微生物的生长和其控制培训课件

微生物的生微生物的生长和其控和其控制制生长生长微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用用 异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。繁殖繁殖生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。发育发育从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。个体生长个体生长微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长群体生长群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）反映个体生长的状况）个体生长个体生长个体繁殖个体繁殖 群体生长群体生长 群体生长群体生长=个体生长个体生长+个体繁殖个体繁殖生长与繁殖的概念生长与繁殖的概念2微生物的生长和其控制第一节第一节 测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法一、以生物量为指标测定微生物的生长一、以生物量为指标测定微生物的生长（一）直接法（一）直接法体积测量法：体积测量法：又称测菌丝浓度法又称测菌丝浓度法通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分分钟）和转速（如钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清液，测出），离心后，倒出上清液，测出上清液体积为上清液体积为v，则菌丝浓度为（，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。固体营养物，结果会有一定偏差。3微生物的生长和其控制称干重法：称干重法：适用于测定单细胞和丝状微生物的生物量适用于测定单细胞和丝状微生物的生物量可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10-20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行次，进行干燥。干燥可用烘箱在干燥。干燥可用烘箱在105或或100下烘干，或采用红外线烘下烘干，或采用红外线烘干，也可在干，也可在80或或40下真空干燥，干燥后称重。下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40下进行真空干燥。下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（用这种方法，如活性干酵母（activity dry yeast,ADY）,一些一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。生物量：干细胞重生物量：干细胞重mg/mL举例：大肠杆菌一个细胞一般重约举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g，液体培养物中细胞，液体培养物中细胞浓度达到浓度达到2109个个/ml时，时，100ml培养物可得培养物可得1090mg干重的细胞。干重的细胞。该法适合菌浓较高的样品该法适合菌浓较高的样品4微生物的生长和其控制（二）间接法（二）间接法比浊法：比浊法：该法主要用于发酵工业菌体生长监测该法主要用于发酵工业菌体生长监测 微生物的生长引起培养物混浊度的增高。在一定范围微生物的生长引起培养物混浊度的增高。在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。度。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。快速、简便；但易受干扰。快速、简便；但易受干扰。5微生物的生长和其控制生理指标法：生理指标法：测含氮量测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为，酵母菌为7.5%，霉菌为，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白，就可测得粗蛋白的含量。的含量。其他方法其他方法含碳、磷、含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。6微生物的生长和其控制二、以数量变化对微生物生长情况进行测定二、以数量变化对微生物生长情况进行测定（一）直接法（一）直接法 将待测样品制成菌悬液，适当稀释，加入血球计数板方将待测样品制成菌悬液，适当稀释，加入血球计数板方格网的计数室内，在显微镜下直接计数；因为计数室的格网的计数室内，在显微镜下直接计数；因为计数室的体积一定，所以能够计算出每毫升待测样品中的细胞个体积一定，所以能够计算出每毫升待测样品中的细胞个数；数；特点：特点：全菌计数，不区分死菌与活菌；全菌计数，不区分死菌与活菌；适用于单细胞微生物：适用于单细胞微生物：细菌、酵母菌；细菌、酵母菌；要点：要点：菌悬液浓度应在菌悬液浓度应在108个细胞个细胞/毫升左右；毫升左右；7微生物的生长和其控制血球计数板的结构血球计数板的结构一块特殊的载玻片，中间两个平台上各刻有一个大方格网。一块特殊的载玻片，中间两个平台上各刻有一个大方格网。8微生物的生长和其控制方格网的结构方格网的结构方格网由九个大方格组成，中方格网由九个大方格组成，中间的大方格为计数室。间的大方格为计数室。计数室：计数室：边长边长1mm、高高0.1mm，体积体积0.1mm3 等于等于10-4 ml9微生物的生长和其控制分为分为25个中方格个中方格每个中格分为每个中格分为16个小方格个小方格共共400小格；小格；计数室计数室计数方法计数方法在显微镜下计算在显微镜下计算4-5个中格的细菌个中格的细菌数，并求出每个数，并求出每个小格所含细菌的小格所含细菌的平均数平均数10微生物的生长和其控制（二）间接法（二）间接法平板菌落计数法：平板菌落计数法：活菌计数，适用于单细胞微生物活菌计数，适用于单细胞微生物 将待测样品制成菌悬液；菌悬液用将待测样品制成菌悬液；菌悬液用10倍稀释法适当稀倍稀释法适当稀释；定量取稀释液（释；定量取稀释液（0.2ml）涂平板培养，根据平板上生长）涂平板培养，根据平板上生长的菌落计数（的菌落计数（cfu数数/平板）平板）要点：同一稀释度涂布三皿以上取平均值计数；每支要点：同一稀释度涂布三皿以上取平均值计数；每支移液管或枪头只能接触一个稀释度的菌液移液管或枪头只能接触一个稀释度的菌液厌氧菌的菌落计数法：厌氧菌的菌落计数法：第四节第四节11微生物的生长和其控制12微生物的生长和其控制平板菌落计数平板菌落计数13微生物的生长和其控制14微生物的生长和其控制第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律一、微生物的个体生长和同步生长一、微生物的个体生长和同步生长由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。同步培养技术：同步培养技术：设法使群体中的所有细胞尽量都处于同样的细胞生长设法使群体中的所有细胞尽量都处于同样的细胞生长和分裂周期中，然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个和分裂周期中，然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个细胞所发生的变化。细胞所发生的变化。同步培养法：同步培养法：能获得处于同一生长阶段能获得处于同一生长阶段 的群体细胞的培养方法的群体细胞的培养方法 同步生长：同步生长：运用同步培养技术，控制微生物生长，使之处于同一生长运用同步培养技术，控制微生物生长，使之处于同一生长阶段并同时分裂。阶段并同时分裂。同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。生物化学等研究的良好材料。15微生物的生长和其控制获得同步生长的方法：获得同步生长的方法：获得同步生长的方法主要有两类：获得同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。胞周期不同的周期变化。机械筛选法：机械筛选法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。不影响细胞代谢。16微生物的生长和其控制Helmstetter-Cummings 法最经典的获得同步生长的方法法最经典的获得同步生长的方法硝酸纤维素滤膜法是由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，个世代，随后又逐渐转变为随机生长。随后又逐渐转变为随机生长。17微生物的生长和其控制二、单细胞微生物的典型生长曲线二、单细胞微生物的典型生长曲线生长曲线生长曲线就是以培养时间为横座标，以细胞数量或生物就是以培养时间为横座标，以细胞数量或生物量为纵座标作出的培养过程中生物量变化曲线图，反映量为纵座标作出的培养过程中生物量变化曲线图，反映液体培养基中微生物群体生长规律。液体培养基中微生物群体生长规律。以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结论也基本适用于酵母菌。论也基本适用于酵母菌。生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。死亡的整个动态变化过程。每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。18微生物的生长和其控制将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。生长曲线的制作生长曲线的制作19微生物的生长和其控制典型的生长曲线典型的生长曲线（Growth curve）延延滞滞期期对对数数期期稳定期稳定期衰亡期衰亡期时期的划分：按照生长速率常数（时期的划分：按照生长速率常数（growth race constant）不同）不同20微生物的生长和其控制其它名称：延迟期、停滞期、调整期、适应期其它名称：延迟期、停滞期、调整期、适应期刚接种后开始时细胞一般不立即进行繁殖，刚接种后开始时细胞一般不立即进行繁殖，细菌数几乎不增加的一段时期，曲线稍平。细菌数几乎不增加的一段时期，曲线稍平。此时期细胞内的代谢活动比较旺盛，细胞此时期细胞内的代谢活动比较旺盛，细胞体积明显增大，在此期的后期，少数细胞体积明显增大，在此期的后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。开始分裂，曲线略有上升。现象：现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴活菌数没增加，曲线平行于横轴特点：特点：生长速率常数生长速率常数=0细胞形态变大或增长细胞形态变大或增长细胞内细胞内RNA特别是特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强含量增高，原生质嗜碱性增强合成代谢活跃（核糖体、酶类、合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱合成加快），易产生诱导酶导酶对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）学药物）原因：原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物（一）延滞期（一）延滞期（lag phase）21微生物的生长和其控制菌种：菌种：繁殖速度较快的菌种的延滞期一般较短；繁殖速度较快的菌种的延滞期一般较短；接种物菌龄：接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延滞期用对数生长期的菌种接种时，其延滞期较短，甚至检查不到延滞期；较短，甚至检查不到延滞期；接种量：接种量：一般来说，一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延滞接种量增大可缩短甚至消除延滞期期（发酵工业上一般采用发酵工业上一般采用1/10的接种量）；的接种量）；培养基成分：培养基成分：在营养成分丰富的天然培养基上生长的在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种后培养基成延滞期比在合成培养基上生长时短；接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。影响延滞期长短的因素：影响延滞期长短的因素：22微生物的生长和其控制认识延滞期的特点及形成原因对实践的指导意义：认识延滞期的特点及形成原因对实践的指导意义：在发酵工业上需设法尽量缩短延滞期；在发酵工业上需设法尽量缩短延滞期；采取的缩短采取的缩短lag phase 的措施有：的措施有：增加接种量；（群体优势增加接种量；（群体优势-适应性增强）适应性增强）采用对数生长期的健壮菌种；采用对数生长期的健壮菌种；调整培养基的成分，在种子培养基中加入发酵调整培养基的成分，在种子培养基中加入发酵培养基的某些成分。培养基的某些成分。选用繁殖快的菌种选用繁殖快的菌种在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌23微生物的生长和其控制（二）对数期（二）对数期（logarithmic phase）其他名称：指数期其他名称：指数期细胞经过代谢调整后，进入平衡生长，细胞内各成分按比例有规律细胞经过代谢调整后，进入平衡生长，细胞内各成分按比例有规律地增加，以稳定的繁殖速率进行繁殖，细菌数量呈指数函数增加；地增加，以稳定的繁殖速率进行繁殖，细菌数量呈指数函数增加；生长进入指数生长期生长进入指数生长期现象：现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。特点：特点：生长速率常数最大，即生长速率常数最大，即代时代时最短最短细胞进行平衡生长，细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致菌体大小、形态、生理特征等比较一致代谢最旺盛代谢最旺盛细胞对理化因素较敏感细胞对理化因素较敏感24微生物的生长和其控制 由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代世代，一，一个世代所需的时间就是个世代所需的时间就是代时（代时（eneration time,G），代时，代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需也就是群体细胞数目扩大一倍所需 时间，有时也称为时间，有时也称为倍增倍增时间时间。右图表示的是一个细右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的胞经过若干代分裂后的情况。右图可见，每经情况。右图可见，每经过一个代时，细胞数目过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增就增加一倍，呈指数增加，因而被称为加，因而被称为指数生指数生长长，这，这就是就是单细胞群体单细胞群体生长的特征。生长的特征。25微生物的生长和其控制N2N1t2t1培养时间培养时间Lg 细胞数细胞数/ml26微生物的生长和其控制代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。中常常要了解微生物的代时。代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为的代时为13h,然而有些快速生长的微生物的代时还然而有些快速生长的微生物的代时还不到不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。的一个重要特征。27微生物的生长和其控制影响指数期微生物增代时间的因素很多，主要有：影响指数期微生物增代时间的因素很多，主要有：菌种菌种：不同菌种代时差别大：不同菌种代时差别大营养成分营养成分：同一种细菌在营养物丰富的培养基中生长代时较短。：同一种细菌在营养物丰富的培养基中生长代时较短。营养物浓度营养物浓度：营养物浓度可影响微生物的生长速率和总生长量。：营养物浓度可影响微生物的生长速率和总生长量。培养温度培养温度：温度对微生物的生长速率有极其明显的影响。：温度对微生物的生长速率有极其明显的影响。28微生物的生长和其控制一些细菌的代时一些细菌的代时菌名菌名培养基培养温度培养基培养温度 代时代时minE.coli（大肠杆菌）（大肠杆菌）肉汤肉汤 3717E.coli 牛奶牛奶 3712.5Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）（产气肠细菌）肉汤或牛奶肉汤或牛奶 371618E.aerogenes 组合组合 372944B.Cereus（蜡状芽孢杆菌）（蜡状芽孢杆菌）肉汤肉汤3018B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌）（嗜热芽孢杆菌）肉汤肉汤5518.3Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌）（嗜酸乳杆菌）牛奶牛奶376687Streptococcus lactis（乳酸链球菌）（乳酸链球菌）牛奶牛奶3726S.lactis乳糖肉汤乳糖肉汤3748Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）（伤寒沙门氏菌）肉汤肉汤3723.5Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌）（褐球固氮菌）葡萄糖葡萄糖25344461Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合（结核分枝杆菌）组合37792932Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌）（活跃硝化杆菌）组合组合27120029微生物的生长和其控制不同温度下的代时不同温度下的代时温度对微生物的代时有明显影响：温度对微生物的代时有明显影响：E.Coli 在不同温度下的代时在不同温度下的代时温度（温度（）代时（分）代时（分）温度（温度（）代时（分）代时（分）10860352215120371720904017.525404520302947.57731微生物的生长和其控制应用意义：应用意义：由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期是生理代谢及是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等遗传研究或进行染色、形态观察等的良好的良好材料材料。32微生物的生长和其控制（三）（三）稳定期（稳定期（stationary phase）又称：恒定期或最高生长期又称：恒定期或最高生长期特点：特点：新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。孢。此时期的微生物开始此时期的微生物开始合成次生代谢产物合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。产生原因：产生原因：营养物尤其是生长限制因子的耗尽营养物尤其是生长限制因子的耗尽 营养物的比例失调，如碳氮比不合适营养物的比例失调，如碳氮比不合适;有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）物化条件（物化条件（pH、氧化还原势等）不合适、氧化还原势等）不合适;33微生物的生长和其控制应用意义：应用意义：1 1）发酵生产形成代谢产物的重要时期（抗生素、氨基酸等），）发酵生产形成代谢产物的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）补充营养物质（补料）调调pH pH 调整温度调整温度 2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。生长产量常数（生长产量常数（Y Y，或生长得率，或生长得率，growth yieldgrowth yield）：）：概念：表示微生物对基质利用效率的高低概念：表示微生物对基质利用效率的高低 Y=菌体干重菌体干重/消耗营养物质的浓度消耗营养物质的浓度 根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量 x-稳定期细胞干重稳定期细胞干重；x0-接种时细胞干重接种时细胞干重；C-稳定期限制性营养稳定期限制性营养物浓度；物浓度；C0-限制性营养物最初浓度限制性营养物最初浓度如：如：Y=0.5，表示要得到，表示要得到5g菌体，需某营养物（葡萄糖）菌体，需某营养物（葡萄糖）10g。Y=x x0C0 C=x x0C034微生物的生长和其控制（四）（四）衰亡期（衰亡期（decline phase）现象：现象：整个群体出现负生长（整个群体出现负生长（R 0）特点：特点：细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长负生长”。细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。孢开始释放。因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。件有关。产生原因：产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡35微生物的生长和其控制丝状微生物的群体生长丝状微生物的群体生长丝状微生物的纯培养采用孢丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震子接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。可以用菌丝形成产孢结构。可以用菌丝干重作为衡量生长的指标，干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲干重为纵坐标，绘制生长曲线。线。可分为三个阶段：可分为三个阶段：1、生长停滞期、生长停滞期2、迅速生长期、迅速生长期3、衰退期、衰退期36微生物的生长和其控制1、生长停滞期、生长停滞期:造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。2、迅速生长期、迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，菌丝干重不以几何级菌丝体干重迅速增加，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。的开始积累代谢产物。3、衰退期、衰退期:菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。丝状微生物的群体生长丝状微生物的群体生长37微生物的生长和其控制三、微生物的连续培养三、微生物的连续培养分批培养（分批培养（batch culture）：将微生物置于一定将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养（连续培养（continuous culture）：在微生物培在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。连续培养理论基础连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。临，从而发展出现在的连续培养技术。38微生物的生长和其控制原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式以同样的流速不断流出培养液，使培养物达到动态平衡，方式以同样的流速不断流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。长速率。单批培养单批培养 恒浊法恒浊法恒化法恒化法 单批培养单批培养连续培养连续培养时间时间连续流入连续流入新鲜培养液新鲜培养液lg细胞数（个细胞数（个/ml）连续培养连续培养 连续培养原理连续培养原理39微生物的生长和其控制连续连续培养培养器器按控制方式分按控制方式分按培养器的级数分按培养器的级数分按细胞状态分按细胞状态分按用途分按用途分内控制（控制菌体密度）：恒浊器内控制（控制菌体密度）：恒浊器外控制（控制培养液流速、以控制外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器生长速率）：恒化器单级连续培养器单级连续培养器多级连续培养器多级连续培养器一般连续培养器一般连续培养器固定化细胞连续培养器固定化细胞连续培养器实验室科研用：连续培养器实验室科研用：连续培养器发酵生产用：连续发酵罐发酵生产用：连续发酵罐连续培养器连续培养器40微生物的生长和其控制（1）按控制方式分按控制方式分连续培养技术连续培养技术恒化连续培养恒化连续培养概念概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。生长速率恒定的方法。原理：原理：通过控制某一种营养物浓度通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、（如碳、氮源、生长因子等）生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而，使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖，保持恒低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖，保持恒定的生长速率。定的生长速率。特点：特点：维持营养成分的维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速亚适量，控制微生物生长速率。率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。量低于最高菌体产量。应用范围：应用范围：实验室科学研究实验室科学研究41微生物的生长和其控制恒化器恒化器Chemostat 或或bactogen42微生物的生长和其控制概念：概念：通过连续培养装置中的通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。的一种培养方式。原理原理：通过调节新鲜培养基流通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变来维持菌浓度不变,即浊度不即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基快，浊度降低，则减慢培养基的流速。的流速。特点：特点：基质过量，微生物始终基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，以最高速率进行生长，并可在并可在允许范围内控制不同的菌体密允许范围内控制不同的菌体密度度；但工艺复杂，烦琐。；但工艺复杂，烦琐。连续培养技术连续培养技术恒浊培养恒浊培养使用范围：使用范围：用于生产大量菌用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。乙醇等。43微生物的生长和其控制装置装置控制对象控制对象培养基培养基培养基培养基流速流速生长速生长速率率产物产物应用应用范围范围恒浊器恒浊器菌体密度菌体密度（内控制）（内控制）无限制无限制生长因生长因子子不恒定不恒定最高最高大量菌体大量菌体或与菌体或与菌体形成相平形成相平行的产物行的产物生产生产为主为主恒化器恒化器培养基流培养基流速（外控速（外控制）制）有限制有限制生长因生长因子子恒定恒定低于最低于最高高不同生长不同生长速率的菌速率的菌体体实验实验室为室为主主恒浊器与恒化器的比较恒浊器与恒化器的比较44微生物的生长和其控制（2）按培养器级数分按培养器级数分单级单级连续培养器连续培养器 某微生物的代谢产物的产生速率与菌体生长速率某微生物的代谢产物的产生速率与菌体生长速率相平行时，可采用单级恒浊式连续发酵罐相平行时，可采用单级恒浊式连续发酵罐多级连续培养器多级连续培养器 产物形成与菌体生长不平行，如丙酮、丁醇或某产物形成与菌体生长不平行，如丙酮、丁醇或某些次生代谢产物，应采用多级连续培养装置些次生代谢产物，应采用多级连续培养装置45微生物的生长和其控制连续发酵（连续发酵（continuous fermentation）连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。优点：优点：高效，简化了操作高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；自控：便于利用各种仪表进行自动控制；自控：便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量稳定产品质量稳定节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。缺点：缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。单批培养。连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月 1年。年。46微生物的生长和其控制四、微生物的高密度培养（自学）四、微生物的高密度培养（自学）High Cell-density Culture一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养常规培养10倍以上的生长状态或培养技术倍以上的生长状态或培养技术高密度培养的方法高密度培养的方法最佳培养成分及相应最佳含量最佳培养成分及相应最佳含量补料补料溶解氧的浓度溶解氧的浓度防止有害代谢产物生成防止有害代谢产物生成47微生物的生长和其控制