基因工程的主要技术原理（教资优择）课件

Genetic Engineering第二章第二章 基因工程的主要技术原理基因工程的主要技术原理1 1基础课件基础课件Genetic Engineering第二章 基因工程的2 2基础课件基础课件第二章 基因工程的主要技术原理2基础课件由于提取由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯的提纯有很多方法。其中最常用的是有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。碱抽提法。第一节第一节DNA的提取与纯化的提取与纯化3 3基础课件基础课件由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等4 4基础课件基础课件4基础课件大肠杆菌基因组DNA5 5基础课件基础课件大肠杆菌基因组DNA 5基础课件一、质粒一、质粒DNA的提取的提取6 6基础课件基础课件一、质粒DNA的提取6基础课件plasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.GenomicDNA7 7基础课件基础课件plasmid DNAThe genomic DNA of 闭合环状的质粒闭合环状的质粒DNA，在变性后不会，在变性后不会分离，复性快；分离，复性快；（1）原理1.碱抽提法提取质粒DNADNA双链双链变性变性DNA单链单链复性复性强碱强碱中性中性闭合环状的质粒闭合环状的质粒DNA，在变性后不会，在变性后不会分离，复性快；分离，复性快；（1）原理1.碱抽提法提取质粒DNADNA双链双链变性变性DNA单链单链复性复性强碱强碱中性中性8 8基础课件基础课件闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；（1）原理1染色体染色体线性线性DNA和或和或有缺口有缺口的质粒的质粒DNA变性变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心复合物结合在一起，在离心的时候的时候沉淀沉淀下去。下去。变性变性9 9基础课件基础课件染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复（2）所用的试剂作用溶菌酶溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽肽聚糖聚糖中的中的-1，4糖苷键糖苷键。在碱性条件（在碱性条件（pH8）下有活性。）下有活性。葡萄糖葡萄糖增加溶液的增加溶液的粘度粘度，维持，维持渗透压渗透压，防止，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。受机械力（震荡）的作用而降解。（2）所用的试剂作用溶菌酶溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽肽聚糖聚糖中的中的-1，4糖苷键糖苷键。在碱性条件（在碱性条件（pH8）下有活性。）下有活性。葡萄糖葡萄糖增加溶液的增加溶液的粘度粘度，维持，维持渗透压渗透压，防止，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。受机械力（震荡）的作用而降解。1010基础课件基础课件（2）所用的试剂作用 溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制的螯合剂，可抑制DNA酶酶的活的活性，防止性，防止DNA被酶降解。被酶降解。NaOH-SDSNaOH：强碱，提供强碱，提供pH12的碱性条件，的碱性条件，使使DNA双链双链变性变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成结合成“蛋白蛋白SDS”复合物复合物，使蛋白质，使蛋白质（包括（包括DNA酶）变性沉淀。酶）变性沉淀。1111基础课件基础课件EDTAMg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性冰醋酸把醋酸钠溶液的冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到调到4.8。用来用来中和中和NaOH变性液，使变性液，使DNA复性。复性。高浓度的高浓度的NaAc有利于变性的大分子有利于变性的大分子（蛋白质、（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。等）沉淀。用于用于沉淀沉淀DNA。乙醇乙醇DNA分子以分子以水合状态水合状态“溶于溶于”水里，水里，乙醇能夺去乙醇能夺去DNA分子的水环境。分子的水环境。NaAc-HAc缓冲液1212基础课件基础课件冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。高浓度的NaAc有利于RNaseA降解降解RNA渣滓。渣滓。以免提取后的以免提取后的DNA中含有小分子的中含有小分子的RNA。TE缓冲液缓冲液DNA保存保存液。液。由由Tris-HCl和和EDTA配制。配制。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作；或硼酸缓冲业），有利于以后操作；EDTA抑制抑制DNA酶，防止酶，防止DNA被酶降解。被酶降解。1313基础课件基础课件 RNase A降解RNA渣滓。TE缓冲液DNA保存蛋白变性剂蛋白变性剂，进一步抽提，进一步抽提DNA溶液中的蛋白溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在但苯酚会残留在DNA溶液中。溶液中。（现多用各种商品化的（现多用各种商品化的层析柱层析柱纯化纯化DNA)。酚酚-氯仿氯仿选用选用以上试剂有商业试剂盒；以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。也可以自己配制。1414基础课件基础课件蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤SolutionI的配制：的配制：使用使用“溶液溶液”溶解细菌细胞壁。溶解细菌细胞壁。第一步：溶菌第一步：溶菌50mM葡萄糖，葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，4-5mg/ml溶菌酶溶菌酶，RNase A1515基础课件基础课件（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤 Solution I 的溶液溶液II破坏细胞膜，蛋白质和破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。变性。第二步：破膜，蛋白质和第二步：破膜，蛋白质和DNA变性变性SolutionII的配制：的配制：第三步：中和第三步：中和溶液溶液III使使DNA复性、并促使蛋白质复性、并促使蛋白质-SDS复复合物和染色体合物和染色体DNA、RNA沉淀。沉淀。SolutionIII的配制：的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M醋酸钠（用冰醋酸调醋酸钠（用冰醋酸调pH至至4.8）1616基础课件基础课件溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。第二步：破膜，蛋白上清液中含有闭合质粒上清液中含有闭合质粒DNA。第四步：离心除去沉淀第四步：离心除去沉淀0.6倍体积的异丙醇倍体积的异丙醇或或2倍体积的倍体积的乙醇乙醇。第五步：纯化第五步：纯化DNA上清液上清液过柱过柱或酚或酚-氯仿抽提。氯仿抽提。第六步：沉淀第六步：沉淀DNA1717基础课件基础课件上清液中含有闭合质粒DNA。第四步：离心除去沉淀0.6倍体积最重要的是：最重要的是：2.影响质粒影响质粒DNA产量的因素产量的因素菌株的遗传背景，菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。质粒自身的拷贝数。一般要使用一般要使用endA基因基因发生突变的大肠杆菌发生突变的大肠杆菌菌株。如菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。等。（1）受体菌株）受体菌株endA基因编码基因编码核酸内切酶核酸内切酶，在在Mg2+的存在下的存在下可将双链可将双链DNA消化成消化成7bp的寡核苷酸片断。的寡核苷酸片断。1818基础课件基础课件最重要的是：2.影响质粒DNA产量的因素菌株的遗传背景，这是直接决定这是直接决定DNA产量的重要因素之一。产量的重要因素之一。（3）质粒大小）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。分子量大的质粒，拷贝数少。（2）质粒拷贝数）质粒拷贝数质粒本身的性质所决定质粒本身的性质所决定。1919基础课件基础课件这是直接决定DNA产量的重要因素之一。（3）质粒大小分子量大若干常用质粒的理论产量质粒名质粒名质粒名质粒名分子大小分子大小分子大小分子大小bpbp拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数质粒产量质粒产量质粒产量质粒产量 g/mlg/ml pGEMpGEMpUCpUCpBR322pBR322ColE1ColE1pACYCpACYCpSC101pSC101270027002700270044004400450045004000400090009000300-700300-700500-700500-70025251515 1010 6 61.8-4.11.8-4.12.9-4.12.9-4.10.320.320.150.15 0.090.09 0.120.12若干常用质粒的理论产量若干常用质粒的理论产量质粒名质粒名质粒名质粒名分子大小分子大小分子大小分子大小bpbp拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数质粒产量质粒产量质粒产量质粒产量 g/mlg/ml pGEMpGEMpUCpUCpBR322pBR322ColE1ColE1pACYCpACYCpSC101pSC101270027002700270044004400450045004000400090009000300-700300-700500-700500-70025251515 1010 6 61.8-4.11.8-4.12.9-4.12.9-4.10.320.320.150.15 0.090.09 0.120.122020基础课件基础课件若干常用质粒的理论产量质粒名分子大小bp拷贝数质粒产量g/二、基因组或其他二、基因组或其他DNA的提取的提取一般过程及原理：一般过程及原理：1.细菌基因组细菌基因组DNA的制备的制备（1）细胞裂解）细胞裂解10%SDS和蛋白酶和蛋白酶K。37oC温育。温育。不用不用NaOH!2121基础课件基础课件二、基因组或其他DNA的提取 一般过程及原理：1.细（3）沉淀）沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇。倍体积的异丙醇。（2）DNA纯化纯化CTAB(十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵)除去除去多多糖糖，酚，酚-氯仿氯仿-异戊醇除去异戊醇除去蛋白蛋白。2222基础课件基础课件（3）沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇。（2）DNA纯化CTA一般过程及原理：一般过程及原理：动物组织剪成小块，置动物组织剪成小块，置液氮液氮中冻结后中冻结后研研磨磨成细粉末。成细粉末。组织培养的细胞用组织培养的细胞用胰酶胰酶消化松散后直接消化松散后直接使用。使用。（1）组织粉碎）组织粉碎2.哺乳动物细胞基因组DNA的抽提2323基础课件基础课件 一般过程及原理：动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细0.5%SDS和和0.1mg/ml蛋白酶蛋白酶K。50oC温育。温育。（2）细胞裂解）细胞裂解（3）纯化）纯化DNA用苯酚和酚用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。氯仿抽提除去蛋白质污染。SDS是离子型去垢剂（是离子型去垢剂（detergent），），可以使细胞膜崩解。可以使细胞膜崩解。（5）除去）除去RNA污染污染用用RNase。用用2倍体积的无水乙醇。倍体积的无水乙醇。（4）沉淀）沉淀DNA（可以加入（可以加入1/101/10体积的体积的3M3M醋酸氨醋酸氨辅助沉淀）辅助沉淀）2424基础课件基础课件0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。（一般过程及原理：一般过程及原理：（1）组织粉碎）组织粉碎用用液氮液氮冷冻后冷冻后研磨研磨成细粉末。成细粉末。3.从植物组织中制备从植物组织中制备DNA（2）细胞裂解）细胞裂解用用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴十六烷基三甲基溴化铵化铵/2巯基乙醇）。巯基乙醇）。或或1%SDS和蛋白酶和蛋白酶K。65oC温育。温育。2525基础课件基础课件 一般过程及原理：（1）组织粉碎用液氮冷冻后研磨用用0.6倍体积的倍体积的异丙醇异丙醇（-20oC）。）。（3）纯化）纯化DNA用苯酚和酚用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。氯仿抽提除去蛋白质污染。（4）沉淀）沉淀DNA（5）除去）除去RNA污染污染用用RNaseA。（可以加入（可以加入1/10体积的体积的3M醋酸氨辅助沉淀）醋酸氨辅助沉淀）。2626基础课件基础课件用0.6倍体积的异丙醇（-20 oC）。（3）纯化DNA用苯三、三、DNA的定量和纯度测定的定量和纯度测定1.紫外光谱法紫外光谱法DNA（或（或RNA）在）在260nm波长处波长处有特异的紫外吸收峰。有特异的紫外吸收峰。用微量比色杯（用微量比色杯（10 l）在紫外分光光）在紫外分光光度计直接测定。度计直接测定。原理：原理：蛋白质在蛋白质在280nm280nm处有吸收峰处有吸收峰2727基础课件基础课件三、DNA的定量和纯度测定1.紫外光谱法DNA（或 RNA2 22828基础课件基础课件2228基础课件溴化乙锭（溴化乙锭（EB）能插入）能插入DNA分子中，分子中，紫外光照射下能发紫外光照射下能发红色荧光红色荧光。2.琼脂糖凝胶电泳估计琼脂糖凝胶电泳估计原理：原理：与与已知浓度已知浓度的的DNA电泳带荧光强度电泳带荧光强度对比对比，就可以估计出，就可以估计出DNA含量。含量。2929基础课件基础课件溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发 红色荧一般使用琼脂糖凝胶电泳，与一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量已知分子量的的DNA标准混合液标准混合液对比对比得知。得知。DNA分子量分子量Marker有许多公司的商品，使有许多公司的商品，使用非常方便。如用非常方便。如 DNA的的Hind酶切物等。酶切物等。四、四、DNA分子量的估计分子量的估计MarkerMarker3030基础课件基础课件一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得DNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarkerDNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarker3131基础课件基础课件DNA ladder28kb2500bp2300bp130C Transcript levels of rice KNOX genes OSH1 and OSH3 revealed by RT-PCR in leaves from wild-type(WT),phenotypic YAB3 RNAi(Y1 and Y2),and WOX3 overexpression plants(W1 and W2).Shoot apex mRNA was used as a positive control(S).3232基础课件基础课件C Transcript levels of ric1.带电荷的分子在电场中会以一定的速率带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质向与其电荷性质相反的电极相反的电极移动，速度移动，速度称为电泳迁移率。称为电泳迁移率。2.电泳迁移率同电场的电泳迁移率同电场的强度强度和分子本身所和分子本身所带的带的净电荷数目净电荷数目成成正比正比。3.电泳迁移率同分子与介质的电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数摩擦系数成成反比反比。一、电泳的基本原理一、电泳的基本原理第二节第二节DNA的凝胶电泳的凝胶电泳3333基础课件基础课件1.带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的4.如果电场强度一定（电压和电极距离）、如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：电泳介质相同（电泳液和凝胶）：分子在电场中迁移的速度主要取决于分子分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的本身的大小和形状大小和形状。形状相似的分子的迁移速度主要与形状相似的分子的迁移速度主要与分子量分子量相关相关:分子量越大，移动越慢。分子量越大，移动越慢。摩擦系数主要与分子的摩擦系数主要与分子的大小大小、形状形状以及以及介质的粘度有关。介质的粘度有关。5.3434基础课件基础课件4.如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳RelaxedsupercoiledIncreasingdegreeofsupercoiling相同分子量的相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，线性分子次之，伸展开环状最慢。伸展开环状最慢。3535基础课件基础课件Relaxed supercoiled Increasing3636基础课件基础课件36基础课件3737基础课件基础课件37基础课件uuAgarosegelelectrophoresisGel electrophoresisisnotonlyusedasananalyticalmethod,itisroutinelyusedpreparativelyforthepurificationofspecificDNAfragments.Thegeliscomposedof:Agarose:forDNAfragmentsranginginsizefromafewhundredbasepairstoabout20kb(Fig.2.1).Polyacrylamide:forsmallerDNAfragments.3838基础课件基础课件Agarose gel electrophoresis38Fig.2.1ElectrophoresisofDNAinagarosegels.DNAbandshavebeenvisualizedbysoakingthegelinasolutionofethidiumbromide(seeFig.2.2),whichcomplexeswithDNAbyintercalatingbetweenstackedbase-pairs,andphotographingtheorangefluorescence.3939基础课件基础课件Fig.2.1 Electrophoresis of DNFig.2.2Ethidiumbromide.4040基础课件基础课件Fig.2.2 Ethidium bromide.40基ppAgarose gelisacomplexnetworkofpolymericmoleculeswhoseaverageporesizedependsonthebuffercompositionandthetypeandconcentrationofagaroseused.4141基础课件基础课件Agarose gel is a complex netwoInanyevent,gelelectrophoresisisfrequentlyInanyevent,gelelectrophoresisisfrequentlyperformedwithmarkerDNAfragmentsofknownperformedwithmarkerDNAfragmentsofknownsize,whichallowaccuratesizedeterminationofansize,whichallowaccuratesizedeterminationofanunknownDNAmoleculebyinterpolation(unknownDNAmoleculebyinterpolation(插入插入).).InadditiontoInadditiontoresolvingDNAfragmentsofresolvingDNAfragmentsofdifferentlengths,gelelectrophoresiscanbeusedtodifferentlengths,gelelectrophoresiscanbeusedtoseparatedifferentmolecularconfigurationsofaseparatedifferentmolecularconfigurationsofaDNAmolecule.DNAmolecule.4242基础课件基础课件 In any event,gel electrophoGelelectrophoresiscanalsobeusedforinvestigatingproteinnucleicacidinteractions,basedontheobservationthatbindingofaproteintoDNAfragmentsusuallyleadstoamobilityreduction.4343基础课件基础课件 Gel electrophoresis can also二二、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖琼脂糖2.琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨胨”。是一种是一种线性多糖聚合物线性多糖聚合物，从红色海藻产物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂中提取而来。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。浓度高浓度高空隙小空隙小4444基础课件基础课件二、琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖2.琼脂糖凝胶琼脂糖在水里琼脂糖的浓度（琼脂糖的浓度（琼脂糖的浓度（琼脂糖的浓度（%）分离分离分离分离DNADNA的片断大小（的片断大小（的片断大小（的片断大小（bpbp）0.30.30.70.71.41.450000100050000100020000100020000100060003006000300空隙小，分辨率高：空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过；小分子较易通过，而大分子难通过；空隙大，分辨率低：空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。大小分子几乎以同等速率通过。3.琼脂糖凝胶的分辨力空隙大小决定其分辨分子大小的能力。空隙大小决定其分辨分子大小的能力。4545基础课件基础课件琼脂糖的浓度（%）分离DNA的片断大小（bp）0.3 500 1 1、概述：、概述：、概述：、概述：聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称丙烯酰胺（简称丙烯酰胺（简称丙烯酰胺（简称AcrAcr）单体）单体）单体）单体和少量交联剂和少量交联剂和少量交联剂和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称甲叉双丙烯酰胺（简称甲叉双丙烯酰胺（简称甲叉双丙烯酰胺（简称BisBis）通过化学催化剂（通过化学催化剂（通过化学催化剂（通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙过硫酸铵），四甲基乙过硫酸铵），四甲基乙过硫酸铵），四甲基乙二胺（二胺（二胺（二胺（TEMEDTEMED）作为加速剂或光催化聚合作用）作为加速剂或光催化聚合作用）作为加速剂或光催化聚合作用）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。适用于不同相对分子质量物应、分子筛效应。适用于不同相对分子质量物应、分子筛效应。适用于不同相对分子质量物应、分子筛效应。适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。质的分离，且分离效果好。质的分离，且分离效果好。质的分离，且分离效果好。三三、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳4646基础课件基础课件 1、概述：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体优点是比琼脂糖凝胶的优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝胶浓度聚丙烯酰胺凝胶浓度聚丙烯酰胺凝胶浓度聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）分离分离分离分离DNADNA片断大小片断大小片断大小片断大小（bpbp）4.010.020.0100010050025501三、聚丙烯酰胺凝胶电泳其优点是比琼脂糖凝胶的其优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝胶浓度聚丙烯酰胺凝胶浓度聚丙烯酰胺凝胶浓度聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）分离分离分离分离DNADNA片断大小片断大小片断大小片断大小（bpbp）4.010.020.0100010050025501琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：100050000bp 聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：11000bp4747基础课件基础课件优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）分2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理与装置）原理与装置（Polyacrylamide gel electrophoresis）在电场的作用下线性蛋白在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，质中向正极移动，移动的移动的速率主要取决于其分子量速率主要取决于其分子量大小（链的长短），大小（链的长短），从而从而把不同分子量的肽链分开。把不同分子量的肽链分开。电泳电泳buffer电泳电泳buffer4848基础课件基础课件2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理与装置（Polyacr电泳方向电泳方向4949基础课件基础课件电泳方向49基础课件5050基础课件基础课件50基础课件已知分子量的蛋白质已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。白质提供分子量估计。商品化供应商品化供应Da道尔顿道尔顿(质量单位质量单位,等于等于一氧原子质量的十六分一氧原子质量的十六分之一。之一。一克约为一克约为6106102323道尔顿道尔顿3、蛋白质电泳的分子量标准、蛋白质电泳的分子量标准5151基础课件基础课件已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提DaltonSDS PAGE5252基础课件基础课件DaltonSDS PAGE52基础课件4 4、凝胶中的蛋白质染色：凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：考马斯亮蓝：灵敏度底、只能检出灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可，但可褪色回收。褪色回收。硝酸银：硝酸银：灵敏度高、可检出灵敏度高、可检出2-5ng/带。带。2）转到膜上进行染色。）转到膜上进行染色。1）直接染色）直接染色5353基础课件基础课件4、凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：硝酸银：2）转到膜上直接染色电泳结果5454基础课件基础课件直接染色电泳结果54基础课件四、凝胶染色四、凝胶染色1.染料染料溴化乙锭。溴化乙锭。Ethidiumbromide（EB）5555基础课件基础课件四、凝胶染色1.染料溴化乙锭。Ethidium bromiEB是扁平分子，能是扁平分子，能插入插入DNA碱基之间碱基之间，但，但不与琼脂糖结合。不与琼脂糖结合。EB在在300nm紫外光照射下能紫外光照射下能发红色荧光发红色荧光，即可显示即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与荧光强度与DNA含量及大小成正比。含量及大小成正比。2.原理5656基础课件基础课件EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。2 5757基础课件基础课件 57基础课件5858基础课件基础课件58基础课件UVP全自动凝胶成像分析系统5959基础课件基础课件UVP全自动凝胶成像分析系统59基础课件OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统6060基础课件基础课件OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统60基础课件 核酸杂交核酸杂交核酸杂交核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNADNA印迹交（印迹交（SouthernblothybridizationSouthernblothybridization）和）和RNARNA印迹杂交（印迹杂交（NorthernblothybridizationNorthernblothybridization）。）。第三节第三节核酸的分子杂交核酸的分子杂交6161基础课件基础课件 核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸DNA-DNA或或DNA-RNA链杂交。用放射性同链杂交。用放射性同位素（位素（32P或或125I）标记的）标记的DNA或或RNA探针。探针。6262基础课件基础课件DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32PSouthern杂交的基本原理是将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。一、一、Southern blot6363基础课件基础课件 Southern 杂交的基本原理是将待检测的DNSouthernblot用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测DNA样品样品。6464基础课件基础课件Southern blot用DNA（或RNA）探针检测DNA6565基础课件基础课件65基础课件6666基础课件基础课件66基础课件Southernblot筛选结果6767基础课件基础课件Southern blot 筛选结果67基础课件二、二、Northern blot用用DNA（或（或RNA）探）探针检测针检测RNA样品样品。在变性条件下将待检的在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理相同的原理进行转膜和用探针进行杂进行转膜和用探针进行杂交检测。其用途是检测样交检测。其用途是检测样品中是否含有基因的转录品中是否含有基因的转录产物（产物（mRNA）及其含量。）及其含量。主要检测插入片主要检测插入片断是否被转录。断是否被转录。6868基础课件基础课件二、Northern blot用DNA（或RNA）探针检测R 蛋白质印迹蛋白质印迹蛋白质印迹蛋白质印迹(westernblot)(westernblot)，又称免疫印迹，又称免疫印迹，又称免疫印迹，又称免疫印迹(immunoblotting)(immunoblotting)是根据抗原抗体的特异性结合检测是根据抗原抗体的特异性结合检测是根据抗原抗体的特异性结合检测是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。复杂样品中的某种蛋白的方法。复杂样品中的某种蛋白的方法。复杂样品中的某种蛋白的方法。Western BlotWestern Blot基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。所分析的细胞或组织中的表达情况。所分析的细胞或组织中的表达情况。所分析的细胞或组织中的表达情况。Western BlotWestern Blot采用聚丙烯酰胺凝胶电采用聚丙烯酰胺凝胶电采用聚丙烯酰胺凝胶电采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，泳，被检测物是蛋白质，泳，被检测物是蛋白质，泳，被检测物是蛋白质，“探针探针探针探针”是抗体，是抗体，是抗体，是抗体，“显色显色显色显色”用标记的二抗。经过用标记的二抗。经过用标记的二抗。经过用标记的二抗。经过PAGEPAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。三、三、Western Blot6969基础课件基础课件 蛋白质印迹(wWesternblotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、膜、中性尼龙膜等）。中性尼龙膜等）。Western（转膜）（转膜）胶里的蛋白质带在电胶里的蛋白质带在电场的作用下场的作用下横向横向转移转移到正极一侧的膜上。到正极一侧的膜上。膜膜胶胶蛋白蛋白7070基础课件基础课件Western blotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转 Blotting原理与原理与ELISA相同。相同。待测蛋白待测蛋白硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜一抗一抗 二抗二抗辣根过氧辣根过氧化物酶化物酶底物底物产物，产物，并发出光并发出光PAGE胶胶待测蛋白待测蛋白底片曝光底片曝光辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：HRPO7171基础课件基础课件 Blotting原理与ELISA相同。待测蛋白硝酸纤 一7272基础课件基础课件72基础课件1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（）用二抗与一抗结合（二抗上带有二抗上带有HRPO）。）。4）清洗掉未结合的二抗。）清洗掉未结合的二抗。5）用）用HRPO的底物浸泡膜。的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。）暗室里曝光，冲洗胶片。Blotting过程Immuno Blotting7373基础课件基础课件1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 2）洗去未结合的一抗结果多克隆抗体多克隆抗体Blotting的的结果结果单抗单抗blotting结结果果7474基础课件基础课件结果多克隆抗体Blotting的结果单抗blotting结四、四、原位杂交原位杂交对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。阳性菌落。需要目的基因的探针。需要目的基因的探针。7575基础课件基础课件四、原位杂交对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌37676基础课件基础课件376基础课件第四节第四节基因基因扩增技术扩增技术-PCR一、基因扩增（一、基因扩增（geneamplification)指生物体内或体外人工方式使基因指生物体内或体外人工方式使基因拷贝拷贝数大规模增加数大规模增加。有下列五种方式：。有下列五种方式：1.环境诱发扩增环境诱发扩增2.基因的程序性扩增5.PCR扩增扩增3.基因组进化扩增基因组进化扩增4.基因工程扩增基因工程扩增7777基础课件基础课件第四节 基因 扩增技术-PCR一、基因扩增（gene 1.环境诱发扩增环境诱发扩增如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。在环境因子的诱发下，某些基因产生明显在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。的扩增。在发育的某个阶段，某些基因的大量扩在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。增。2.基因的程序性扩增如非洲爪蟾卵子形成过程中如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基基因的扩增。因的扩增。7878基础课件基础课件1.环境诱发扩增如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。在环生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的增加，结果相关的基因聚集成簇基因聚集成簇。5.PCR扩增扩增应用聚合酶链式反应（应用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术，在体外特异性地扩）技术，在体外特异性地扩增某个基因。增某个基因。3.基因组进化扩增基因组进化扩增4.基因工程扩增基因工程扩增载体载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。携带目的基因在寄主细胞中大量复制。7979基础课件基础课件生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚（1）1.PCR的发明的发明二、二、PCR技术技术（2）Mullis由此获得由此获得1993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。1985年年Cetus公司的科学家公司的科学家K.B.Mullis发明了发明了PCR，使这一设想变成现实。，使这一设想变成现实。1971年年Khorana提出提出体外人工复制体外人工复制DNA的设想。的设想。当时由于当时由于引物引物和和DNA聚合酶聚合酶及及DNA测序测序技技术都没有解决，设想未能实现。术都没有解决，设想未能实现。PolymeraseChainReaction8080基础课件基础课件（1）1.PCR的发明二、PCR技术（2）Mullis由此8181基础课件基础课件81基础课件（3）TaqDNA聚合酶1988年年R.K.Saiki把把TaqDNA聚合酶聚合酶用到用到PCR反应中。使反应中。使PCR自动循环仪自动循环仪成为可能。成为可能。（4）PCR仪1988年年Cetus公司发明自动热循环仪。公司发明自动热循环仪。1986年年H.A.Erilish从从嗜热嗜热水生菌分离出水生菌分离出耐耐高温高温的的TaqDNA聚合酶，代替大肠杆菌聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶Klenow片断（片断（37oC)，PCR技术才进技术才进入实用阶段。入实用阶段。8282基础课件基础课件（3）Taq DNA 聚合酶1988年 R.K.Saiki8383基础课件基础课件83基础课件PCR仪8484基础课件基础课件PCR仪84基础课件2.PCR技术的原理模板DNA变性引物DNA复性引物DNA延伸8585基础课件基础课件2.PCR技术的原理模板DNA变性引物DNA复性引物DNA双链双链DNA在在受热受热后，配对碱基的氢键断裂，后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为两条链分开成为单链单链。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC35533553TAGAACTTGACGTACGTA95oC（1）DNA模板变性模板模板模板（模板（template）95oC8686基础课件基础课件双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为TGCATGCATATCTTGAAC355TAGAACTTGACGTACGTA3人工合成的单链人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板与所要扩增的模板DNA双链的双链的5端相同端相同。（2）DNA模板与引物复性模板模板模板模板ATCTTGAAC53ACGTACGTA53引物引物引物引物引物（引物（primer）:40-65oC8787基础课件基础课件TGCATGCATATCTTGAAC3 5 5 TAGDNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸伸DNA链。链。（3）DNA链的延伸TGCATGCATATCTTGAAC355TAGAACTTGACGTACGTA3模板模板模板模板ATCTTGAAC5ACGTACGTA5TaqTaq72oC8888基础课件基础课件DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。（3）DNA理论上理论上25-30次循环就可以合成次循环就可以合成225-230条条DNA。变性变性复性复性延伸。延伸。（5）1个循环的结果个循环的结果（4）新一轮循环开始DNAelongation8989基础课件基础课件理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。变性3.PCR的过程（1）第一步）第一步变性（变性（denature）94-95oC下下5分钟，模板分钟，模板DNA双链完全双链完全变性成单链。变性成单链。（2）第二步）第二步复性（复性（anneal）50-60oC下下1分钟，引物优先分钟，引物优先与模板复性。与模板复性。引物的浓度高，引物的浓度高，引物的链短。引物的链短。9090基础课件基础课件3.PCR的过程（1）第一步 变性（denat94oC下下1分钟，新合成的分钟，新合成的DNA双链又双链又变性成单链模板。变性成单链模板。（4）第四步）第四步变性（变性（denature）72oC下下1-2分钟，分钟，TaqDNA聚合酶在引聚合酶在引物的物的3端上加上核苷酸。端上加上核苷酸。（3）第三步延伸（extend）（5）第五步重复（repeat）9191基础课件基础课件94 oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。（4第二步第二步第三步第三步第四步第四步复性复性延伸延伸变性变性95oC5min50oC1min72oC2min94oC1min温度循环9292基础课件基础课件第二步第三步第四步复性延伸变性95oC 5min50PCR仪的温度循环程序9393基础课件基础课件PCR仪的温度循环程序93基础课件9494基础课件基础课件94基础课件PCR9595基础课件基础课件PCR95基础课件需要的模板量极低。需要的模板量极低。4.PCR的特点（1）特异性强）特异性强 PCR使用专门合成的使用专门合成的DNA引物引物。延伸过程是在延伸过程是在高温高温下进行。下进行。（2）敏感性高）敏感性高这就避免了一般这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物聚合酶污染和非引物延伸形成的延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。提高了反映的特异性。理论上只要一条模板链，理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约次循环就可合成约109条！条！9696基础课件基础课件需要的模板量极低。4.PCR的特点（1）特异性强 RT-PCR：对模板的纯度要求低。对模板的纯度要求低。（5）可以扩增）可以扩增mRNA（4）简便先用先用逆转录酶逆转录酶将将mRNA合成合成cDNA，再以，再以cDNA为模板进行扩增。为模板进行扩增。（3）快速）快速整个整个PCR过程约过程约4小时即可完成。小时即可完成。不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。埋的组织切片也可以直接用于作模板。9797基础课件基础课件RT-PCR：对模板的纯度要求低。（5）可以扩增mRNA 自从自从H.A.Erilish分离出耐高温的分离出耐高温的TaqDNA聚聚合酶，代替大肠杆菌合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶Klenow片片断（断（37oC)，PCR技术才进入实用阶段。技术才进入实用阶段。（1）TaqDNA聚合酶聚合酶5.影响PCR的因素TaqDNA聚合酶的最大特点是聚合酶的最大特点是热稳定性热稳定性，耐高温，非常适合耐高温，非常适合PCR过程的反复高温过程的反复高温变性要求。变性要求。热稳定性热稳定性9898基础课件基础课件自从H.A.Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合最适温度：最适温度：75-80oC延伸速度：延伸速度：约约35-150nt/s.酶分子酶分子最长延伸长度：最长延伸长度：6.7kb最适温度高Taq酶的功能缺点酶的功能缺点具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和53外切酶活外切酶活性，但没有性，但没有35外切酶活性。外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对！因此不能修复错误的碱基配对！合成超过合成超过600bp长度的长度的DNA就有可能出就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。现错配，用于克隆基因时必须测序。9999基础课件基础课件最适温度：75-80 oC 最适温度高 金属离子敏感（尤其是金属离子敏感（尤其是Mg2+）。）。当当dNTP（能结合（能结合Mg2+）的浓度为）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，时，MgCl2的最佳浓度应是的最佳浓度应是2.0mmol/L。TaqDNA聚合酶的激活剂50mmol/LKCl也能激活也能激活TaqDNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。4金属离子敏感（尤其是金属离子敏感（尤其是Mg2+）。）。当当dNTP（能结合（能结合Mg2+）的浓度为）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，时，MgCl2的最佳浓度应是的最佳浓度应是2.0mmol/L。TaqDNA聚合酶的激活剂50mmol/LKCl也能激活也能激活TaqDNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。4100100基础课件基础课件金属离子敏感（尤其是Mg2+）。Taq DNA聚合酶（2）其它耐热的DNA聚合酶TthDNA聚合酶聚合酶无无35DNA外切酶活性，但高温下能外切酶活性，但高温下能逆转录逆转录cDNA，又能扩增，又能扩增DNA。VENTDNA聚合酶聚合酶有有35外切酶活性，能够校正碱基的错配。外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受能耐受100oC高温高温。101101基础课件基础课件（2）其它耐热的 DNA聚合酶 Tth DNA聚合PfuDNAPolymerase TaqPlusDNAPolymerase有有3-5的外切酶活性，的外切酶活性，5-3外切酶活性。外切酶活性。但但PCR产物为平端！产物为平端！是目前已发现的所有耐高温是目前已发现的所有耐高温DNA聚合聚合酶中出错率最低的。酶中出错率最低的。是是Taq和和PfuDNA聚合酶的混合物。聚合酶的混合物。Taq的的PCR产物产物3端往往带有一个端往往带有一个A。102102基础课件基础课件 Pfu DNA Polymerase Taq Plus与待扩增的模板与待扩增的模板DNA区段的两区段的两3端序列端序列互补互补（5端相同端相同）的短）的短DNA。（3）引物（primer)位置位置33103103基础课件基础课件与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（5端相同）的即即2.75 1011bp的基因组中有一次完的基因组中有一次完全与全与19个核苷酸的序列相同的机会个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约（或机会是约210-11）。）。引物的长度理论计算：理论计算：419=2.75 1011。一般引物设计为长一般引物设计为长1530bp。104104基础课件基础课件即2.751011 bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸引物的碱基序列5端根据需要可设计成某个端根据需要可设计成某个内切酶的切内切酶的切点点顺序、顺序、RNA聚合酶识别序列聚合酶识别序列、突变位突变位点或生物素标记点或生物素标记等，方便与以后操作。等，方便与以后操作。5ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT33GCTAGCTACTTAAG53端必须与模板正确配对，端必须与模板正确配对，5端可以不配对。