微生物的实验室培养1-课件

微生物包括哪五类：微生物包括哪五类：病毒病毒细菌细菌放线菌放线菌真菌真菌原生动物原生动物特点：特点：结构都相当简单结构都相当简单,个体多数十分微小个体多数十分微小.通通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿且体内一般不含有叶绿素素.不能进行光合作用不能进行光合作用.原核生物原核生物界界 原生生物界原生生物界真菌界真菌界病毒界病毒界微生物基础知识一、培养基的概念、种一、培养基的概念、种类及及营养要素养要素1概概念念：人人们按按照照微微生生物物对_的的不不同需求，配制出供其生同需求，配制出供其生长繁殖的繁殖的营养基养基质。2种种类：按照培养基的形：按照培养基的形态划分。划分。(1)液体培养基：配制成的液体培养基：配制成的_状状态的基的基质。营养物质营养物质液体液体(2)固固体体培培养养基基：配配制制成成的的_状状态的的基基质。在在液液体体培培养养基基中中加加入入凝凝固固剂，如如琼脂脂，制制成成琼脂脂固固体体培培养养基基，是是实验室室中中最最常常用用的的培培养养基基之之一一，微微生生物物在在其其上上面面生生长，可可形形成成肉肉眼眼可可见的的_，主主要要用用于于微生物的分离、微生物的分离、鉴定等。定等。固体固体菌落菌落按照培养基的物理性质划分按照培养基的物理性质划分液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长半固体培养基：无动力 有动力(弥散固体培养基：菌落固体培养基：菌落按照培养基的化学成分划分按照培养基的化学成分划分按照培养基用途分按照培养基用途分按照培养基用途分按照培养基用途分 选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有金属光泽有金属光泽大肠杆菌在大肠杆菌在伊红美蓝伊红美蓝培养基上典型特征培养基上典型特征 鉴定培养基：鉴定所培养生物的类型2、培养基配制原则：（1）目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。细菌pH为：6.5-7.5；放线菌pH为：7.5-8.5；真菌pH为：5.0-6.0。3、培养基的营养构成 不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有水水、碳源碳源、和、和氮源氮源、无机盐无机盐等营养物质，另等营养物质，另外还需要满足微生物生长对外还需要满足微生物生长对pH、特殊特殊营养物质营养物质,例如例如:生长因子生长因子(即细菌生长必即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物需，而自身不能合成的化合物,如维生素如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。二氧化碳、渗透压等的要求。特特别别提提示示(1)微微生生物物最最常常用用的的碳碳源源是是糖糖类类，尤尤其其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。(2)对对异异养养微微生生物物来来说说，含含C、H、O、N的的有有机机物物既是碳源，又是氮源、能源。既是碳源，又是氮源、能源。(3)有有些些培培养养基基不不需需要要添添加加生生长长因因子子，生生物物自自己己能能合合成成；而而绝绝大大多多数数微微生生物物培培养养需需要要加加入入生生长长因因子子，原原因因是是他他们们缺缺乏乏合合成成这这些些物物质质所所需需要要的的酶酶或或合合成成能力有限。能力有限。pH 特殊营养物质特殊营养物质 氧气氧气 维生素维生素 酸性酸性 中性或微碱性中性或微碱性 无氧无氧 二、无菌技术二、无菌技术1获获得得纯纯净净培培养养物物的的关关键键是是防防止止_的的入入侵，具体操作如下：侵，具体操作如下：(1)对对实实验验操操作作的的_、操操作作者者的的衣衣着着和和手手进进行行清清洁和消毒。洁和消毒。(2)将将用用于于微微生生物物培培养养的的器器皿皿、接接种种用用具具和和培培养养基基等器具进行灭菌。等器具进行灭菌。(3)为为避避免免周周围围环环境境中中_的的污污染染，实实验验操操作作应在酒精灯火焰附近进行。应在酒精灯火焰附近进行。(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与_相接触。相接触。外来杂菌外来杂菌空间空间微生物微生物周围的物品周围的物品旁栏思考题旁栏思考题1无无菌菌技技术除除了了用用来来防防止止实验室室的的培培养养物物被被其他外来微生物其他外来微生物污染外，染外，还有什么目的？有什么目的？解解析析许许多多微微生生物物对对人人类类是是有有害害的的，因因此此实实验验室室中中无无菌菌技技术术还还能能有有效效避避免免操操作作者者自自身身被被微微生生物物感染。感染。答答案案无无菌菌技技术还能能有有效效避避免免操操作作者者自自身身被被微微生物感染。生物感染。2消毒和灭菌消毒和灭菌(1)消毒消毒概概念念：使使用用较较为为温温和和的的物物理理或或化化学学方方法法仅仅杀杀死死物物体体表表面面或或_一一部部分分对对人人体体有有危危害害的的微微生生物物(不不包括芽孢和孢子包括芽孢和孢子)。常常用用方方法法：_消消毒毒法法、巴巴氏氏消消毒毒法法、化化学学药药剂消毒法等。剂消毒法等。(2)灭菌灭菌概概念念：使使用用强强烈烈的的理理化化因因素素杀杀死死物物体体内内外外_的的微生物。微生物。常用方法：灼烧灭菌、干热灭菌、常用方法：灼烧灭菌、干热灭菌、_灭灭菌。菌。内部内部煮沸煮沸所有所有高压蒸汽高压蒸汽(1)消消毒和毒和灭菌的区菌的区别 （2 2）常用的消毒、灭菌手段）常用的消毒、灭菌手段(2)灭菌所依据的原理基本都是使菌体内的蛋白质和核灭菌所依据的原理基本都是使菌体内的蛋白质和核酸发生变性，从而达到杀菌的效果。酸发生变性，从而达到杀菌的效果。(3)消毒时一般不能杀死微生物的芽孢的原因是：芽孢消毒时一般不能杀死微生物的芽孢的原因是：芽孢是细胞生长发育后期，在细胞内形成的一个圆柱或椭圆是细胞生长发育后期，在细胞内形成的一个圆柱或椭圆形形、厚壁、含水量极低、抗逆性很强的休眠体，它抗、厚壁、含水量极低、抗逆性很强的休眠体，它抗热、抗化学药物、抗静水压的能力极强。热、抗化学药物、抗静水压的能力极强。思思维维激激活活1 用用酒酒精精擦擦拭拭实验者者手手臂臂属属消消毒毒还是是灭菌菌？70%与与95%的的酒酒精精，哪哪一一种种效效果果更更好好？为什么？什么？提提示示酒酒精精擦擦拭拭属属化化学学消消毒毒，酒酒精精消消毒毒时时，70%的的酒酒精精杀杀菌菌效效果果最最好好。原原因因是是：浓浓度度过过高高，使使菌菌体体表表面面蛋蛋白白质质凝凝固固成成一一层层保保护护膜膜，乙乙醇醇分分子子不不能能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。3.3.微生物实验室培养的基本操作程序微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存三、三、纯化大化大肠杆菌的无菌操作杆菌的无菌操作本本实验使使用用_固固体体培培养养基基进行行大大肠杆杆菌菌的的纯化化培培养养，可可分分成成_和和纯化化大大肠杆菌两个杆菌两个阶段段进行。行。牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨制备培养基制备培养基1制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤：称量称量 倒平板。倒平板。(2)倒平板的过程：倒平板的过程：在火焰旁右手拿锥形瓶，左手在火焰旁右手拿锥形瓶，左手 。右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过 。左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，左手立刻养皿，左手立刻 。待平板冷却凝固后，将平板待平板冷却凝固后，将平板 放置，使皿盖放置，使皿盖在下、皿底在上。在下、皿底在上。计算计算溶化溶化灭菌灭菌拔出棉塞拔出棉塞火焰火焰盖上皿盖盖上皿盖倒过来倒过来1制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基计计算算：依依据据牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨培培养养基基配配方方比比例例，计算配制算配制100 mL 的培养基的培养基时，各种成分的用量，各种成分的用量 称称量量：牛牛肉肉膏膏比比较黏黏稠稠，可可用用称称量量纸称称取取，牛牛肉肉膏膏和和蛋蛋白白胨都都易易吸吸潮潮，称称取取时动作作要要迅迅速速，称称后要及后要及时盖上瓶盖盖上瓶盖无菌检查：将灭菌的培养基放入无菌检查：将灭菌的培养基放入37的温室中培养的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。小时，以检查灭菌是否彻底。倒平板倒平板:微生物培养中有关实验操作的注意事项微生物培养中有关实验操作的注意事项1倒平板操作倒平板操作(1)培培养养基基灭灭菌菌后后，需需冷冷却却至至50 左左右右时时才才能能倒倒平平板，原因是琼脂在板，原因是琼脂在44 以下凝固。以下凝固。(2)培培养养皿皿打打开开一一条条稍稍大大于于瓶瓶口口的的缝缝隙隙，不不要要完完全全打开。打开。(3)整整个个操操作作过过程程要要在在酒酒精精灯灯火火焰焰旁旁进进行行，避避免免杂杂菌污染。菌污染。(4)平平板板冷冷凝凝后后要要倒倒置置的的原原因因：防防止止皿皿盖盖上上的的冷冷凝凝水落入培养基，造成污染。水落入培养基，造成污染。(5)若倒平板时，培养基溅在皿盖和皿底之间的部若倒平板时，培养基溅在皿盖和皿底之间的部位，这个平板应丢弃。位，这个平板应丢弃。倒平板操作讨论题倒平板操作讨论题1培培养养基基灭菌菌后后，需需要要冷冷却却到到50 左左右右时，才才能能用用来来倒倒平平板板。你你用用什什么么办法法来来估估计培培养养基基的的温度？温度？答答案案可可以以用用手手触触摸摸盛盛有有培培养养基基的的锥形形瓶瓶，感感觉锥形形瓶瓶的的温温度度下下降降到到刚刚不不烫手手时，就就可可以以进行倒平板了。行倒平板了。2为什么需要使什么需要使锥形瓶的瓶口通形瓶的瓶口通过火焰？火焰？答答案案通通过灼灼烧灭菌菌，防防止止瓶瓶口口的的微微生生物物污染染培养基。培养基。3平板冷凝后，平板冷凝后，为什么要将平板倒置？什么要将平板倒置？答答案案平平板板冷冷凝凝后后，皿皿盖盖上上会会凝凝结水水珠珠，凝凝固固后后的的培培养养基基表表面面的的湿湿度度也也比比较高高，将将平平板板倒倒置置，既既可可以以使使培培养养基基表表面面的的水水分分更更好好地地挥发，又又可可以以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。染。4在在倒倒平平板板的的过程程中中，如如果果不不小小心心将将培培养养基基溅在在皿皿盖盖与与皿皿底底之之间的的部部位位，这个个平平板板还能能用用来来培养微生物培养微生物吗？为什么？什么？答答案案空空气气中中的的微微生生物物可可能能在在皿皿盖盖与与皿皿底底之之间的的培培养养基基上上滋滋生生，因因此此最最好好不不要要用用这个个平平板板培培养养微生物。微生物。（二）、纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法 平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.微生物的接种技术微生物的接种技术菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落落。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落细菌的菌落特征因种而异 霉菌的菌落特征因种而异菌落接种环接种针 平板划线的操作方法交叉划线法连续划线法 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。涂布器 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养四、课题成果评价（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，(在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐)则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，(在某培养基上出现了3种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。)则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。微生物的恒温培养微生物的恒温培养31培养未接种培养基的作用是培养未接种培养基的作用是对照对照，若有菌落形成，说明培养，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。基灭菌不彻底。32在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白白色，为圆形，光滑有光色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。泽，边缘整齐。33培养培养12h和和24h后的菌落大小后的菌落大小不同不同（相同、不同）；菌落分（相同、不同）；菌落分布位置布位置相同相同（相同、不同）。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖（相同、不同）。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。34在某培养基上出现了在某培养基上出现了3种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。不彻底或杂菌感染等。n结果分析与评价n课题延伸（P20）菌种的保存1、临时保藏法对象：温度：缺点：2、甘油管藏法：对象：温度：频繁使用的菌种 4（冰箱）容易被污染或产生变异 长期保存的菌种-20（冷冻箱）本课题知识小结:【典例解析】例1关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量 解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。答案：D例2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确不正确的是A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前答案：B 解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是A正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。