分子克隆载体课件

分子克隆载体1基因工程的表达体系基因工程的表达体系 操纵子理论在基因工程中的应用操纵子理论在基因工程中的应用目的基因翻译表达及其准确性目的基因翻译表达及其准确性常用基因载体常用基因载体基因工程的表达体系2 基因载体是一类能自我复制的基因载体是一类能自我复制的DNADNA分子，其中的分子，其中的一段一段DNADNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源入外源(目的目的)DNA)DNA而将目的而将目的DNADNA带入宿主细胞。带入宿主细胞。常用的载体有质粒、噬菌体、病毒常用的载体有质粒、噬菌体、病毒基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA3分子克隆载体课件45原核生物表达体系：原核生物表达体系：大肠杆菌大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌枯草杆菌、农杆菌原核生物表达体系：6大肠杆菌表达体系的优点：大肠杆菌表达体系的优点：积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；可因不同载体而选择不同菌种作宿主；可因不同载体而选择不同菌种作宿主；操作安全，致病能力低操作安全，致病能力低 ；成本相对低得多成本相对低得多 ；真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆（亚克隆（subclonesubclone），然后采用其它方式转移至真），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达。核细胞上表达。大肠杆菌表达体系的优点：7缺点：缺点：原核生物载体构建的重组体是无法进入原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行表达；动物细胞进行表达；没有加工所需的酶系统；没有加工所需的酶系统；热源、内毒素不易除去热源、内毒素不易除去 ；常会形成包涵体。常会形成包涵体。分子克隆载体课件8表达体系的发展表达体系的发展 表达体表达体表达体表达体 载体载体载体载体 宿主宿主宿主宿主第一代第一代 原核生物表达体系原核生物表达体系 质粒、噬菌体质粒、噬菌体 细菌细菌第二代第二代 酵母表达体系酵母表达体系 穿梭质粒穿梭质粒 酵母酵母第三代第三代 哺乳类细胞表达体系哺乳类细胞表达体系 病毒、脂质体病毒、脂质体 培养细胞培养细胞第四代第四代 基因直接导入基因直接导入 DNA DNA本身本身 生殖细胞、生殖细胞、体细胞、个体体细胞、个体9 基因工程的目的是使目的基因能高效表达。基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结合等组成的表达体系的调控。基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰等水平进行 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。基因工程的目的是使目的基因能高效表达。1011一、启动子与转录调控一、启动子与转录调控 原核生物的转录单位是原核生物的转录单位是操纵子操纵子，操纵子包括，操纵子包括相关结构基因及其上游的调控序列。相关结构基因及其上游的调控序列。结构基因结构基因调控序列调控序列一、启动子与转录调控原核生物的转录单位是操纵子，操纵子包12 操纵子操纵子PP：启动序列：启动序列OO：操纵序列：操纵序列II：调节序列：调节序列 I P PO OCAP调控区调控区 Z Y XZ Y X结构基因结构基因以乳糖操纵子（以乳糖操纵子（lac operonlac operon）为例：为例：操纵子P：启动序列O：操纵序列13诱导物诱导物 Z Y XZ Y X I P PO OCAP Z Y XZ Y X I P PO OCAP诱导物ZYXI14二、强启动子的构建二、强启动子的构建二、强启动子的构建15ZYX侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。3ACACUAGG516sRNA含有串联的来自噬菌体的强启动PL及PR，启动子的串联可能有相互增强作用。含有CIts857组件，此组件可变温诱导目的基因的表达。ZYX四、转录终止结构的插入噬菌体侵入菌体后，把自身DNA加进细菌DNA里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原（lysogen）。可因不同载体而选择不同菌种作宿主；原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行表达；真核生物启动子保守序列核糖体结合位点（S-D序列）它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。Ptac17TTGACATATAAT基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞。一种以pBR322为基础的酵母质粒，两个抗药基因及左下方的半圆来自pBR322，右上半圆来自酵母，包括启动子、糖代谢酶类及氯霉素抗性基因，可在大肠杆菌体系重组再转化酵母细胞称为穿梭质粒（shuttleplasmid）使RNA聚合酶变构，转录停顿；5ATGNATGNATGZ123456保证正确阅读AUG的序列ATGNATGNATG，（LacZ基因N端序列）开始转录开始转录开始转录开始转录T T G A C AT T G A C AA A C T G TA A C T G T-35-35 区区区区(Pribnow box)(Pribnow box)T A T A A T Pu T A T A A T Pu A T A T T A PyA T A T T A Py-10-10 区区区区1 1-30-30-50-501010-10-10-40-40-20-205 5 3 3 3 3 5 5 原核生物启动子保守序列原核生物启动子保守序列原核生物启动子保守序列原核生物启动子保守序列RNA-polRNA-pol辨认位点辨认位点辨认位点辨认位点(recognition site)(recognition site)5 5 5 5 RNARNA聚合酶保护区聚合酶保护区聚合酶保护区聚合酶保护区结构基因结构基因结构基因结构基因3 3 3 3 ZYX开始转录TTG16RNA转录起始转录起始-35区区-10区区TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrp tRNATyrlacrecAAra BAD TTGACA TTGACA TATAAT TATAAT共有序列共有序列RNA转录起始-35区-10区TTGACATTAACTTTT17 TATA TATA盒盒盒盒 CAAT CAAT盒盒盒盒 GC GC盒盒盒盒 增强子增强子增强子增强子 顺式作用元件顺式作用元件顺式作用元件顺式作用元件 结构基因结构基因结构基因结构基因-GCGC-CAAT-TATA-GCGC-CAAT-TATA转录起始转录起始转录起始转录起始真核生物启动子保守序列真核生物启动子保守序列真核生物启动子保守序列真核生物启动子保守序列TATA 盒CAAT盒GC盒增强子顺式作用元件结18RNARNA聚合酶全酶在转录起始区的结合聚合酶全酶在转录起始区的结合聚合酶全酶在转录起始区的结合聚合酶全酶在转录起始区的结合 RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合19P Ptactac启动子启动子 P P P Ptrptrptrptrp与与与与 P P P Placlaclaclac的杂化产物的杂化产物的杂化产物的杂化产物 P P P Ptactactactac比原来各自的活性强比原来各自的活性强比原来各自的活性强比原来各自的活性强 -35-35-35-35区区区区 -10 -10 -10 -10区区区区 Ptrp TTGACA TTAACT 共有序列共有序列共有序列共有序列 TTGACA TATAATTTGACA TATAAT Ptac17 TTGACA TATAATTTGACA TATAAT Ptac启动子20分子克隆载体课件21 乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖 乳糖类似物异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更强的诱导作用。IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物 三、蓝白斑试验（三、蓝白斑试验（IPTG-Xgal IPTG-Xgal 试验试验）乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖三、蓝白斑22诱导物诱导物 Z Y XZ Y X P PO O Z Y XZ Y X P PO O乳糖诱导物ZYXPO23标志补救（标志补救（标志补救（标志补救（-半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）lacZAmN2H 片段片段COOHCOOH 片段片段lacZ标志补救（-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH24X-galLac ZLac Z蓝色化合物蓝色化合物X-galX-galLacZ蓝色化合物X-gal25（LacZLacZ基因基因 N N端序列）端序列）插入片段插入片段（LacZLacZ基因失活）基因失活）LacZLacZ基因基因 N N端序列端序列LacZLacZ酶酶（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）Lac26转录终止：非依赖转录终止：非依赖因子的转录终止需要因子的转录终止需要茎环茎环结构结构，以，以t t（terminationtermination）代表。）代表。C G C G G C G C C G C G C G C G G CG CC CU UA AA AU UG GA A5AUACCA UUUUUUUUU35AUACCA UUUUUUUUU3四、转录终止结构的插入四、转录终止结构的插入转录终止：非依赖因子的转录终止需要茎环结构，以t（term27茎环结构使转录终止的机理茎环结构使转录终止的机理茎环结构使转录终止的机理茎环结构使转录终止的机理 使使使使RNARNA聚合酶变构，转录停顿；聚合酶变构，转录停顿；聚合酶变构，转录停顿；聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，使转录复合物趋于解离，使转录复合物趋于解离，使转录复合物趋于解离，RNARNA产物释放。产物释放。产物释放。产物释放。5pppG5pppG5 5 3 3 3 3 5 5 RNA-pol茎环结构使转录终止的机理使RNA聚合酶变构，转录停顿；528把启动子连同其附属成分，置换了pBR322的tetr基因，成为以启动子为组件的质粒。TATAATPuATATTAPyZYX第一代原核生物表达体系质粒、噬菌体细菌Ptrp与Plac的杂化产物Ptac比原来各自的活性强CGGCCGCGGCIV含有串联的来自噬菌体的强启动PL及PR，启动子的串联可能有相互增强作用。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。如携带杀虫基因的病毒对农作物进行生物防治。如果插入序列自身不含ATG起始密码,或限制酶切点不能把读码框准确置于ATG之后,或插入片段编码未清楚,可在目的基因之前设保险序列:原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行表达；基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞。目的基因翻译表达及其准确性基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。噬菌体的生活周期：如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。分离得到某些噬菌体，在低温时（30）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解。如在Galk基因前插入目的基因，与无插入的空载pKO比较，并无放射活性的增强，则说明插入片段不存在有启动子。五、增强子 转录起始前转录起始前-30-30区为区为TATATATA盒，还有多种顺式作用盒，还有多种顺式作用组件相互配搭成启动子。组件相互配搭成启动子。增强子增强子 远距离地、不同方向地控制启动子的活远距离地、不同方向地控制启动子的活性。增强子的核心序列是性。增强子的核心序列是TGTGGAATTAGTGTGGAATTAG。增强子的作用特点有：增强子的作用特点有：非特异性远距离操纵、非特异性远距离操纵、多方向性。多方向性。酵母结构基因的上游还有上游活化序列（酵母结构基因的上游还有上游活化序列（酵母结构基因的上游还有上游活化序列（酵母结构基因的上游还有上游活化序列（upstream upstream upstream upstream activation sequenceactivation sequenceactivation sequenceactivation sequence，UASUASUASUAS）。）。）。）。把启动子连同其附属成分，置换了pBR322的tetr基因，29目的基因翻译表达及其准确性30核糖体结合位点（核糖体结合位点（S-DS-D序列）序列）mRNA mRNA有与核糖体有与核糖体DNADNA结合的位点结合的位点S-D S-D 序列序列(Shine-Dalgarno)(Shine-Dalgarno)，又称为核糖体结合点。，又称为核糖体结合点。3 A CACUAGG5 16sRNA U CU-C-C-U 5A G G A PuPuUUUPuPuAUG mRNAAGGA后的的7个Pu是核糖体小亚基的辨认部位核糖体结合位点（S-D序列）mRNA有与核糖体DNA31lF1lF1、3 3met-GTP-lF2met-GTP-lF230S30S50S50SGDP+PiGDP+PilF2,lF2,fmetfmetfmetfmet30S30S50S50SlF1lF1、3 3mRNAmRNAGTPGTPlF1、3met-GTP-lF230S50SGDP+PilF32分子克隆载体课件33基因克隆时的定向插入基因克隆时的定向插入 插入序列两边的酶切口不同插入序列两边的酶切口不同,插入的组件不会插入的组件不会倒装，保证了在其下游目的基因插入后，沿倒装，保证了在其下游目的基因插入后，沿5353方向正确转录，这种构建方式称为定向插方向正确转录，这种构建方式称为定向插入入。基因克隆时的定向插入插入序列两边的酶切口不同,插入的34EcoRIHindIIIOriOri复制起复制起点点LacZAPRpUC19EcoRIHindIIIOri复制起点LacZAPRpUC135 如果插入序列自身不含如果插入序列自身不含ATGATG起始密码起始密码,或限制酶切或限制酶切点不能把读码框准确置于点不能把读码框准确置于ATGATG之后之后,或插入片段编码未或插入片段编码未清楚清楚,可在目的基因之前设保险序列可在目的基因之前设保险序列:5ATGNATGNATG 5ATGNATGN ATG 123 456 5ATGN ATG NAT GXY 123 456 5ATG NAT GNA TGZ 123 456能正确读出三联体密码的起始序列能正确读出三联体密码的起始序列如果插入序列自身不含ATG起始密码,或限制酶切点不能36TAAATG I II III IV V I V I II VATG I II III VIIIIIIOri转录起始 翻译起始 信号肽 成熟蛋白质 转录终止区CSCSCSCS-cloning siteTAAATGIIII37常规质粒载体38质粒质粒(plasmid(plasmid)Plasmid Plasmid Plasmid Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环独立于细菌染色体外的双链环独立于细菌染色体外的双链环独立于细菌染色体外的双链环DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。PlasmidchromosomePlasmidchromosome 质粒(plasmid)Plasmid独立于细菌染色体39第二代酵母表达体系穿梭质粒酵母在A蛋白（有终止复制功能），E蛋白（是包装蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组体DNA转入头部。Gal+ATPGal-1-P+ADP6、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。原核生物的转录单位是操纵子，操纵子包括相关结构基因及其上游的调控序列。噬菌体可以容纳较大的目的基因。（1）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；可因不同载体而选择不同菌种作宿主；pBV221分子量小，易转化，操纵子理论在基因工程中的应用如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。ZYXRNA-pol辨认位点AGGA后的的7个Pu是核糖体小亚基的辨认部位原核生物启动子保守序列基因载体应具备的条件：基因载体应具备的条件：（1 1 1 1）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1 1 1 1个；个；个；个；（2 2 2 2）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；（3 3 3 3）有一定容量；）有一定容量；）有一定容量；）有一定容量；（4 4 4 4）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。第二代酵母表达体系穿梭质粒酵40多克隆位点多克隆位点ori复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记AmpAmppolylinker基因载体基因载体多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker411 1 1 1、质粒是细菌染色体外能、质粒是细菌染色体外能、质粒是细菌染色体外能、质粒是细菌染色体外能自主复制自主复制自主复制自主复制的环形双链的环形双链的环形双链的环形双链DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。2 2 2 2、编码、编码、编码、编码抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的质粒叫的质粒叫的质粒叫的质粒叫R R R R质粒质粒质粒质粒。3 3 3 3、质粒、质粒、质粒、质粒DNADNADNADNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制。染色体地复制而复制。染色体地复制而复制。染色体地复制而复制。4 4 4 4、质粒、质粒、质粒、质粒DNADNADNADNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的能在原核和真核细胞中均可复制的能在原核和真核细胞中均可复制的能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒，并在真核细，并在真核细，并在真核细，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。质粒的生物学特性质粒的生物学特性1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。质粒的425 5 5 5、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒严紧型复制质粒严紧型复制质粒严紧型复制质粒（拷贝数少，为（拷贝数少，为（拷贝数少，为（拷贝数少，为1-51-51-51-5个）与个）与个）与个）与松弛型复制质松弛型复制质松弛型复制质松弛型复制质粒粒粒粒（拷贝数多，可达（拷贝数多，可达（拷贝数多，可达（拷贝数多，可达10-20010-20010-20010-200个拷贝）。因此，作为载体的个拷贝）。因此，作为载体的个拷贝）。因此，作为载体的个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。质粒应该是松弛型的。质粒应该是松弛型的。质粒应该是松弛型的。6 6 6 6、质粒的、质粒的、质粒的、质粒的不亲和性不亲和性不亲和性不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不：两种亲缘关系密切的不同质粒，不：两种亲缘关系密切的不同质粒，不：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。5、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制43 第一阶段（第一阶段（第一阶段（第一阶段（1977197719771977年前）：天然质粒和重组质粒的年前）：天然质粒和重组质粒的年前）：天然质粒和重组质粒的年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如利用，如利用，如利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313pSC101,colE1,pCR,pBR313pSC101,colE1,pCR,pBR313pSC101,colE1,pCR,pBR313和和和和pBR322pBR322pBR322pBR322。第二阶段：第二阶段：第二阶段：第二阶段：增大载体容量增大载体容量增大载体容量增大载体容量（降低载体长度），建立（降低载体长度），建立（降低载体长度），建立（降低载体长度），建立多克隆位点区多克隆位点区多克隆位点区多克隆位点区和新的和新的和新的和新的遗传标记遗传标记遗传标记遗传标记基因。如基因。如基因。如基因。如pUCpUCpUCpUC系列载系列载系列载系列载体。体。体。体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如不同要求，如不同要求，如不同要求，如M13mpM13mpM13mpM13mp系列载体，含系列载体，含系列载体，含系列载体，含T3T3T3T3，T7T7T7T7，sp6sp6sp6sp6启动启动启动启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。子载体，表达型载体及各种探针型载体。子载体，表达型载体及各种探针型载体。子载体，表达型载体及各种探针型载体。发展概况发展概况第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如44分子克隆载体课件45 pBR322pBR322pBR322pBR322为为为为4.36kb4.36kb4.36kb4.36kb的的的的环环环环状状状状双双双双链链链链DNADNADNADNA，其其其其碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列已已已已经经经经全全全全部部部部清清清清楚楚楚楚。是是是是最最最最早早早早应应应应用用用用于于于于基基基基因因因因工工工工程程程程的的的的载载载载体体体体之之之之一一一一。把把把把pBR322pBR322pBR322pBR322用用用用限限限限制制制制性性性性内内内内切切切切酶酶酶酶切切切切去去去去某某某某片片片片段段段段，换换换换上上上上合合合合用用用用的的的的表表表表达达达达组组组组件件件件，就就就就可可可可以以以以构建成工作所需的新载体。构建成工作所需的新载体。构建成工作所需的新载体。构建成工作所需的新载体。许许许许多多多多实实实实用用用用的的的的质质质质粒粒粒粒载载载载体体体体都都都都是是是是在在在在pBR322pBR322pBR322pBR322的的的的基基基基础础础础上上上上改改改改建建建建而而而而成成成成。可见其原型质粒在使用上有优点。可见其原型质粒在使用上有优点。可见其原型质粒在使用上有优点。可见其原型质粒在使用上有优点。pBR322pBR322pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序46有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有酶只有单一切口的位点也多达数十个，单一切口的位点也多达数十个，几乎具几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。的优越条件。此外，此外，pBR322DNApBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分分子质量标准子质量标准。有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点47普通型载体普通型载体pBR322的结构图的结构图普通型载体pBR322的结构图48抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段插入片段插入片段插入片段AmpAmp平板平板平板平板TetTet平板平板平板平板抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段Amp平板T49分子克隆载体课件50分子克隆载体课件51pUCpUC质粒系列质粒系列 pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ不得基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker.pUC质粒系列pUC质粒系列也是在pBR322基础上改52476bp476bp片段含有片段含有E.coliE.coli的的lacZlacZ基因的基因的5-5-序列，序列，表达半乳糖苷酶的表达半乳糖苷酶的 片段。片段。LacZLacZ的上游包括乳的上游包括乳糖操纵子上的启动子糖操纵子上的启动子PlacPlac和操纵基因和操纵基因O O。lacZlacZ之内是之内是M13M13的多的多功能连接器。功能连接器。476bp片段含有E.coli的lacZ基因的5-序列，53三个显著特点：三个显著特点：三个显著特点：三个显著特点：（1 1）分子量更小分子量更小分子量更小分子量更小，仅为，仅为，仅为，仅为2.7KB2.7KB，容纳外源，容纳外源，容纳外源，容纳外源DNADNA量增大；量增大；量增大；量增大；具有具有具有具有更高的拷贝数更高的拷贝数更高的拷贝数更高的拷贝数（每个细胞含（每个细胞含（每个细胞含（每个细胞含500-700500-700个拷贝）。个拷贝）。个拷贝）。个拷贝）。（2 2）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源DNADNA插入的标记基因插入的标记基因插入的标记基因插入的标记基因LacZLacZ，可利用可利用可利用可利用 -互补原理进行互补原理进行互补原理进行互补原理进行蓝白筛选。蓝白筛选。蓝白筛选。蓝白筛选。（3 3）多克隆位点区（多克隆位点区（多克隆位点区（多克隆位点区（MCSMCS）由人工合成的多个单一酶切由人工合成的多个单一酶切由人工合成的多个单一酶切由人工合成的多个单一酶切位点构成。位点构成。位点构成。位点构成。其其其其MCSMCS区与区与区与区与M13mpM13mp噬菌体载体的相同，可使噬菌体载体的相同，可使噬菌体载体的相同，可使噬菌体载体的相同，可使pUCpUC上克上克上克上克隆的目的基因直接转移到隆的目的基因直接转移到隆的目的基因直接转移到隆的目的基因直接转移到M13mpM13mp载体，进行载体，进行载体，进行载体，进行DNADNA测序测序测序测序和和和和体外突变体外突变体外突变体外突变等研究。等研究。等研究。等研究。三个显著特点：54pKOpKO系列系列组成：以组成：以半乳糖激酶（半乳糖激酶（GalkGalk）基因取代基因取代pBR322pBR322的的EcoEcoRI-RI-PvuPvuIIII位点包括位点包括terterr r，.表达产物催化表达产物催化 Gal+ATP Gal-1-P+ADP Gal+ATP Gal-1-P+ADP以以1414C C标记的半乳糖作底物标记的半乳糖作底物,检测生成的检测生成的*Gal-1-P*Gal-1-P的的放射性。放射性。pKO系列组成：以半乳糖激酶（Galk）基因取代pBR32255 在在GalkGalk基因上游插入目的基因，根据基因表达基因上游插入目的基因，根据基因表达产物半乳糖激酶活性，即产物半乳糖激酶活性，即1414C-Gal-l-PC-Gal-l-P的放射性，的放射性，可可定量估算启动子功能的强弱定量估算启动子功能的强弱。如在如在GalkGalk基因前插入目的基因，与无插入的空基因前插入目的基因，与无插入的空载载pKOpKO比较，并无放射活性的增强，则说明插入片比较，并无放射活性的增强，则说明插入片段不存在有启动子。段不存在有启动子。在Galk基因上游插入目的基因，根据基因表达产物半乳糖56噬菌体载体57 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体是是是是比比比比细细细细菌菌菌菌还还还还小小小小得得得得多多多多的的的的微微微微生生生生物物物物，和和和和病病病病毒毒毒毒侵侵侵侵犯犯犯犯真真真真核核核核细细细细胞胞胞胞一一一一样样样样，噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体侵侵侵侵犯犯犯犯细细细细菌菌菌菌，也也也也可可可可以以以以认认认认为为为为它它它它是是是是细细细细菌菌菌菌里里里里的的的的“寄寄寄寄生生生生虫虫虫虫”。它它它它本本本本身身身身是是是是一一一一种种种种核核核核蛋蛋蛋蛋白白白白，核核核核心心心心是是是是一一一一段段段段DNADNADNADNA，结结结结构构构构上上上上有有有有一一一一个个个个蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质外外外外壳壳壳壳和和和和尾尾尾尾巴巴巴巴，尾尾尾尾巴巴巴巴上上上上的的的的微微微微丝丝丝丝可可可可以以以以把把把把噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的DNADNADNADNA注入细菌内。注入细菌内。注入细菌内。注入细菌内。噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一58 侵侵犯犯细细菌菌时时，只只是是DNADNA侵侵入入，然然后后利利用用细细菌菌的的酶酶来来复复制、转录、翻译。制、转录、翻译。入入侵侵E.coliE.coli后后，可可以以按按裂裂解解或或建建立立溶溶原原两两种种生生活活方方式生存和繁殖（图式生存和繁殖（图1-51-5）。）。图图左左示示噬噬菌菌体体在在宿宿主主内内进进行行独独立立复复制制，在在1 1个个菌菌体体内内生生长长出出100100个个左左右右的的新新噬噬菌菌体体，并并冲冲破破（杀杀死死）细细菌菌释放出来，再度感染其它活菌，称为裂解。释放出来，再度感染其它活菌，称为裂解。噬噬菌菌体体侵侵入入菌菌体体后后，把把自自身身DNADNA加加进进细细菌菌DNADNA里里（整整合合），作作为为细细菌菌基基因因的的一一部部分分，随随菌菌的的细细胞胞分分裂裂而增殖，这种生活状态称为溶原（而增殖，这种生活状态称为溶原（lysogenlysogen）。）。侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录59噬菌体的生活周期：噬菌体的生活周期：裂解裂解侵入细菌侵入细菌-独立复制独立复制-裂解（冲破细胞膜）裂解（冲破细胞膜）-再感染其他细菌。再感染其他细菌。噬菌体的生活周期：60分子克隆载体课件61噬菌体的结构和用途噬菌体的结构和用途 噬菌体线性双链噬菌体线性双链DNADNA病毒，具有末端互补的病毒，具有末端互补的12nt12nt，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48 48 531bp531bp，含，含5050多个基因。多个基因。噬菌体的结构和用途噬菌体线性双链DNA病毒，具有末端62噬菌体基因大致分为噬菌体基因大致分为4 4个区：个区：结构区结构区结构区结构区A A A A J19 J19 J19 J19个基因，个基因，个基因，个基因，编码头、编码头、编码头、编码头、尾部蛋白质为尾部蛋白质为尾部蛋白质为尾部蛋白质为结构区结构区结构区结构区,重组区重组区重组区重组区 attattattatt（attachmentattachmentattachmentattachment）、）、）、）、intintintint（intagrateintagrateintagrateintagrate）及）及）及）及xisxisxisxis（excissionexcissionexcissionexcission），），），），调控区调控区调控区调控区启动子、终止子和启动子、终止子和启动子、终止子和启动子、终止子和N N N N、CICICICI基因基因基因基因，O-R O-R O-R O-R 为为为为裂解区裂解区裂解区裂解区.噬菌体基因大致分为4个区：63噬菌体及其组件的应用噬菌体及其组件的应用 噬菌体可以噬菌体可以噬菌体可以噬菌体可以容纳较大的目的基因容纳较大的目的基因容纳较大的目的基因容纳较大的目的基因。例如用置换法可。例如用置换法可。例如用置换法可。例如用置换法可去掉长达去掉长达去掉长达去掉长达20kb20kb20kb20kb的的的的DNADNADNADNA，换入相应长度的目的基因。，换入相应长度的目的基因。，换入相应长度的目的基因。，换入相应长度的目的基因。基因文库构建基因文库构建基因文库构建基因文库构建常使用常使用常使用常使用 载体；载体；载体；载体；不少先进的质粒应用不少先进的质粒应用不少先进的质粒应用不少先进的质粒应用 组件组件组件组件进行构建。进行构建。进行构建。进行构建。噬菌体及其组件的应用噬菌体可以容纳较大的目的基因64 噬菌体从溶原转为裂解是一种噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程可诱导过程。诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导:分分离离得得到到某某些些噬噬菌菌体体，在在低低温温时时（3030）建建立立溶溶原原，用用高高温温（42420 0C C）则则出出现现裂裂解解。这这些些噬噬菌菌体体的的clcl基基因因是是温温度敏感突变型的，称为度敏感突变型的，称为c1c1tsts。cl cl ts1857ts1857，可可作作为为组组件件插插入入质质粒粒DNADNA内内。目目的的基基因因插插在在cl cl ts857ts857下下游游，重重组组体体的的目目的的基基因因在在4242表表达达，3030不不表达。这种方法称为表达。这种方法称为热诱导表达热诱导表达热诱导表达热诱导表达，使用的是，使用的是温敏开关。温敏开关。温敏开关。温敏开关。CICIts857ts857噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程。CIts65ori目的基因PL阻遏蛋白30下培养：下培养：ori目的基因PL阻遏蛋白30下培养：66目的基因目的基因阻遏阻遏蛋白蛋白42下培养：下培养：失活失活目的基因阻遏蛋白42下培养：失活67PPL L和和 P PR R PL和PR 是噬菌体上2个主要的启动子，都是启动能力相当强的转录构件。把启动子连同其附属成分，置换了pBR322的tetr基因，成为以启动子为组件的质粒。PL和PRPL和PR是噬菌体上2个主要的启动68（1 1 1 1）粘粒（）粘粒（）粘粒（）粘粒（cosmidcosmidcosmidcosmid）能容纳能容纳能容纳能容纳大片段大片段大片段大片段（45kb45kb45kb45kb）的小分子（的小分子（的小分子（的小分子（4kb4kb4kb4kb 6kb 6kb 6kb 6kb）载）载）载）载体。体。体。体。组成：质粒复制原点，组成：质粒复制原点，组成：质粒复制原点，组成：质粒复制原点，抗药基因，多克隆位点，抗药基因，多克隆位点，抗药基因，多克隆位点，抗药基因，多克隆位点，已连接入的已连接入的已连接入的已连接入的coscoscoscos位点。位点。位点。位点。构建基因文库的构建基因文库的载体载体（1）粘粒（cosmid）构建基因文库的载体69（2 2）DNADNA的体外包装的体外包装 是提高是提高噬菌体噬菌体转染效率转染效率的有效方法的有效方法 在在A A蛋白蛋白（有终止复制功能），（有终止复制功能），E E蛋白蛋白（是包装（是包装蛋白），蛋白），D D蛋白蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组（是插入蛋白）共同作用下使重组体体DNADNA转入头部。转入头部。（2）DNA的体外包装70分子克隆载体课件71高效表达质粒72组成特点组成特点:强启动子强启动子,保证正确阅读保证正确阅读AUGAUG的序列的序列ATGNATGNATGATGNATGNATG，rrnB rrnB抗终止序列，抗终止序列，多位点接头。多位点接头。组成特点:73pBVpBV系列质粒系列质粒 pBV221分子量小，易转化，含有串联的来自噬菌体的强启动PL及PR，启动子的串联可能有相互增强作用。含有CIts857组件，此组件可变温诱导目的基因的表达。这一组件的存在，还可适当地抑制宿主菌的蛋白酶活性，达到提高表达量的目的。pBV系列质粒74带有真核生物基因表达组件的质粒带有真核生物基因表达组件的质粒 真核生物与原核生物催化转录、翻译及其后修饰的酶和起始复合物的结构不同，医学研究需要能表达真核生物基因的表达载体。由于病毒对宿主细胞有依赖性和可整合性，真核表达组件不少来自病毒。如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。带有真核生物基因表达组件的质粒75分子克隆载体课件76分子克隆载体课件77分子克隆载体课件78酵母质粒和大容量载体79酵母是单细胞真核生物，可接受质粒转化。酵母是单细胞真核生物，可接受质粒转化。酵母是单细胞真核生物，可接受质粒转化。酵母是单细胞真核生物，可接受质粒转化。酵母质粒有酵母质粒有酵母质粒有酵母质粒有YipYipYipYip（integrateintegrateintegrateintegrate）整合型，）整合型，）整合型，）整合型，Yep Yep Yep Yep（epi-someepi-someepi-someepi-some）附加体型，）附加体型，）附加体型，）附加体型，Yrp Yrp Yrp Yrp（replicationreplicationreplicationreplication）复制型。）复制型。）复制型。）复制型。酵母是单细胞真核生物，可接受质粒转化。80 pYEJ001pYEJ001 一种以pBR322为基础的酵母质粒，两个抗药基因及左下方的半圆来自pBR322，右上半圆来自酵母，包括启动子、糖代谢酶类及氯霉素抗性基因，可在大肠杆菌体系重组再转化酵母细胞 称为穿梭质粒（shuttle plasmid）pYEJ00181昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒（baculovirusbaculovirus）如核型多角体病毒如核型多角体病毒ACNPV ACNPV，昆虫体系的优点是，昆虫体系的优点是表表达效率高达效率高，目的基因插入的，目的基因插入的容量相对大容量相对大，使用安全，使用安全等等 。目前在农业基因工程上应用较多。如携带杀虫目前在农业基因工程上应用较多。如携带杀虫基因的病毒对农作物进行生物防治。基因的病毒对农作物进行生物防治。昆虫杆状病毒（baculovirus）82YAC酵母人工染色体 把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母的转录功能和复制功能。pYAC只以单抄本方式繁殖，所以不适用于以生产为目的的基因工程。主要用于人类基因组研究和巨大基因如DMD基因达Mbp（106bp）数量级基因的克隆。YAC酵母人工染色体83分子克隆载体课件84分子克隆载体课件85