微生物学实验课件

微生物学实验实验一实验一 显微镜油镜的使显微镜油镜的使用和细菌形态的观察用和细菌形态的观察v目的要求目的要求v显微镜油镜使用的原理显微镜油镜使用的原理v实验材料实验材料v实验程序实验程序v思考题思考题目目 的的 要要 求求v学习并掌握显微镜油镜的使用技术及维护的学习并掌握显微镜油镜的使用技术及维护的基本知识基本知识v使用油镜观察细菌的几种基本形态使用油镜观察细菌的几种基本形态v用悬滴法在高倍镜或油镜下观察细菌的运动用悬滴法在高倍镜或油镜下观察细菌的运动显微镜油镜使用的原理显微镜油镜使用的原理v普通光学显微镜普通光学显微镜v欧林巴斯（欧林巴斯（OLYMPUS）生物显微镜）生物显微镜v欧林巴斯（欧林巴斯（OLYMPUS）相差显微镜）相差显微镜普通光学显微镜普通光学显微镜v显微镜的构造显微镜的构造 1.光学部分光学部分:接目镜接目镜、接物镜接物镜、照明装置照明装置(聚光镜、聚光镜、虹彩光圈、虹彩光圈、反光镜等反光镜等).它它使检视物放大使检视物放大,造成物象造成物象.2.机械部分机械部分:镜座、镜臂、镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件细调节器等部件.它起着支它起着支持持 调节调节 固定等作用固定等作用.普通光学显微镜普通光学显微镜v显微镜的放大倍数和分辨率显微镜的放大倍数和分辨率1.放大倍数放大倍数=接物镜放大倍数接物镜放大倍数接接目镜放大倍数目镜放大倍数 2.显微镜的分辨率显微镜的分辨率 是表示显微是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：离的能力，可用公式表示为：D=/2nsin(/2)式中式中D D：物镜分辨出物体两点间物镜分辨出物体两点间的最短距离。的最短距离。：可见光的波长（平均可见光的波长（平均0.550.55 m)m)n:n:物镜和被检标本间介质的折物镜和被检标本间介质的折射率。射率。：镜口角（即入射角）。镜口角（即入射角）。普通光学显微镜普通光学显微镜v油镜使用的原理油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。当油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增，则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。使物象更加清晰。实实 验验 材材 料料v显微镜（显微镜灯）、香柏油、二甲苯、擦显微镜（显微镜灯）、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。镜纸、吸水纸等。v细菌三种形态的染色标本。细菌三种形态的染色标本。v培养培养1218h的枯草杆菌（的枯草杆菌（B.subtilisB.subtilis)v盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。实验程序实验程序（显微镜的使用）（显微镜的使用）v主要是油镜的使用主要是油镜的使用 1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。2.调节光亮度调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。油中，细调至看清物象为止。6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。换片：另换新片，必须从第三条开始操作。7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。全部复原。实验程序实验程序（显微镜的使用）（显微镜的使用）v显微镜保养和使用中的注意事项：显微镜保养和使用中的注意事项：1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。图。5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。可单手拿，更不可倾斜拿。6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片腐蚀镜片。实验程序实验程序IIIv细菌三种基本形态的观察：细菌三种基本形态的观察：菌落形态观察和个体形态观察，这里主要指菌落形态观察和个体形态观察，这里主要指个体形态的观察。个体形态的观察。1.结合油镜的使用，观察三张细菌染色片（球结合油镜的使用，观察三张细菌染色片（球状菌、杆状菌、和螺旋状菌），边观察边绘图。状菌、杆状菌、和螺旋状菌），边观察边绘图。2.看示范镜：观察双球菌、四联球菌，并绘图。看示范镜：观察双球菌、四联球菌，并绘图。实验程序实验程序细菌运动性的观察（示范）：细菌运动性的观察（示范）：一般采用水浸片法、悬滴法、一般采用水浸片法、悬滴法、半固体培养法，常用水浸法和半固体培养法，常用水浸法和悬滴法来观察细菌的运动性。悬滴法来观察细菌的运动性。1.水浸片法水浸片法 2.悬滴法悬滴法思思 考考 题题v油镜与普通物镜在使用方法上有何不同油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？应特别注意些什么？v使用油镜时，为什么必须用镜头油？使用油镜时，为什么必须用镜头油？v镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？而不是直接用高倍镜或油镜观察？实验二实验二 细菌简单染色细菌简单染色一一.实验目的和内容实验目的和内容v目的：巩固无菌操作技术，掌握细菌的涂片目的：巩固无菌操作技术，掌握细菌的涂片和单染色技术，了解口腔中的微生物及其观和单染色技术，了解口腔中的微生物及其观v察方法。察方法。v内容：内容：1、细菌单染色操作技术、细菌单染色操作技术v2、染色法或负染色法观察口腔中的微生物、染色法或负染色法观察口腔中的微生物二二.实验材料和用具实验材料和用具v 大肠杆菌大肠杆菌(Ecoli)、金黄色葡萄球、金黄色葡萄球菌菌(Staphylococcusaureus)的斜面菌种。的斜面菌种。v 吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水、显微镜、擦镜纸、接种环、酒无菌水、显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。v1、涂片、涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约115Cm2(图图71A、B)。v2、干燥、干燥 将涂片于室温中自然干燥将涂片于室温中自然干燥v3、固定、固定 手执载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火手执载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火23次。次。在火上固定，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上固定，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，在火上烤，否则细菌形态毁坏否则细菌形态毁坏(图图71 C)。v4、染色、染色 将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2rain(图图71Dv5、水洗、水洗 倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止(图图71 E)。v6、干燥、干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体(图图71F)。v7、待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野、待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用拍中央，再用拍v四、注意事项四、注意事项v载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄实验三实验三 细菌的革兰氏染色法细菌的革兰氏染色法一、目的要求一、目的要求学习并掌握革兰氏染色的方法。二、实验材料二、实验材料1.菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。2.染料：草酸铵结晶紫液、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液。3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯等。三、基本原理三、基本原理革兰氏染色法是细菌学中广泛使用革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。的一种鉴别染色法。1884年由丹麦医师年由丹麦医师Gram创立。创立。细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌紫色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G-）。为观察方便，脱色后再用一种红色染料，如为观察方便，脱色后再用一种红色染料，如碱性番红等进行复染。阳性菌仍带紫色，碱性番红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽孢的杆菌和绝阴性菌则被染上红色。有芽孢的杆菌和绝大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都成革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数成革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都成负反应。致病性的无芽孢杆菌都成负反应。革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。反应不一样。一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度低，吸附染色，阴性菌复合物结合程度低，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。据。另外，与细菌细胞壁的化学组成及结另外，与细菌细胞壁的化学组成及结构有关。构有关。革兰氏阳性细菌由于细胞壁肽聚糖含量高，革兰氏阳性细菌由于细胞壁肽聚糖含量高，脂类含量低，乙醇处理使细胞壁脱水，肽脂类含量低，乙醇处理使细胞壁脱水，肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫碘聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫碘复合物被保留在细胞内，细胞不被脱色。复合物被保留在细胞内，细胞不被脱色。v革兰氏阴性菌细胞壁脂类物质含量高，革兰氏阴性菌细胞壁脂类物质含量高，肽聚糖含量较低，乙醇溶解了脂类物质，肽聚糖含量较低，乙醇溶解了脂类物质，使细胞壁通透性增加，结晶紫使细胞壁通透性增加，结晶紫碘复碘复合物易被抽出，于是被脱色。合物易被抽出，于是被脱色。再有阳性菌菌体等电点较阴性菌低，再有阳性菌菌体等电点较阴性菌低，在相同在相同pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料较多，因此不易脱去，阴性菌则相性染料较多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。反。所以染色时的条件要严格控制。四、方法与步骤四、方法与步骤操作过程如下：操作过程如下：涂片涂片干燥干燥固定固定草酸铵结晶紫染色草酸铵结晶紫染色（1min）水洗水洗路哥氏碘液媒染路哥氏碘液媒染（1min）水洗水洗95%乙醇脱色乙醇脱色（30s）水洗水洗番红复染（番红复染（1min）水水洗洗干燥干燥镜检。镜检。关键点：关键点：严格掌握严格掌握乙醇脱色程度乙醇脱色程度，如脱色过度，如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时，则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌。阴性菌被误染为阳性菌。菌龄菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养也影响染色结果，如阳性菌培养时间很长，或已死亡及部分自行溶解了，时间很长，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应。都常呈阴性反应。五、实验内容五、实验内容1.对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡 萄球菌分别进行革兰氏染色。萄球菌分别进行革兰氏染色。2.对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合涂片进对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合涂片进 行革兰氏染色。行革兰氏染色。大肠杆菌（大肠杆菌（G-）枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（G+）金黄色葡萄球菌与大肠杆菌金黄色葡萄球菌与大肠杆菌六、实验思考题六、实验思考题1.绘出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄绘出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄 球菌的形态图，注明放大倍数及颜色。球菌的形态图，注明放大倍数及颜色。2.为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不能为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不能 超过超过24小时？小时？3.你的实验结果与课本中所述是否一致？如果你的实验结果与课本中所述是否一致？如果 不一致，试分析原因。不一致，试分析原因。4.当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样 才能确保你的操作正确，结果可靠？才能确保你的操作正确，结果可靠？实验四实验四 放线菌、霉菌形态的观察放线菌、霉菌形态的观察 实验目的：实验目的：v学习丝状微生物制片和染色技术；学习丝状微生物制片和染色技术；v观察和掌握典型放线菌、重要霉菌和酵母观察和掌握典型放线菌、重要霉菌和酵母菌的形态结构特征菌的形态结构特征 一、实验材料一、实验材料v1 1、细黄链霉菌、细黄链霉菌54065406平板、插片培养材料。平板、插片培养材料。v2 2、黑曲霉、青霉、毛霉平板培养材料和湿室培养材料。、黑曲霉、青霉、毛霉平板培养材料和湿室培养材料。v3 3、黑根霉（面包霉）装片、黑根霉（面包霉）装片v4 4、酿酒酵母菌菌液、酿酒酵母菌菌液放线菌形态结构放线菌形态结构v是一类具有是一类具有丝状分枝细丝状分枝细胞的革兰氏胞的革兰氏阳性细菌，阳性细菌，因菌落呈放因菌落呈放射状而得名。射状而得名。放线菌的形态和大小放线菌的形态和大小 v放线菌呈分枝丝状放线菌呈分枝丝状 v菌丝无隔膜，单细胞菌丝无隔膜，单细胞v菌丝直径与细菌相似，菌丝直径与细菌相似，小于小于1微米微米 放线菌菌丝形态和功能菌丝形态和功能v菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为基基内菌丝内菌丝、气、气生菌丝生菌丝和和孢子丝孢子丝三种三种产生无性孢子是放线菌主要的繁殖方式。产生无性孢子是放线菌主要的繁殖方式。问问 题题v如果按照细菌的制片方法观察放线菌，如果按照细菌的制片方法观察放线菌，看到的情况如何？看到的情况如何？v如果要观察放线菌全貌，可采取什么方如果要观察放线菌全貌，可采取什么方法？法？放线菌的培养与放线菌的培养与观察方法观察方法 v插片法插片法-水封片法水封片法v玻璃纸法玻璃纸法v压片法压片法v影印法影印法霉菌的形态结构观察l霉菌（霉菌（mould，mold）凡生长在营养基质上形成绒凡生长在营养基质上形成绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的小型真菌，统称为霉菌。毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的小型真菌，统称为霉菌。霉霉菌菌的的营营养养体体由由分分支支或或不不分分支支的的菌菌丝丝构构成成。许许多多菌菌丝丝相相互互交交织织形形成成菌菌丝丝体体。菌菌丝丝的的大大小小：直直径径约约为为 2 10m，在在光光学学显显微微镜下，菌丝细胞呈管状。镜下，菌丝细胞呈管状。霉菌的形态和大小霉菌的形态和大小霉菌的菌丝霉菌的菌丝v从结构来看，霉菌的菌丝有两种：从结构来看，霉菌的菌丝有两种：v无无隔隔菌菌丝丝：低低等等霉霉菌菌如如根根霉霉、毛毛霉等霉等v有有隔隔菌菌丝丝：高高等等霉霉菌菌如如青青霉霉、曲曲霉等霉等v在功能上，霉菌的菌丝已在功能上，霉菌的菌丝已有分化，可分为：有分化，可分为：营养菌丝：营养菌丝：气生菌丝：气生菌丝：繁殖菌丝：繁殖菌丝：霉菌的繁殖方式和繁殖结构霉菌的繁殖方式和繁殖结构v霉菌主要靠形成各种无性孢子和有性孢子进行繁殖。v霉菌的无性孢子J厚垣孢子J节孢子J分生孢子J孢囊孢子 根根 霉霉v产淀粉酶等，产淀粉酶等，用于甜酒的酿制用于甜酒的酿制v生产多种有机生产多种有机酸酸v转化甾体类物转化甾体类物质质 毛毛 霉霉v产蛋白酶、淀产蛋白酶、淀粉酶等，用于腐粉酶等，用于腐乳的酿制乳的酿制v生产多种有机生产多种有机酸酸v转化甾体类物转化甾体类物质质曲曲 霉霉v产蛋白酶、淀产蛋白酶、淀粉酶等，用于酱粉酶等，用于酱油的酿制油的酿制v生产多种有机生产多种有机酸酸v产毒素产毒素青青 霉霉v生产青霉素v纤维素酶和有机酸等v果品腐烂v产生毒素l青霉菌菌丝与曲霉相似，但无足细胞。青霉菌菌丝与曲霉相似，但无足细胞。l分生孢子梗顶端不膨大，无顶囊。分生孢子梗顶端不膨大，无顶囊。l分生孢子小梗多次分枝呈扫帚状。分生孢子小梗多次分枝呈扫帚状。l分生孢子颜色为青绿色。分生孢子颜色为青绿色。霉菌的培养观察方法v霉菌的载玻片湿室培养与观察霉菌的载玻片湿室培养与观察p62-63v根霉假根的培养根霉假根的培养v粘片观察粘片观察v简易观察简易观察 二、实验内容与要求二、实验内容与要求1、观察细黄链霉菌插片法培养材料、观察细黄链霉菌插片法培养材料2、用压片法观察细黄链霉菌菌丝、用压片法观察细黄链霉菌菌丝3、观察黑根霉插片法培养材料（菌丝有无横隔、孢囊和孢囊孢子大小形态、观察黑根霉插片法培养材料（菌丝有无横隔、孢囊和孢囊孢子大小形态、假根、囊托和囊轴），假根、囊托和囊轴），4、观察毛霉湿室培养材料（菌丝有无横隔、孢囊和孢囊孢子、有无假根、观察毛霉湿室培养材料（菌丝有无横隔、孢囊和孢囊孢子、有无假根、囊托和囊轴）囊托和囊轴）5、观察自制黑曲霉装片和湿室培养材料（菌丝有无横隔、分生孢子梗着生、观察自制黑曲霉装片和湿室培养材料（菌丝有无横隔、分生孢子梗着生位置、顶囊、分生孢子的位置、足细胞等）位置、顶囊、分生孢子的位置、足细胞等）6、观察、观察青霉青霉湿室培养材料湿室培养材料（菌丝有无横隔、分生孢子梗和分生孢子穗形态、（菌丝有无横隔、分生孢子梗和分生孢子穗形态、有无足细胞等）有无足细胞等）7、水浸片法（美兰染色法）观察酵母菌形态、大小、芽殖、计算酵母细胞、水浸片法（美兰染色法）观察酵母菌形态、大小、芽殖、计算酵母细胞的存活率。的存活率。实验报告v绘出5406放线菌、黑根霉、黑曲霉、青霉、毛霉的形态结构，注意标明各部分名称。v除了培养特征外，请设计一个方案可快速地从显微特征方面把根霉、毛霉、曲霉和青霉鉴定出来。实验七实验七 酵母菌的形态观察酵母菌的形态观察 目的要求：目的要求：1、观察酵母菌的形态及出芽生殖，、观察酵母菌的形态及出芽生殖，2、学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。、学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。v1、基本原理：、基本原理：v酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，大多数酵母菌以出芽酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有性繁殖通过接合产生子囊孢子。方式进行无性繁殖，有性繁殖通过接合产生子囊孢子。v美蓝是一种无毒性的染料。它的氧化型呈蓝色，还原型无色。美蓝是一种无毒性的染料。它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此酵母活细胞是无色的，而死细胞或变为无色的还原型。因此酵母活细胞是无色的，而死细胞或衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，以此进行鉴别。衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，以此进行鉴别。v美蓝浸片的观察：美蓝浸片的观察：（1）在载玻片中央加一滴0.05%吕氏碱性美蓝染色液，用滴管取1滴酵母菌菌液于染液中，混合均匀。（2）加盖玻片。注：不要产生气泡注：不要产生气泡。（3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色区别死、活细胞。（4）染色约0.5h后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。（5）绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征，并计算0.5h后酵母菌的死亡率。酵母菌实验六培养基的配制与灭菌实验六培养基的配制与灭菌 了解配制微生物培养基的基本原理；掌握配制、了解配制微生物培养基的基本原理；掌握配制、分装培养基的方法。通过常用细菌培养基的配制，分装培养基的方法。通过常用细菌培养基的配制，了解常规配制培养基的方法；并学会各类物品的包了解常规配制培养基的方法；并学会各类物品的包装、配制和灭菌。装、配制和灭菌。1.1.实验目的实验目的2.2.实验原理实验原理 本实验除了配制培养基以外，还必本实验除了配制培养基以外，还必须准备各种无菌物品，包括培养皿、须准备各种无菌物品，包括培养皿、移液管的包装，稀释水的准备等。移液管的包装，稀释水的准备等。3.3.实验方法和步骤实验方法和步骤 （1 1）玻璃器皿的准备）玻璃器皿的准备 培养皿的包装、移液管的包装培养皿的包装、移液管的包装 、棉塞的制作、棉塞的制作 、稀释水的配制、稀释水的配制 （2 2）培养基的配制）培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基的配方：牛肉膏牛肉膏蛋白胨培养基的配方：牛肉膏0.3g0.3g，蛋，蛋白胨白胨1g1g，NaCl0.5gNaCl0.5g，琼脂，琼脂2.0g2.0g，水，水100ml100ml，pH pH 7.2-7.47.2-7.4。灭菌条件：灭菌条件：121121，151520min20min。称量、加热溶解称量、加热溶解 、调节、调节pH pH、分装、加棉塞、斜面分装、加棉塞、斜面 、灭菌、灭菌 思考题思考题 了解加压蒸汽灭菌的原理和方法。了解加压蒸汽灭菌的原理和方法。配制培养基的基本步骤有哪些配制培养基的基本步骤有哪些?应注意什么问题应注意什么问题?实验七微生物直接计数法（血球计数板）一、目的要求二、基本原理：此法是利用血球计数板在显微镜下直接进行测定。它观察在一定的容积中的微生物的个体数目，然后推算出含菌数，包括死活细胞均被计算在内，还有微小杂物也被计算在内。这样得出结果往往偏高。这种方法常用于形态个体较大的菌体或孢子。v计数板是一块特制的厚玻璃片，玻片上有四个槽构成三个平台，中央平台又由一短槽隔成两半，其上各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数室。v计数室刻度有2种：一种是25中格X16小格，而另一种为16中格X25小格，它们都是由400个小格组成。每个大方格边长为1mm，则每个大方格面积为1X1=1mm2。盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间高度为0.1mm,所以每个计数室的体积为0.1X1X1=0.1mm3,每个大格有400个小格，所以每个小方格体积为0.1/400=1/4000mm3=1/4000,000ml。*#三、材料与仪器：v1、待测样品：酵母菌悬液v2、显微镜，血球计数板，接种环,盖玻片等。四、方法与步骤:v1、取洁净的血球计数板，在计数室上面盖上盖玻片。v2、取稀释到一定程度（510个酵母/小格）酵母液，从盖片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不能有气泡。先在低倍镜下找到小方格网后，再转换高倍镜观察并计数。3、如用16X25计数板，只计四个角上中方格的菌数。若是25X16的计数板，除计数四个角上的中格菌数外，还要计算中央中格的菌数。每个样品重复计数23次。计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体。v4、位于格线上的酵母菌一般只计此格的上方线及左方线上的菌体。v5、计数方法：v样品中菌数/ml=每小格平均菌数x4000,000 x稀释倍数，本实验采用25x16规格，要求数这些方格中的全部小格即80个小格。v设：每个中方格的菌数为A，则v每小格平均菌数=（A1+A2+A3+A4+A5)/80vA1+A2+A3+A4+A5v样品中的菌数/ml=X4000,000X稀释倍数v80结果记录：v微生物名称总菌数个/ml第一个中格第二个中格第三个中格第四个中格第五个中格第一次测定第二次测定平均四、测定注意事项:v1、测定时，酵母菌液要摇匀，防止酵母凝聚沉淀。v2、活酵母有芽殖现象，若芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为两个菌体计数，若芽体小于母细胞一半时为1个酵母细胞。v3、位于格线上的酵母菌一般只计此格的上方线及左方线上的菌体。五、思考题：v1、用血球计数板计数时，哪些步骤易造成误差？v2、血球计数板测定原理是什么？它有哪些优点？实验八、化学药物对微生物的作用实验八、化学药物对微生物的作用v一、实验目的：一、实验目的：v了解抗生素对微生物的杀灭作用。了解抗生素对微生物的杀灭作用。v二、实验原理：二、实验原理：v抗生素等抗生素等 化学药物对微生物具有抑制或杀灭作用。因此在实化学药物对微生物具有抑制或杀灭作用。因此在实际生活中常用化学药物进行杀菌。不同种类的化学物质对微际生活中常用化学药物进行杀菌。不同种类的化学物质对微生物的杀菌能力不一样，作用条件也有差别，其效果也不同，生物的杀菌能力不一样，作用条件也有差别，其效果也不同，在使用时需要灵活选择。在使用时需要灵活选择。v三、实验器材：三、实验器材：v1.活材料：大肠杆菌、枯草杆菌斜面菌种。活材料：大肠杆菌、枯草杆菌斜面菌种。v2.培养基及试剂：牛肉膏蛋白胨培养基、培养基及试剂：牛肉膏蛋白胨培养基、HgCl2、庆大霉素、庆大霉素和青霉素。和青霉素。v3.器材：无菌平皿、无菌水、无菌吸管、玻璃刮铲、无菌器材：无菌平皿、无菌水、无菌吸管、玻璃刮铲、无菌镊子、无菌圆形滤纸片。镊子、无菌圆形滤纸片。v四、实验方法：四、实验方法：v1.倒平板：将牛肉膏蛋白胨培养基按无菌操作法倒入平皿倒平板：将牛肉膏蛋白胨培养基按无菌操作法倒入平皿使其冷却成平板。使其冷却成平板。v2.制备菌悬液：取无菌水制备菌悬液：取无菌水2支，用接种环分别取大肠杆菌和支，用接种环分别取大肠杆菌和枯草杆菌各枯草杆菌各2环接入无菌水，充分混匀制成菌悬液。环接入无菌水，充分混匀制成菌悬液。v3.接种：用无菌吸管分别吸取已制好的菌悬液接种：用无菌吸管分别吸取已制好的菌悬液0.1mL接种接种于平板上，用无菌玻璃刮铲涂匀。于平板上，用无菌玻璃刮铲涂匀。v4.加药剂：将灭菌滤纸片浸入供试药剂中吸取药液，然后加药剂：将灭菌滤纸片浸入供试药剂中吸取药液，然后将滤纸片取出（将药液沥干），然后将滤纸片平铺于平板将滤纸片取出（将药液沥干），然后将滤纸片平铺于平板上，并在平板上做标记。（注意不同药剂之间保持一定的上，并在平板上做标记。（注意不同药剂之间保持一定的距离）。距离）。v5.培养：将平皿置于28下培养48h后观察结果。v五、作业：v取出培养皿，观察滤纸片周围有无抑菌圈生成，并测量抑菌圈的大小，将测量结果填入下表。不同抗生素对细菌的抑菌效果（抑菌圈直径）细细 菌菌化学药物化学药物庆大霉素庆大霉素庆大霉素庆大霉素青霉素青霉素青霉素青霉素HgClHgCl2 2大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌枯草杆菌实验九实验九 土壤微生物的分离和培养（综合实验）土壤微生物的分离和培养（综合实验）v目的要求目的要求v实验原理实验原理v实验材料实验材料v实验步骤实验步骤v实验结果实验结果v思考题思考题目的要求目的要求v初步掌握微生物的分离、培养和菌种的基初步掌握微生物的分离、培养和菌种的基本方法。本方法。v练习微生物接种、移植和培养的基本技术，练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。掌握无菌操作技术。实验原理实验原理v土壤是微生物生活的大本营，为了获得某种土壤是微生物生活的大本营，为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂，淘汰适宜的培养条件，或加入某种抑制剂，淘汰其他一些不需要的微生物，再用各种方法分其他一些不需要的微生物，再用各种方法分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。稀释涂板法、稀释混合平板法、划线分离实验材料实验材料v样品：样品：新鲜土壤。新鲜土壤。v培养基：培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。v无菌水：无菌水：带有玻璃珠装有带有玻璃珠装有45mL无菌水三角瓶、装无菌水三角瓶、装有有9mL无菌水的试管。无菌水的试管。v其它：其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴。电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴。v试剂：试剂：1万万U/mL链霉素液、链霉素液、10苯酚苯酚实验步骤实验步骤v稀释涂板法稀释涂板法v稀释混合平板法（混菌法）稀释混合平板法（混菌法）v划线分离划线分离v微生物的培养微生物的培养n制平板：制平板：每组制培养每组制培养皿皿3付。付。在无菌培养皿底部注明分离菌名、稀释度、组别、班级。实验步骤1（微生物的分离稀释涂平板法）v制备土壤稀释液：制备土壤稀释液：(无菌操作过程见教师示范）无菌操作过程见教师示范）1.称取土壤称取土壤5g，放入放入45mL无菌水的三角瓶中，振荡无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释即为稀释101的土壤悬液。的土壤悬液。2.另取装有另取装有9mL无菌水试管无菌水试管5支，用记号笔编上支，用记号笔编上102、103、104、105、106。取已稀释成。取已稀释成101的土壤液，振的土壤液，振荡后静止荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入土壤悬液加入102的无菌水的试管中，并在试管内的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸轻轻吹吸数次，使之充分数次，使之充分混匀，即成混匀，即成102土壤稀释液。同法依次连续稀释至土壤稀释液。同法依次连续稀释至104、105、106土壤稀释液。土壤稀释液。v在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管图图1 土壤稀土壤稀释液的制备和稀释液的制备和稀释液的取样释液的取样v吸取稀释液吸取稀释液取一吸管，以无菌操作法分别吸取104、105、106土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。v涂板涂板用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。v计算出每克土壤中细菌的数量。计算出每克土壤中细菌的数量。即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得。v挑取单个菌落，进行划线分离。挑取单个菌落，进行划线分离。实验程序实验程序7 （微生物的分离（微生物的分离平板涂抹法）平板涂抹法）实验程序2（微生物的分离混菌法）v制平板制平板v吸取稀释液吸取稀释液取一吸管，以无菌操作法分别吸取104、105、106土壤稀释液0.1mL，加在空培养皿中。v混菌混菌水平轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒温培养箱培养。v计算出每克土壤中放线菌的数量。计算出每克土壤中放线菌的数量。v挑取单个菌落，进行划线分离。挑取单个菌落，进行划线分离。实验程序3（微生物的分离平板划线法）v制成平板。制成平板。v凝固后，用接种环取相应的菌液一环（凝固后，用接种环取相应的菌液一环（101）在平板上划）在平板上划线。线。1.连续划线法：连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于连续划线。完毕后，倒置于28300C温室培养。温室培养。2.分区划线法：分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，环，先在培养基的一边作第一次平行划线先在培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养条，再转动培养皿约皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。v挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。最后得到纯培养。实验程序实验程序10 （微生物的接种方法）（微生物的接种方法）v接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。试管深层固体培养基的穿刺接种法。v接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等（见图铲或接种锄、玻璃涂棒等（见图6）。）。图6思思 考考 题题v平板培养时为什么要把培养皿倒置？平板培养时为什么要把培养皿倒置？v在划线分离时，为什么每次都需要将接种环在划线分离时，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？上的剩余物烧掉？实验十实验十 水质的微生物检测（综合实验）水质的微生物检测（综合实验）实验目的实验目的v了解水质微生物检验的原理了解水质微生物检验的原理v学习测定水中大肠菌群数量的多管学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法发酵法v水中细菌总数的测定水中细菌总数的测定平板菌落计数平板菌落计数法法v水中大肠菌群数量的测定水中大肠菌群数量的测定水中大肠菌群数量的测定水中大肠菌群数量的测定v大肠菌群大肠菌群能在能在37 24-48h37 24-48h内发酵乳糖产内发酵乳糖产酸与产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽酸与产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。孢杆菌。v主要包括埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌主要包括埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属的细菌。属、克雷伯氏菌属的细菌。v粪便中存在大量的大肠菌群细菌，在水体中存粪便中存在大量的大肠菌群细菌，在水体中存活的时间和对氯的抵抗力与肠道致病菌，如沙活的时间和对氯的抵抗力与肠道致病菌，如沙门氏菌、志贺氏菌相似。易于培养和观察。门氏菌、志贺氏菌相似。易于培养和观察。典型菌落典型菌落产气产气报告为大肠菌群阳性报告为大肠菌群阳性不产气不产气报告为大肠菌群阴性报告为大肠菌群阴性乳糖蛋白胨培养基乳糖蛋白胨培养基乳糖蛋白胨培养基乳糖蛋白胨培养基乳糖起选择作用；溴甲酚紫起产酸指示，还有抑制其他细菌作用乳糖起选择作用；溴甲酚紫起产酸指示，还有抑制其他细菌作用实验方法和步骤实验方法和步骤v 1 1水样的采取水样的采取v自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼3 3min灭菌，再开灭菌，再开放水龙头使水流放水龙头使水流5 min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。以待分析。v池水、河水或湖水：应取距水面池水、河水或湖水：应取距水面10-15 cm的的深层水样，深层水样，先将灭菌的带塞玻璃瓶，瓶口向下浸人水中，然后翻先将灭菌的带塞玻璃瓶，瓶口向下浸人水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流人瓶中，盛满后，将瓶转过来，除去玻璃塞，水即流人瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放人塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放人冰箱中保存。冰箱中保存。多管发酵法检测水样中大肠菌群多管发酵法检测水样中大肠菌群v自来水检查自来水检查v初发酵试验初发酵试验接种水样总量为接种水样总量为300ml300ml：在：在2个含有个含有50 ml三三倍浓缩的乳糖蛋白脉发酵烧瓶中，各加入倍浓缩的乳糖蛋白脉发酵烧瓶中，各加入100 ml水样。水样。在在10支含有支含有5 ml三倍浓缩乳糖蛋白陈发酵管中，各加入三倍浓缩乳糖蛋白陈发酵管中，各加入10 ml水样。混匀后，水样。混匀后，37培养培养24h，24 h未产气的继续未产气的继续培养至培养至48 h。通过平板分离、涂片、染色、镜检和复发。通过平板分离、涂片、染色、镜检和复发酵试验检查各发酵管（瓶）中是否有大肠菌群存在。酵试验检查各发酵管（瓶）中是否有大肠菌群存在。v 证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查阅（瓶）数查阅接种水样总量为接种水样总量为300ml300ml检数表，检数表，即得大肠菌即得大肠菌群数。群数。MPN 法（法（Most Probable Number）最大可能數）最大可能數法法池水、河水或湖水等的检查池水、河水或湖水等的检查v(1）将水样稀释成）将水样稀释成10-1与与10-2v(2)分别吸取分别吸取lml 10-1与与10-2的稀释水样和的稀释水样和l ml原原水样，各注入装有水样，各注入装有10 ml普通浓度乳糖蛋白胨普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取发酵管中。另取10 ml和和100 ml原水样，分别原水样，分别注人装有注人装有5 ml和和50 ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。酵液的试管（瓶）中。v（3）初发酵实验、平板分离和复发酵实验）初发酵实验、平板分离和复发酵实验v（4）发酵结果查阅接种水样总量为）发酵结果查阅接种水样总量为111.11ml检索表。检索表。实验内容及安排实验内容及安排实验安排实验安排v水样采取水样采取v初发酵试验（第初发酵试验（第1010周完成）周完成）v平板分离平板分离 （第（第1010周完成）周完成）v涂片，革兰氏染色，镜检涂片，革兰氏染色，镜检 （第（第1111周完成）周完成）v复发酵试验复发酵试验 （第（第1111周完成）周完成）综合实验结果综合实验结果v说明多管发酵法检测水样中大肠菌群的原理和操作说明多管发酵法检测水样中大肠菌群的原理和操作过程。过程。v记录并报告实验结果。记录并报告实验结果。v结果分析与讨论，经检查，水样是否合乎饮用标准结果分析与讨论，经检查，水样是否合乎饮用标准？