哺乳动物组织基因组DNA提取课件

2024/6/161Genomic DNA Extraction from Mammal Tissue哺乳动物组织基因组哺乳动物组织基因组DNA提取提取2023/8/91Genomic DNA Extractio2024/6/162一、一、实验目的实验目的(Experimental Purpose)After the experiment done,students should be able to know how to extract genomic DNA from mammal tissue.掌握动物基因组掌握动物基因组DNADNA提取的操作方法。提取的操作方法。2023/8/92一、实验目的(Experimental 2024/6/163细菌细菌-原核细胞原核细胞(prokaryote)无真正的细胞核无真正的细胞核真核细胞真核细胞(eukaryote)有真正的细胞核，还有很有真正的细胞核，还有很复杂的细胞器复杂的细胞器2023/8/93细菌-原核细胞(prokaryote)真核2024/6/164动物细胞特有动物细胞特有中心体中心体，高等植物细胞特有，高等植物细胞特有细胞壁，叶绿体和液泡细胞壁，叶绿体和液泡动物细胞动物细胞 (animal cell)植物细胞植物细胞 (plant cell)2023/8/94动物细胞特有中心体，高等植物细胞特有细胞壁2024/6/165二、二、实验原理实验原理(Experimental Principle)lIn the procedure described here,the SDS(sodium dodecyl sulfate)are added to denature proteins and solubilize lipids in membranes leading to cell lysis.The cell lysate is often treated with enzymes that hydrolyze RNA and proteins.本本实实验验利利用用去去垢垢剂剂SDS(十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠)是是为为了了使使蛋蛋白白变变性性并并溶溶解解细细胞胞膜膜中中的的脂脂质质从从而而导导致致细细胞胞裂裂解解，而细胞裂解物又常用蛋白酶而细胞裂解物又常用蛋白酶K和和RNA酶进行水解处理。酶进行水解处理。2023/8/95二、实验原理(Experimental 2024/6/166真核生物染真核生物染色体色体DNADNA组组装不同层次装不同层次的结构的结构2023/8/96真核生物染色体DNA组装不同层次的结构2024/6/167lThis is generally followed by phenol of phenol:chloroform extraction to remove the remaining proteins,which will either enter the organic phase or,if denatured,appear at the interphase.Chloroform treatment is used to remove the phenol,and alcohol precipitation concentrates the DNA while removing impurity.随随后后用用酚酚氯氯仿仿进进行行抽抽提提，以以去去除除残残留留的的蛋蛋白白质质，这这时时蛋蛋白白质质将将进进入入有有机机相相，或或者者假假如如己己变变性性的的话话将将呈呈现现在在有有机机相相与与水水相相之之间间。氯氯仿仿处处理理是是为为了了去去除除苯苯酚酚，而而乙乙醇醇沉沉淀淀处处理理则则可可以以浓浓缩缩DNA，同同时时去去除除核核苷苷酸酸、氨氨基基酸酸以以及及低低分分子子量量的的寡寡核苷酸和肽。核苷酸和肽。2023/8/97This is generally fol2024/6/168lAs a further precaution,ethylene diamine tetraace-tic acid(EDTA)is include-ed in the buffers to chelate Mg2+.This will reduce deoxyribonuclease(DNase)activity because of the Mg2+requirement of these enzymes.为为了了进进一一步步保保护护DNA样样品品的的完完整整性性，通通常常需需要要在在缓缓冲冲液液中中添添加加乙乙二二胺胺四四乙乙酸酸(EDTA)以以整整合合Mg2+，这这样样将将会会减减少少脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸酶酶(DNase)的的活活性性，因因为为该该酶酶必必须须在在有有Mg2+存存在在时时才才会会起起作用。作用。2023/8/98As a further precauti2024/6/169lThe method described here result in DNA that is easily cut with restriction enzymes and,therefore,is useful for Southern Hybridization studies.If the DNA is to be used to construct a clone bank,higher molecular weight DNA is desirable,so the vortex step should be eliminated.本本实实验验方方法法分分离离得得到到的的染染色色体体DNA样样品品易易被被限限制制酶酶切切割割，因因此此，较较适适用用于于Southern杂杂交交的的研研究究。如如果果所所制制备备的的基基因因组组DNA是是用用于于构构建建克克隆隆文文库库，要要求求得得到到较较大大分分子子量量的的DNA，则则必必须省略其中的振荡步骤。须省略其中的振荡步骤。2023/8/99The method described 2024/6/1610核酸的分离纯化、测定及核酸的分离纯化、测定及研究方法研究方法一、一、分离核酸的一般原则分离核酸的一般原则 因因为为遗遗传传信信息息全全部部贮贮存存在在核核酸酸的的一一级级结结构构中中，故故完完整整的的一一级级结结构构是是保保证证核核酸酸结结构构与与功功能能研研究究的基础。的基础。2023/8/910核酸的分离纯化、测定及研究方法一、分离2024/6/1611（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则 保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。（二）核酸的纯度要求（二）核酸的纯度要求 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；的金属离子；其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；最低程度；排除其它核酸分子的污染，如提取排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除分子时，应去除RNA，反之亦然，反之亦然。2023/8/911（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则2024/6/1612（三）核酸分离纯化的注意事项（三）核酸分离纯化的注意事项l为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：l 尽尽量量简简化化操操作作步步骤骤，缩缩短短提提取取过过程程，以以减减少少各各种种有有害害因因素素对对核核酸酸的的破坏；破坏；l 减减少少化化学学物物质质对对核核酸酸的的降降解解，为为避避免免过过酸酸、过过碱碱对对核核酸酸链链中中磷磷酸酸二二酯键的破坏，操作多在酯键的破坏，操作多在pH4pH41010条件下进行；条件下进行；l 防防止止核核酸酸的的生生物物降降解解。细细胞胞内内或或外外来来的的各各种种核核酸酸酶酶水水解解核核酸酸链链中中的的磷磷酸酸二二酯酯键键，直直接接破破坏坏核核酸酸的的一一级级结结构构。其其中中DNADNA酶酶需需要要金金属属二二价价阳阳离离子子MgMg2+2+，CaCa2+2+的的激激活活，因因此此使使用用金金属属离离子子螯螯合合剂剂，如如EDTAEDTA或或柠柠檬檬酸酸盐盐等等基基本本上上可可以以抑抑制制DNADNA酶酶的的活活性性。而而RNARNA酶酶不不但但分分布布广广泛泛、极极易易污污染染样样品品，而而且且耐耐高高温温、耐耐酸酸碱碱、不不易易失失活活，所所以以生生物物降降解解是是RNARNA提提取取过过程程中中的的主主要要危害因素；危害因素；l 减减少少物物理理因因素素对对核核酸酸的的降降解解，物物理理降降解解因因素素主主要要是是机机械械剪剪切切力力，其其次是高温。次是高温。2023/8/912（三）核酸分离纯化的注意事项为保证分离核2024/6/1613高高温温：如如长长时时间间煮煮沸沸，除除水水沸沸腾腾带带来来的的剪剪切切力力外外，高高温温本本身身对对核核酸酸分分子子中中的的某某些些化化合合键键也也有有破破坏坏作作用用。核核酸酸提提取取过过程程中中常常规规操操作作温温度度为为0 044以以降降低低核核酸酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。酶的活性从而减少对核酸的生物降解。机机械械剪剪切切力力：包包括括强强力力高高速速的的溶溶液液振振荡荡、搅搅拌拌，细细胞胞突突然然置置于于低低渗渗液液中中；细细胞胞爆爆炸炸式式地地破破裂裂及及DNADNA样样品品的的反反复复冻冻融融等等。这这些些操操作作细细节节在在实实验验操操作作中中应应加加倍倍注注意意。机机械械剪剪切切作作用用的的主主要要危危害害对对象象是是大大分分子子量的线性量的线性DNADNA分子，如真核细胞的染色体分子，如真核细胞的染色体DNADNA等等。2023/8/913高温：如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力2024/6/1614二、核酸分离纯化的一般步骤二、核酸分离纯化的一般步骤l破碎细胞破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子子沉淀核酸沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等杂质去除盐类、有机溶剂等杂质纯纯化干燥化干燥溶解。溶解。l核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。高的核酸分子。2023/8/914二、核酸分离纯化的一般步骤破碎细胞去除2024/6/1615三、试剂与器材三、试剂与器材（Reagents and apparatus）.Instruments High speed refrigerated centrifuge（高速冷冻离心机）、（高速冷冻离心机）、Glass homogenizer（玻璃匀浆器）（玻璃匀浆器）、Electrophoresis System（电泳系统）（电泳系统）、Ultraviolet transilluminator（紫外（紫外透射仪）透射仪）、Ultra cold storage freezer（超低温冰箱）（超低温冰箱）、Autoclave（高压灭菌锅）（高压灭菌锅）、Pipettes（微量加样器）（微量加样器）、Electronic balance（电子天平）（电子天平）、Acidometer（酸度计）（酸度计）2023/8/915三、试剂与器材（Reagents and2024/6/1616.Materials Liver of mice 2023/8/916.Materials2024/6/1617.ReagentsTris：Tris(Hydroxymethyl)aminomethane（三三羟羟甲甲基基氨氨基基甲甲烷烷）、SDS sodium dodecyl sulfate,sodium salt(十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠)、EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(乙乙 二二 胺胺 四四 乙乙 酸酸)、HCl hydrochloric acid（盐盐酸酸）、NaOH Sodium hydroxide（氢氢氧氧化化钠钠）、Sodium acetate(醋酸钠醋酸钠)、Acetic acid（冰乙酸）、（冰乙酸）、Phenol（平平衡衡酚酚）、Chloroform（氯氯仿仿）、Isoamylol（异异戊戊醇醇）、Ethanol（乙醇）乙醇）、TE buffer Protease K（蛋白酶（蛋白酶 K）、）、RNase A（RNA酶）酶）、Agarose（琼琼脂脂糖糖）、DNA molecular weight markers（DNA相相对对分分子子质质 量量 标标 准准 物物 Mark DNA）、Boric acid硼硼 酸酸、Sugar蔗蔗 糖糖、Bromophenol blue溴酚蓝溴酚蓝、Fluorescent dye(荧光染料荧光染料)Gelview2023/8/917.ReagentsTris：Tris2024/6/1618溶液溶液的配制的配制摩尔质量的计算摩尔质量的计算:质量质量(g)分子量分子量 例：例：5 mol/L NaCl 5 mol/L NaCl 分子量分子量58.44 50ml58.44 50ml x58.44密度的计算：密度的计算：0.05(L)5（mol/L）x 14.61（g）体积体积(L)摩尔体积（摩尔体积（mol/L）质量质量(g)体积（体积（V）密度（密度（g/ml）2023/8/918溶液的配制摩尔质量的计算:0.05 2024/6/1619(1)5mol/L氯化钠（氯化钠（NaCl）：）：溶解溶解292g氯化钠于足量的水中，定容至氯化钠于足量的水中，定容至1000ml。(2)0.5mol/L乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTA）:配制等摩尔的配制等摩尔的Na2EDTA和和NaOH溶液（溶液（0.5mol/L），混合），混合后形成后形成EDTA的三钠盐。或称取的三钠盐。或称取186.2g的的Na2EDTA2H2O和和20g的的NaOH，pH调至调至 8.0，并溶于约，并溶于约900ml水中，定容至水中，定容至1000ml。（3)3mol/L乙酸钠（乙酸钠（NaAc）：）：溶解溶解204g的三水乙酸钠于约的三水乙酸钠于约450ml水中，用水中，用冰乙酸冰乙酸调溶液调溶液的的 pH至至 5.2，再加水定容到，再加水定容到500ml。2023/8/919(1)5mol/L氯化钠（NaCl）：2024/6/1620(4)10十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDS）：）：称称取取 10 g SDS 慢慢慢慢转转移移到到约约含含 90 ml的的水水的的烧烧杯杯中中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解定容至，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解定容至100 ml。(5)5 mol/L氢氧化钠（氢氧化钠（NaOH）：）：溶溶解解20g氢氢氧氧化化钠钠颗颗粒粒于于约约 90 ml 水水的的烧烧杯杯中中（磁磁力搅拌器搅拌），完全溶解后用水定容至力搅拌器搅拌），完全溶解后用水定容至100 ml。(6)1 mol/L盐酸（盐酸（HCl）：）：加加 8.6 ml 的浓盐酸至的浓盐酸至 91.4 ml 的水中。的水中。2023/8/920(4)10十二烷基硫酸钠（SDS）2024/6/1621(7)20mg/ml(7)20mg/ml蛋白酶蛋白酶K K（proteinase Kproteinase K）：）：将将200mg200mg的的蛋蛋白白酶酶k k加加入入到到9.5ml9.5ml水水中中，轻轻轻轻摇摇动动，直直至至蛋蛋白白酶酶K K完完全全溶溶解解。不不要要涡涡旋旋混混合合。加加水水定定容容到到10ml10ml，然后分装成小份，然后分装成小份(1ml)(1ml)贮存于贮存于-20-20。(8)10mg/mlRnase(8)10mg/mlRnase（无（无DNaseDNase）（）（DNase-free RNaseDNase-free RNase）：）：溶溶解解10mg10mg的的胰胰蛋蛋白白RNARNA酶酶于于1ml1ml的的10mmol/L10mmol/L的的乙乙酸酸钠钠水水溶溶液液中中（pH pH 5.05.0）。溶溶解解后后于于水水浴浴中中煮煮沸沸15min15min，使使DNADNA酶酶失失活活。用用1mol/L1mol/L的的Tris-HClTris-HCl调调pHpH至至7.57.5，于于-20-20贮存。（配制过程中要戴手套）贮存。（配制过程中要戴手套）2023/8/921(7)20mg/ml蛋白酶K（prot2024/6/1622(9)(9)1 mol1 molL L TrisTris缓冲液（缓冲液（TrisTrisHCl bufferHCl buffer）将将121g121g的的TrisTris碱溶解于约碱溶解于约0.9L0.9L水中，再根据所要求的水中，再根据所要求的pHpH（2525下）加一定量的浓盐酸（下）加一定量的浓盐酸（11.6N11.6N），用水调整终），用水调整终体积至体积至1L1L。浓盐酸的体积（ml）pH14148.68.6212128.528.5383846465656666671.371.376 76 9.09.08.88.88.68.68.48.48.28.28.08.07.87.87.67.67.47.47.2 7.2 2023/8/922(9)1 molL Tris缓冲液（2024/6/1623四、实验步骤四、实验步骤(Experimental Procedures)冰浴处理生理盐水冰浴处理生理盐水 玻璃匀浆器玻璃匀浆器 冰冷的生理盐水清洗冰冷的生理盐水清洗配制工作液配制工作液 处死小鼠处死小鼠 取出肝脏取出肝脏 组织匀浆液组织匀浆液 酶解液酶解液2ml2ml匀浆液匀浆液 组织细胞液组织细胞液 玻璃匀浆器匀浆玻璃匀浆器匀浆 移至移至1.5ml离心管离心管5000r5000rmin30min3060s 60s 加加400ul 400ul 吹散吹散 加加400ul400ul 离心离心 无菌水无菌水 酶解液酶解液 水浴处理（水浴处理（55、1218h）2023/8/923四、实验步骤(Experimental 2024/6/1624工作液配置：工作液配置：l贮备液摩尔浓度贮备液摩尔浓度贮备液（体积）贮备液（体积）工作液摩工作液摩尔浓度尔浓度工作液（体积）工作液（体积）例：例：组织匀浆液（组织匀浆液（10ml）贮备液摩尔浓度：贮备液摩尔浓度：5 molL NaCl 工作液摩尔浓度：工作液摩尔浓度：100mmolL l5 molL x 0.1molL 10ml lx 0.2ml 2023/8/924工作液配置：贮备液摩尔浓度贮备液（体积2024/6/1625组织匀浆液组织匀浆液 （装入（装入10ml10ml离心管中）离心管中）10ml 10ml l100 mmol/L NaCl：0.2ml（5 mol/L NaCl）l25 mmol/L EDTA：0.5ml（0.5 mol/L EDTA pH8.0)l10 mmol/L TrisHCl：0.1ml（1 mol/L TrisHCl pH 8.0)l加三蒸水加三蒸水:9.2ml2023/8/925组织匀浆液（装入10ml离心管中）102024/6/1626酶解液（装入酶解液（装入1.5ml1.5ml离心管中）离心管中）1ml1mll200 mmol/L NaCl：0.04 ml（5 mol/L NaCl）l50 mmol/L EDTA：0.1 ml（0.5 mol/L EDTA pH80)l20 mmol/L TrisHCl：0.02 ml（1 mol/L TrisHCl pH 80)l1%SDS：0.5 ml（2%SDS）l200g/mL蛋白酶蛋白酶K：0.02 ml（10 mg/ml）l加三蒸水加三蒸水:0.32ml2023/8/926酶解液（装入1.5ml离心管中）1ml2024/6/1627无无DNADNA酶的酶的RNARNA酶（酶（-20-20保存）保存）10mmol/L TrisHCl将胰将胰RNARNA酶溶于酶溶于 浓度浓度10mg10mgmLmL 15mmol/L NaCl 于于100100水浴处理水浴处理15min15min以降解以降解DNADNA酶酶 缓慢冷却到室温。缓慢冷却到室温。2023/8/927无DNA酶的RNA酶（-20保存）2024/6/1628四、实验步骤四、实验步骤(Experimental Procedures)等量分装在两支离心管内等量分装在两支离心管内 加入加入20ul的的RNase RNase 加入等体积加入等体积提取液提取液 4 10min4 10min酶解样品酶解样品 待抽提的样品待抽提的样品 抽提抽提 静置静置 离心离心 配制配制 TETE缓冲液缓冲液 加等体积加等体积提取提取液液500ul500ul10000r10000rminmin离心离心10min 10min 4 10min4 10min 移出水相移出水相 至离心管至离心管 抽提抽提 静置静置 10000r10000rminmin离心离心10min 10min 加加1/10 1/10 加加2 2倍倍 放入放入离心离心 移出水相移出水相 NaAcNaAc 无水乙醇无水乙醇 -20 1-2h 12000r-20 1-2h 12000rminmin离心离心15min 15min 加入加入超低温冰箱超低温冰箱 融化、离心融化、离心 弃上清液弃上清液 洗涤洗涤 12000r12000rminmin离心离心15min 15min 干燥干燥 44 75%75%冷乙醇冷乙醇 离心离心 弃上清液弃上清液 加加TETE 50 50l存放存放 DNADNA 2023/8/928四、实验步骤(Experimental 2024/6/1629平衡酚平衡酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇：氯仿：异戊醇：25：24：1 (体积比体积比)即配即用即配即用 每管加每管加500ul 平衡酚平衡酚(pH8.0)：250ul 氯仿：氯仿：240ul 异戊醇：异戊醇：10ul2023/8/929平衡酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇：22024/6/1630氯仿：异戊醇：氯仿：异戊醇：2424：1(1(体积比体积比)即配即用即配即用 每支试管加每支试管加 500 l 氯仿：氯仿：480 l 异戊醇：异戊醇：20 l2023/8/930氯仿：异戊醇：24：1(体积比)即配即用2024/6/1631TETE缓冲液缓冲液 1ml1mll10mmol/L TrisHCl：10l（1 mol/L TrisHCl pH 8.0)l1mmol/L EDTA：2l（0.5 mol/L EDTA pH8.0)加三蒸水加三蒸水 0.988ml 至至 1 ml2023/8/931TE缓冲液 12024/6/1632核酸的酚抽提核酸的酚抽提l原理：交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，原理：交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去除蛋白质。更有效去除蛋白质。l氯仿还可加速有机相与水相的分层。氯仿还可加速有机相与水相的分层。l异戊醇：抑制界面泡沫的形成。异戊醇：抑制界面泡沫的形成。l标准程序：酚标准程序：酚酚酚-氯仿氯仿氯仿。氯仿。2023/8/932核酸的酚抽提原理：交替使用酚、氯仿两种蛋2024/6/1633酚抽提除去蛋白质的示意图酚抽提除去蛋白质的示意图2023/8/933酚抽提除去蛋白质的示意图2024/6/1634四、实验步骤四、实验步骤(Experimental Procedures)等量分装在两支离心管内等量分装在两支离心管内 加入加入20ul的的RNase RNase 加入等体积加入等体积提取液提取液 4 10min4 10min酶解样品酶解样品 待抽提的样品待抽提的样品 抽提抽提 静置静置 离心离心 配制配制 TETE缓冲液缓冲液 加等体积加等体积提取提取液液500ul500ul10000r10000rminmin离心离心10min 10min 4 10min4 10min 移出水相移出水相 至离心管至离心管 抽提抽提 静置静置 10000r10000rminmin离心离心10min 10min 加加1/10 1/10 加加2 2倍倍 放入放入离心离心 移出水相移出水相 NaAcNaAc 无水乙醇无水乙醇 -20 1-2h 12000r-20 1-2h 12000rminmin离心离心15min 15min 加入加入超低温冰箱超低温冰箱 融化、离心融化、离心 弃上清液弃上清液 洗涤洗涤 12000r12000rminmin离心离心15min 15min 干燥干燥 44 75%75%冷乙醇冷乙醇 离心离心 弃上清液弃上清液 加加TE 50TE 50l存放存放 DNADNA 2023/8/934四、实验步骤(Experimental 2024/6/1635核酸的沉淀核酸的沉淀l原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶，也不会变性。溶剂中不溶，也不会变性。l醋酸钠为沉淀醋酸钠为沉淀DNA、RNA的最常用盐类。的最常用盐类。l有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。l温度：冰水温度：冰水2023/8/935核酸的沉淀原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐2024/6/1636四、实验步骤四、实验步骤(Experimental Procedures)等量分装在两支离心管内等量分装在两支离心管内 加入加入20ul的的RNase RNase 加入等体积加入等体积提取液提取液 4 10min4 10min酶解样品酶解样品 待抽提的样品待抽提的样品 抽提抽提 静置静置 离心离心 配制配制 TETE缓冲液缓冲液 加等体积加等体积提取提取液液500ul500ul10000r10000rminmin离心离心10min 10min 4 10min4 10min 移出水相移出水相 至离心管至离心管 抽提抽提 静置静置 10000r10000rminmin离心离心10min 10min 加加1/10 1/10 加加2 2倍倍 放入放入离心离心 移出水相移出水相 NaAcNaAc 无水乙醇无水乙醇 -20 1-2h 12000r-20 1-2h 12000rminmin离心离心15min 15min 加入加入超低温冰箱超低温冰箱 融化、离心融化、离心 弃上清液弃上清液 洗涤洗涤 12000r12000rminmin离心离心15min 15min 干燥干燥 44 75%75%冷乙醇冷乙醇 离心离心 弃上清液弃上清液 加加TE 50TE 50l存放存放 DNADNA 2023/8/936四、实验步骤(Experimental 2024/6/1637四、实验步骤四、实验步骤(Experimental Procedures)Agarose Gel Electrophoresis：Preparation of the gel 制备制备0.3琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 Loading DNA samples DNA samples 16l+Loading buffer4l Gel 电压电压120V Gel photography2023/8/937四、实验步骤(Experimental 2024/6/16381.制制备备 0.3 琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶。称称取取 0.09 g 琼琼脂脂糖糖，放放人人锥锥形形瓶瓶中中，加加入入 30 mL的的 0.5TBE 缓缓冲冲液液，放放入入微微波波炉炉加加热热至至完完全全溶溶化化，则则为为 1 琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶液液。（由由于于蒸蒸发发作作用用，溶溶解解前前在在容容量量瓶瓶上上作一个记号，溶解后用三蒸水补足作一个记号，溶解后用三蒸水补足）2.制胶器的安装。制胶器的安装。3.将将将将熔熔熔熔化化化化的的的的琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶液液液液转转转转入入入入Gelview专专专专用用用用的的的的三三三三角角角角瓶瓶瓶瓶中中中中，然然然然后后后后加加加加入入入入Gelview 3 3 l l。4.将冷到将冷到60左右，缓缓倒入制胶器左右，缓缓倒入制胶器(注意不要形成气泡注意不要形成气泡)。5.待待胶胶凝凝固固后后（80min），轻轻轻轻拔拔掉掉梳梳子子，将将凝凝胶胶盘盘从从制制胶胶槽槽中中取出，放入电泳槽内。取出，放入电泳槽内。6.加入电泳缓冲液加入电泳缓冲液(0.5)至电泳槽中。至电泳槽中。2023/8/9381.制备 0.3 琼脂糖凝胶。称取 02024/6/16395TBE5TBE（电泳缓冲液）（电泳缓冲液）100mL100mLl5.4gTris，l2.75g硼酸，硼酸，l2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)l加蒸馏水到加蒸馏水到100mllpH8.00.5TBE2023/8/9395TBE（电泳缓冲液）100mL5.2024/6/164066上样缓冲液上样缓冲液l0 02525溴酚蓝：取溴酚蓝：取60ml60ml三蒸水，将三蒸水，将250mg250mg溴酚蓝溶解于其中溴酚蓝溶解于其中l4040(W(WV)V)蔗糖水溶液：在上述溶液中加蔗糖水溶液：在上述溶液中加入入40g40g蔗糖蔗糖2023/8/9406上样缓冲液025溴酚蓝：取60m2024/6/1641 Illuminate the gel with UV light and then take pictures.By comparing product bands with bands from the known molecular-weight markers,you should be able to identify any product fragments which are of the appropriate molecular weight.通过紫外透射仪检测凝胶，然后获取图通过紫外透射仪检测凝胶，然后获取图片。并将产物条带与已知分子量的标淮条带片。并将产物条带与已知分子量的标淮条带进行比较，便可以对合适分子量大小的产物进行比较，便可以对合适分子量大小的产物进行鉴定。进行鉴定。2023/8/941 Illuminate the 2024/6/1642五、实验结果五、实验结果(experimental results)图图1 小鼠肝脏基因组小鼠肝脏基因组DNA电泳图电泳图2023/8/942五、实验结果(experimental 2024/6/1643l 加入二苯胺试剂2ml 乳白色乳白色 无色l沸水水浴10分钟。无色 浅蓝色浅蓝色 二苯胺显色2023/8/943二苯胺显色2024/6/1644二苯胺试剂的配制二苯胺试剂的配制A A液液:1.5 1.5 g g二二苯苯胺胺溶溶于于100 100 ml ml 冰冰醋醋酸酸中中再再加加15 15 mLmL浓浓硫硫酸酸,用用棕棕色色瓶瓶保保存存。如如冰冰醋醋酸酸呈呈结结晶状态晶状态,则需加温后待其熔化则需加温后待其熔化,再使用。再使用。B B液液:乙醛的体积分数为乙醛的体积分数为0.2%0.2%的溶液。的溶液。配配制制:将将0.1 0.1 ml ml B B液液加加入入到到 10 10 ml ml A A液液中中，现配现用。现配现用。2023/8/944二苯胺试剂的配制A液:1.5 g二苯胺