免疫细胞的分离技术PPT幻灯片课件

免疫细胞的分离免疫细胞的分离12024/6/16免疫细胞的分离12023/8/9免疫细胞免疫细胞v1、概念、概念 直接参与免疫应答及与免疫应答相关的所有细胞。直接参与免疫应答及与免疫应答相关的所有细胞。v2、分类、分类 单核吞噬细胞系统：单核吞噬细胞系统：单核细胞单核细胞 /巨噬细胞巨噬细胞 树突状细胞（树突状细胞（DCs)DCs)淋巴细胞系统：淋巴细胞系统：T T 淋巴细胞淋巴细胞 （Th/Tc)Th/Tc)B B 淋巴细胞淋巴细胞 NK NK 细胞细胞 粒细胞系统粒细胞系统:中性粒细胞中性粒细胞 噬酸性粒细胞噬酸性粒细胞 噬碱性粒细胞噬碱性粒细胞22024/6/16免疫细胞1、概念22023/8/9免疫细胞的分离免疫细胞的分离v人外周血单个核细胞的分离人外周血单个核细胞的分离v淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离v免疫细胞亚群的分离免疫细胞亚群的分离32024/6/16免疫细胞的分离人外周血单个核细胞的分离32023/8/9细胞分离原理细胞分离原理v细胞的大小和比重细胞的大小和比重v细胞表面标志细胞表面标志v细胞黏附于各种物质表面的特性细胞黏附于各种物质表面的特性42024/6/16细胞分离原理细胞的大小和比重42023/8/9 一、人外周血单个核细胞的分离一、人外周血单个核细胞的分离 Ficoll分层离心法人外周血单个核细胞人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC):Monocyte、Lymphocyte。原理：原理：血液中各细胞成分的比重不同，经离心血液中各细胞成分的比重不同，经离心沉淀，即可在分层液与血浆之间获得比较纯的沉淀，即可在分层液与血浆之间获得比较纯的单个核细胞，其中淋巴细胞占单个核细胞，其中淋巴细胞占90%以上。以上。52024/6/16 一、人外周血单个核细胞的分离 不同细胞密度不同不同细胞密度不同 红细胞和多形核白细胞红细胞和多形核白细胞 1.092 单个核细胞单个核细胞 1.070 分层液分层液 1.07762024/6/16不同细胞密度不同 红细胞和多形核白细胞 1.092一、人外周血单个核细胞的分离一、人外周血单个核细胞的分离 Ficoll分层离心法Ficoll分层液：蔗糖聚合物+泛影葡胺，密度1.077+0.001g/L。72024/6/16一、人外周血单个核细胞的分离 二、淋巴细胞的分离二、淋巴细胞的分离v尼龙棉柱法尼龙棉柱法vE花环分离法花环分离法v补体细胞毒法免疫荧补体细胞毒法免疫荧光法光法 82024/6/16二、淋巴细胞的分离尼龙棉柱法82023/8/9二、淋巴细胞的分离二、淋巴细胞的分离 尼龙棉柱法尼龙棉柱法原理原理：B细胞和单核细胞具有细胞和单核细胞具有易黏附易黏附的特性，的特性，将淋巴细胞悬液加至尼龙纤维柱上，将淋巴细胞悬液加至尼龙纤维柱上，37 作作用用12h后，洗脱的为非黏附性的后，洗脱的为非黏附性的T细胞。细胞。PBMC尼龙纤尼龙纤维棉柱维棉柱B细胞细胞单核细胞单核细胞T细胞细胞92024/6/16二、淋巴细胞的分离 二、淋巴细胞的分离二、淋巴细胞的分离 E花环分离法（纯化花环分离法（纯化T细胞）细胞）原理原理成熟成熟成熟成熟T T细胞表面有绵羊红细胞受体（细胞表面有绵羊红细胞受体（细胞表面有绵羊红细胞受体（细胞表面有绵羊红细胞受体（E E受体，受体，受体，受体，CD2CD2分分分分子），可和子），可和子），可和子），可和SRBCSRBC形成形成形成形成E E花环，花环，花环，花环，B B细胞则无。细胞则无。细胞则无。细胞则无。E E花环比重大，沉淀，经分离液分离来。花环比重大，沉淀，经分离液分离来。花环比重大，沉淀，经分离液分离来。花环比重大，沉淀，经分离液分离来。E E花环周围的绵羊花环周围的绵羊花环周围的绵羊花环周围的绵羊RBCRBC可可可可 用低渗法除去。用低渗法除去。用低渗法除去。用低渗法除去。10 二、淋巴细胞的分离 三、免疫细胞亚群的分离三、免疫细胞亚群的分离v免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法v流式细胞术流式细胞术112024/6/16三、免疫细胞亚群的分离免疫磁珠分离法112023/8/9三、免疫细胞亚群的分离三、免疫细胞亚群的分离 免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法原理：原理：将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB），免疫磁），免疫磁珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞相连，相连，在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的。分离的目的。2024/6/1612免疫细胞的分离12三、免疫细胞亚群的分离 三、免疫细胞亚群的分离三、免疫细胞亚群的分离 免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法v1.直接法：抗细胞表面分子抗体+磁性微球 免疫磁珠免疫磁珠+细胞悬液 与免疫磁珠结合的细胞v2.间接法：第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞 特定细胞13 三、免疫细胞亚群的分离 14141515免疫磁珠法分选装置免疫磁珠法分选装置16免疫磁珠法分选装置16三、免疫细胞亚群的分离三、免疫细胞亚群的分离 流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）FCM将将免免疫疫荧荧光光技技术术应应用用于于流流式式细细胞胞仪仪，对对单单个个细细胞胞的的表表面面标标志志（抗抗原原或或受受体体）进进行行快快速速、精精确确的的分分析析和和自自动动检检测测，并并将将不同类型的细胞分选收集。不同类型的细胞分选收集。原原理理：细细胞胞经经荧荧光光染染色色后后，通通过过高高速速流流动动系系统统，细细胞胞排排成成单单行行，逐逐个个流流经经检检测测区区。当当细细胞胞从从流流动动室室喷喷嘴嘴处处流流出出时时，超超声声震震动动液液流流，使使液液流流段段裂裂成成一一连连串串的的均均匀匀小小滴滴，每每个个小小滴滴内内最最多多含含一一个个细细胞胞，细细胞胞经经激激光光束束照照射射产产生生荧荧光光和和散散射射光光，由由光光电电倍倍增增管管接接收收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞类型。转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞类型。172024/6/16三、免疫细胞亚群的分离 流式细胞术（流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理182024/6/16流式细胞仪工作原理182023/8/9流式细胞仪流式细胞仪192024/6/16流式细胞仪192023/8/9免疫细胞的分离免疫细胞的分离v人外周血单个核细胞的分离人外周血单个核细胞的分离Ficoll分层离分层离 心法心法v淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离尼龙棉柱法、尼龙棉柱法、E花环花环分离法、补体细胞毒法免疫荧光法分离法、补体细胞毒法免疫荧光法v免疫细胞亚群的分离免疫细胞亚群的分离免疫磁珠分离法、免疫磁珠分离法、流式细胞术流式细胞术20免疫细胞的分离人外周血单个核细胞的分离Ficoll分层离谢谢！212024/6/16谢谢！212023/8/9