残留病灶及有复发的可能。CIN患者：成功治疗率达9095，复发率10；但比正常人发生浸润癌的几率仍高45倍；危险期：8年左右；40（三）（三）HPV检查检查提供了提供了CIN治治疗疗后随后随诊诊手段手段1、可、可预测预测病病变变病变病变进展（恶化）进展（恶化）持续（稳定）持续（稳定）消退（逆转）消退（逆转）级别级别单纯单纯HPV CIN I CIN IICIN III风险率风险率(%)5153045持续率持续率(%)15373556消退率消退率(%)80574332CIN级别发展为级别发展为CC的风险评估的风险评估说明：说明：CIN级别越高，其消退和逆转的机会越小。各型级别越高，其消退和逆转的机会越小。各型CIN和宫颈癌和宫颈癌中高危型中高危型HPV感染率达感染率达98%以以41病病变进变进展（展（恶恶化）持化）持续续（稳稳定）消退（逆定）消退（逆转转）级别单纯级别单纯HPVCI 四、宫颈病变的治疗四、宫颈病变的治疗 “治病治病”即即“治毒治毒”-郎景和教授语录郎景和教授语录42四、四、宫颈宫颈病病变变的治的治疗疗42一、物理治疗：电凝、冷冻、微波、激光等。二、手术治疗：LEEP、子宫颈锥切术等。三、药物治疗：抗生素、干扰素、HPV疫苗（预防型和治疗型）43一、物理治一、物理治疗疗：电电凝、冷凝、冷冻冻、微波、激光等。、微波、激光等。43子宫颈筛查经过的处理原则子宫颈筛查经过的处理原则慢慢性性宫宫颈颈炎炎：物物理理治治疗疗，激激光光、电电烙烙、微微波波、冷冷冻冻子宫颈子宫颈CINCIN的处理的处理 CIN CIN 物理治疗：激光，微波等物理治疗：激光，微波等 CINCIN Leep Leep治疗，治疗，CIN CIN 一般情况下会诊断为一般情况下会诊断为CINCIN，不再可能采用物理治疗手段，不再可能采用物理治疗手段 当排除了当排除了CISCIS，治疗可行，治疗可行LeepLeep治疗治疗 已确诊为已确诊为CISCIS或更严重，目前不可能采用或更严重，目前不可能采用LeepLeep治疗，而可能冷刀锥切治疗，而可能冷刀锥切 若已完成生育者，一经诊断为若已完成生育者，一经诊断为CISCIS，应接受全子宫切除手术，应接受全子宫切除手术 44子子宫颈筛查经过宫颈筛查经过的的处处理原理原则则慢性慢性宫颈宫颈炎：物理治炎：物理治疗疗，激光、，激光、电电烙、烙、HPV检测后处理原则（综合）对可疑病例进行HPV检查：阴性：进行常规治疗(针对症状体症进行治疗)。阳性：HPV结果阳性而未做细胞学检查必须进行TCT检查。45HPV检测检测后后处处理原理原则则（综综合）合）对对可疑病例可疑病例进进行行HPV检查检查：45HPV检测后处理原则HPV阳性而TCT阴性：1、年龄30岁且高危型阳性，必须进行阴道镜检查、活检。同时进行物理和药物治疗（包括症状体症不明显者），并在治疗后复查疗效。46HPV检测检测后后处处理原理原则则HPV阳性而阳性而TCT阴性：阴性：46HPV检测后处理原则HPV和TCT同时阳性：1、必须进行阴道镜检查、活检，进行物理或手术治疗，同时进行药物治疗，并在治疗后进行复查。2、处理时在参考TCT结果的处理原则基础上，应该更加严格和慎重，特别是对HPV多重感染同时合并有TCT结果阳性患者。因为这些患者发展成宫颈癌的风险极高。47HPV检测检测后后处处理原理原则则HPV和和TCT同同时时阳性：阳性：47484849495050v 唯一病因明确的癌症。唯一病因明确的癌症。v 唯一可以早期发现及预防的癌症。唯一可以早期发现及预防的癌症。v 唯一可望消灭的癌症。唯一可望消灭的癌症。子宫颈癌子宫颈癌 51子子宫颈宫颈癌癌51谢 谢 ！52谢谢谢谢！52