第二章核酸化学课件

第二章核酸化学第二章核酸化学Nucleic Acid Chemistry第二章核酸化学Nucleic Acid Chemistry1核核酸酸是是一一类类重重要要的的生生物物大大分分子子，担担负负着着生命信息的储存与传递。生命信息的储存与传递。核核酸酸是是现现代代生生物物化化学学、分分子子生生物物学学的的重重要要研研究究领领域域，是是基基因因工工程程操操作作的的核核心心分分子。子。核酸概述核酸概述核酸是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。核酸2第一节第一节 核酸是遗传物质的载体核酸是遗传物质的载体一、核酸的发现史一、核酸的发现史18681868年，年，F.MiescherF.Miescher从细胞核中分从细胞核中分离得到一种含磷量很高的酸性物质，离得到一种含磷量很高的酸性物质，即现在被称为核酸的物质。即现在被称为核酸的物质。第一节 核酸是遗传物质的载体一、核酸的发现史31944年，年，Avery的转换转化实验的转换转化实验orand可分离可分离1944年，Avery的转换转化实验orand可分离419431943年，年，chargaffchargaff等证明了等证明了DNADNA中四种碱基的比例并不相等中四种碱基的比例并不相等19531953年，年，WatsonWatson、CrickCrick发现发现 DNADNA双螺旋模型双螺旋模型核酶（核酶（RibozymeRibozyme）第二章核酸化学课件5 98 98核中（染色体中）核中（染色体中）真核真核 线粒体（线粒体（mDNAmDNA）核外核外 叶绿体（叶绿体（ctDNActDNA）DNA DNA 拟核拟核 原核原核 质粒（质粒（plasmidplasmid）病毒：病毒：DNADNA病毒病毒二、二、核酸的种类和分布核酸的种类和分布 核酸分为两大类：核酸分为两大类：脱氧核糖核酸：脱氧核糖核酸：Deoxyribonucleic Acid Deoxyribonucleic Acid（DNADNA）核糖核酸：核糖核酸：Ribonucleic Acid Ribonucleic Acid（RNARNA）98核中（染色体中）二、核6RNARNA主要存在于细胞质中主要存在于细胞质中 l tRNAl rRNAl mRNAl 其它其它（4.5SRNA,5SRNA;sRNA;反义反义RNA,核酶等）核酶等）l RNA病毒病毒三、分子生物学的中心法则RNA主要存在于细胞质中 tRNA三、分子生物学的中心法7第二节第二节 核酸的基本化学组成核酸的基本化学组成核酸核酸核苷酸核苷酸核苷核苷磷酸磷酸碱基碱基戊糖戊糖元素组成：元素组成：C H O N P C H O N P 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定。第二节 核酸的基本化学组成核酸核苷酸核苷磷酸碱基戊糖元素组成8 组成核酸的戊糖有两种。组成核酸的戊糖有两种。DNA所含所含的糖为的糖为 -D-2-脱氧核糖；脱氧核糖；RNA所含的糖所含的糖则为则为-D-核糖。核糖。一、戊糖一、戊糖RiboseRiboseDeoxyriboseDeoxyribose 组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为91.嘧啶（嘧啶（Pyrimidine）1 12 23 34 45 56 6尿嘧啶尿嘧啶uracilU胞嘧啶胞嘧啶cytosineC胸腺嘧啶胸腺嘧啶thymineT二、碱基二、碱基1.嘧啶（Pyrimidine）123456尿嘧啶U胞嘧啶10二、碱基二、碱基 1.嘧啶（嘧啶（Pyrimidine）尿嘧啶尿嘧啶uracil胞嘧啶胞嘧啶cytosine胸腺嘧啶胸腺嘧啶thymineUCT二、碱基 1.嘧啶（Pyrimidine）尿嘧啶胞嘧啶胸11稀有碱基稀有碱基稀有碱基12l腺嘌呤腺嘌呤 AdenineA A2.嘌呤（嘌呤（Purine）1 12 23 34 45 56 69 97 78 8l鸟嘌呤鸟嘌呤GuanineGG腺嘌呤 AdenineA2.嘌呤（Purine）123132.嘌呤嘌呤（Purine）腺嘌呤腺嘌呤 Adenine鸟嘌呤鸟嘌呤GuanineA AGG2.嘌呤（Purine）腺嘌呤 Adenine鸟嘌呤14稀有碱基稀有碱基稀有碱基15 核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。如基化产物。如7甲基鸟嘌呤（核苷酸）：甲基鸟嘌呤（核苷酸）：核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种16第二章核酸化学课件17三、核苷三、核苷（nucleoside）核苷核苷 戊糖戊糖+碱基碱基 糖与碱基之间的糖与碱基之间的C-NC-N键，称为键，称为C-NC-N糖苷键糖苷键1122334455(OH)1122334455(OH)三、核苷（nucleoside）核苷 戊糖+碱基 118Adenosine Guanosine Cytidine UridineAdenosine Guanosine 19四、核苷酸（四、核苷酸（nucleotide）核苷酸核苷酸 核苷核苷+磷酸磷酸 戊糖戊糖+碱基碱基+磷酸磷酸HHHHHHH H H四、核苷酸（nucleotide）核苷酸 核20五、核苷酸衍生物五、核苷酸衍生物1.1.继续磷酸化继续磷酸化AMPADPATP五、核苷酸衍生物1.继续磷酸化AMPADPATP212.2.环磷酸化环磷酸化l cAMPl cGMP2.环磷酸化 cAMP cGMP223.3.肌苷酸及鸟苷酸肌苷酸及鸟苷酸4.4.辅酶辅酶 NAD NAD、NADPNADP、FMNFMNIMP GMP3.肌苷酸及鸟苷酸4.辅酶 NAD、NADP23六、多聚核苷酸（核酸）六、多聚核苷酸（核酸）多聚核苷酸是通过一个核苷酸的多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C C3 3-OH-OH 与另一分子核苷酸的与另一分子核苷酸的5-5-磷酸基形成磷酸基形成3,5-3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。物。5533六、多聚核苷酸（核酸）多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-O24第二章核酸化学课件25l5-5-磷酸端磷酸端(常用常用5-P5-P表示表示);3-);3-羟基端（常用羟基端（常用3-OH3-OH表示）表示）l多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是时，必须注明它的方向是5353或是或是3535。多聚核苷酸的表示方式多聚核苷酸的表示方式DNA RNA5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGUT53OH U53OH OH OH OH OH 5-磷酸端(常用5-P表示);3-羟基端（常用3-26第三节第三节 DNA DNA的结构的结构一、一、DNADNA的的一级结构一级结构脱氧核糖核酸的排列顺序脱氧核糖核酸的排列顺序l l可以用碱基排列顺序表示可以用碱基排列顺序表示连接键：连接键：33，5-5-磷酸二酯键磷酸二酯键l l磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架l l碱基形成侧链碱基形成侧链多核苷酸链均有多核苷酸链均有5-5-末端和末端和3-3-末端末端 DNA DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNADNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。组合之中。第三节 DNA的结构一、DNA的一级结构272.基因与基因组基因与基因组基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA分子的最小功能单位（交换单位）。蛋白质（蛋白质（mRNA 蛋白质）蛋白质）产物产物 tRNA RNA rRNA 调节功能：调节基因调节功能：调节基因无产物无产物 作用未知作用未知(占绝大多数）占绝大多数）结构基因结构基因2.基因与基因组基因（gene）：一段有功能的DNA片段，28基因组（基因组（genomegenome）：某生物体（完整单倍体）所：某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和。包括：核基因组（拟核含全部遗传物质的总和。包括：核基因组（拟核/核核DNADNA）及核外（质粒）及核外（质粒/质体质体DNA/DNA/线粒体线粒体DNADNA）bp bp（碱基对（碱基对）103 104 105 106 107 108 109 1010 1011 1012人人两栖类两栖类鱼类鱼类藻类藻类酵母酵母细菌细菌E.ColiE.Coli病毒病毒质粒质粒各种细胞、病毒和细菌质粒中基因组的大小各种细胞、病毒和细菌质粒中基因组的大小基因组（genome）：某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物293.原核生物基因组特点原核生物基因组特点l 重复序列少，编码区占比例大重复序列少，编码区占比例大l 多以操纵子的形式组织在一起多以操纵子的形式组织在一起l 有重叠基因存在有重叠基因存在4.真核生物基因组特点真核生物基因组特点l 以染色体形式存在以染色体形式存在l 重复序列多，非编码区占绝大部分重复序列多，非编码区占绝大部分l 有断裂基因有断裂基因（内含子和外显子）（内含子和外显子）基因组计划基因组计划 人类基因组计划（人类基因组计划（人类基因组计划（人类基因组计划（Human Genome ProjectHuman Genome ProjectHuman Genome ProjectHuman Genome Project，HGP HGP HGP HGP）酵母基因组计划酵母基因组计划酵母基因组计划酵母基因组计划 （YGPYGPYGPYGP）大肠杆菌（大肠杆菌（大肠杆菌（大肠杆菌（E.ColiE.ColiE.ColiE.Coli）3.原核生物基因组特点 真核生物基因组特点基因组计划30第二章核酸化学课件31二、二、DNA的二级结构的二级结构 DNA的双螺旋模型的双螺旋模型19531953年年，J.J.WatsonWatson和和F.F.Crick Crick 在在前前人人研研究究工工作作的的基基础础上上，根根据据DNADNA结结晶晶的的X-X-衍衍射射图图谱谱和和分分子子模模型型，提提出出了了著著名名的的DNADNA双双螺螺旋旋结结构构模模型型，并并对对模模型型的的生生物物学学意意义义作作出出了了科科学学的的解解释释和和预测。预测。在在DNADNA分分子子中中，嘌嘌呤呤碱碱基基的的总总数数与与嘧嘧啶啶碱碱基基的的总总数数相相等。等。二、DNA的二级结构 DNA的双螺旋模型1953年，J.32DNADNA双螺旋模型要点双螺旋模型要点B B型结构型结构 两条链反向平行，右手螺旋两条链反向平行，右手螺旋 碱基在内（碱基在内（A AT T，GCGC）碱基平面垂直于螺旋轴碱基平面垂直于螺旋轴 戊糖在外，双螺旋每转一周戊糖在外，双螺旋每转一周 为为1010碱基对（碱基对（bpbp）螺距为）螺距为3.43.4nmnm，0.34nm/bp 0.34nm/bpA A型结构型结构 碱基平面倾斜碱基平面倾斜2020，螺旋变，螺旋变粗变短，螺距粗变短，螺距2 23nm3nm。Z Z型结构型结构 左手螺旋，只有小沟左手螺旋，只有小沟2.0 nm小小沟沟大大沟沟DNA双螺旋模型要点B型结构 2.0 nm小沟大沟33第二章核酸化学课件34双螺旋双螺旋DNADNA的结构参数的结构参数类型旋转方向螺旋直径（nm）螺距（nm）每转碱基对数目碱基对间垂直 距离（nm）碱基对与水平面倾角ADNABDNAZDNA右右左2.02.31.82.83.44.51110120.2550.340.272007稳定双螺旋结构的作用力及破坏双螺旋结构的因素稳定双螺旋结构的作用力及破坏双螺旋结构的因素 氢键氢键 碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力）碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力）离子键等离子键等而而DNADNA变性剂变性剂(热、热、pHpH、脲、脲/酰胺、有机溶剂酰胺、有机溶剂)则破则破 坏坏双螺旋结构双螺旋结构双螺旋DNA的结构参数类型旋转方向螺旋直径（nm）螺距（35DNADNA的存在形式的存在形式2-10-30-150-300-700-14002-10-30-150-300-700-1400 DNA-DNA-核小体核小体-纤丝纤丝-突环突环-花结花结-螺旋圈螺旋圈-染色体染色体 DNA的存在形式2-10-30-150-300-700-1436二、二、DNADNA的三级结构的三级结构DNADNA双螺旋的进一步扭曲构成三级结构，双螺旋的进一步扭曲构成三级结构，负超螺旋负超螺旋（双螺旋的螺旋）（双螺旋的螺旋）原核原核 双链环状双链环状DNADNA（dcDNAdcDNA）病毒病毒 单链环状单链环状DNADNA（scDNAscDNA）单链线性单链线性DNADNA（ssDNAssDNA）二、DNA的三级结构DNA双螺旋的进一步扭曲构成三级结构，负37第二章核酸化学课件38当当DNADNA双螺旋分子在溶液中以一定的构象自由双螺旋分子在溶液中以一定的构象自由纯在时，双螺旋处在能量最低的状态此为松纯在时，双螺旋处在能量最低的状态此为松弛态。如果是这种正常的弛态。如果是这种正常的DNADNA分子额外的多转分子额外的多转几圈或少转几圈，就会使双螺旋中存在张力。几圈或少转几圈，就会使双螺旋中存在张力。当双螺旋分子的末端是开放的，这种张力可当双螺旋分子的末端是开放的，这种张力可以通过链的转动释放出来，以通过链的转动释放出来，DNADNA将恢复正常的将恢复正常的状态。但如果状态。但如果DNADNA分子的两端是固定的，这种分子的两端是固定的，这种额外的张力就不能释放出来，额外的张力就不能释放出来，DNA DNA分子本身分子本身就会发生扭曲，用以抵销张力。这种扭曲称就会发生扭曲，用以抵销张力。这种扭曲称为超螺旋，是双螺旋的螺旋。为超螺旋，是双螺旋的螺旋。当DNA双螺旋分子在溶液中以一定的构象自由纯在时，双螺旋处在39真核真核 双链线性双链线性DNA（dsDNA）真核 双链线性DNA（dsDNA）40第二章核酸化学课件41第四节第四节 RNA RNA的结构与功能的结构与功能一、结构特点一、结构特点1.碱基组成碱基组成 A、G、C、U（AU/GC）稀有碱基较多，稳定性较差，易水解稀有碱基较多，稳定性较差，易水解2.多为单链结构，少数在局部形成双螺旋多为单链结构，少数在局部形成双螺旋3.分子较小分子较小4.分类分类lmRNA（hnRNA 核内不均一核内不均一RNA）ltRNA lrRNA（snRNA/asRNA）l少数少数RNA病毒病毒第四节 RNA的结构与功能一、结构特点42二、二、tRNA占占RNARNA总量的总量的1515一种氨基酸对应至少一种一种氨基酸对应至少一种tRNAtRNAl分子量分子量2500025000左右，大约由左右，大约由70709090个核苷酸组成，沉降系个核苷酸组成，沉降系数为数为4S4S左右。左右。l分子中含有较多的修饰碱基。分子中含有较多的修饰碱基。l l3333-末端都具有末端都具有-CCA-OH-CCA-OH的的结构。结构。l三叶草二级结构三叶草二级结构l一般有四环四臂组成一般有四环四臂组成l氨基酸臂、氨基酸臂、D D臂、反密码子臂、臂、反密码子臂、TCTC臂臂lD D环、反密码子环、可变环、环、反密码子环、可变环、TCTC环环l“倒写的字母倒写的字母L”L”三级结构三级结构二、tRNA占RNA总量的15分子量25000左右，大约由43tRNA的三级结构的三级结构(76bp)tRNA的三级结构(76bp)44第二章核酸化学课件45三、三、rRNA占占RNA总量的总量的80原核生物原核生物真核生物真核生物核糖体核糖体rRNA核糖体核糖体rRNA 30s 70s 50s16s5s、23s 40s 80s 60s 18s5s、5.8s、28s大肠杆菌大肠杆菌5sRNA的结构的结构三、rRNA占RNA总量的80原核生物真核生物核糖体rRN46四、四、mRNA和和hnRNA占细胞总占细胞总RNA的的35真核细胞真核细胞mRNAmRNA的的3-3-末端有一段长达末端有一段长达200200个核苷酸左个核苷酸左右的多聚腺苷酸右的多聚腺苷酸(polyA)(polyA)，称为，称为“尾结构尾结构”，5-5-末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为“帽子结构帽子结构”。占细胞总占细胞总RNA的的35四、mRNA和hnRNA占细胞总RNA的35真核细胞m47五五、snRNA （small nucleic RNA 核小核小RNA）U-RNA、RNP scRNA （small cytoplasmic RNA）asRNA （antisense RNA）五、snRNA （small nucleic RNA 核48第五节第五节 核酸的性质核酸的性质一、一般理化性质一、一般理化性质l 两性解离两性解离/一般呈酸性（在中性溶液中带负电荷），一般呈酸性（在中性溶液中带负电荷），微微 溶于水，不溶于有机溶剂溶于水，不溶于有机溶剂l线性大分子（粘度高、抗剪切力差）线性大分子（粘度高、抗剪切力差）乙醇乙醇l可用电泳或离子交换（色谱）进行分离可用电泳或离子交换（色谱）进行分离l室温条件下，室温条件下，DNADNA在碱中变性，但不水解，在碱中变性，但不水解，RNARNA水解水解 颜色反应颜色反应l加热条件下，加热条件下，D D核糖浓盐酸苔黑酚核糖浓盐酸苔黑酚 绿色绿色 D D2 2脱氧核糖酸二苯胺脱氧核糖酸二苯胺 蓝紫色蓝紫色第五节 核酸的性质一、一般理化性质49二、核酸的紫外吸收特性二、核酸的紫外吸收特性在核酸分子中，由于嘌呤在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。性和定量测定的依据。DNA和和RNA溶液中加入溴溶液中加入溴化乙锭（化乙锭（EB），在紫光外），在紫光外下发出荧光下发出荧光核酸比其各核苷酸的光吸核酸比其各核苷酸的光吸收值之和少收值之和少30%40%二、核酸的紫外吸收特性在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共50三、核酸的变性、复性与分子杂交三、核酸的变性、复性与分子杂交1.变性变性稳定核酸双螺旋结构的次级键断裂，空间结构破稳定核酸双螺旋结构的次级键断裂，空间结构破坏，变成单链无规线团结构的过程。核酸的一级坏，变成单链无规线团结构的过程。核酸的一级结构结构(碱基顺序碱基顺序)保持不变。保持不变。变性表征：部分生物活性丧失、粘度下降、浮力变性表征：部分生物活性丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）密度升高、紫外吸收增加（增色效应）变性因素变性因素 pH（11.3或或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）低离子强度低离子强度 加热加热三、核酸的变性、复性与分子杂交1.变性51DNA的变性过程是突然性的的变性过程是突然性的，它在很窄的温度区间内完成。，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大增量一半时的温度称为因此，通常将紫外吸收的增加量达最大增量一半时的温度称为熔解温度，用熔解温度，用Tm表示。表示。一般一般DNA的的Tm值在值在70-85 C之间。之间。DNA的的Tm值与分子中的值与分子中的GC 的含量有关。的含量有关。GC 的含量高，的含量高，Tm值就高。因而测定值就高。因而测定Tm值，可反映值，可反映DNA分子分子中中GC的含量，可通过经验公式计算：的含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.442.热变性和热变性和TmDNA的变性过程是突然性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，523.核酸的复性核酸的复性变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为的过程称为复性复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。具减色效应。得到部分的恢复。具减色效应。将热变性的将热变性的DNA骤然冷却至低温时，骤然冷却至低温时，DNA不能复性。而变性的不能复性。而变性的DNA只有在缓慢冷却时才可复性，复性过程又称为只有在缓慢冷却时才可复性，复性过程又称为“退火退火”。退火温度退火温度Tm25影响复性的因素影响复性的因素片段浓度片段浓度片段大小片段大小片段复杂性（重复序列数目）片段复杂性（重复序列数目）溶液的离子强度溶液的离子强度 3.核酸的复性变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为53第二章核酸化学课件544.4.分子杂交分子杂交DNA单链与在某些区域有互补序列的异源单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为成的新分子称为杂交分子杂交分子。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。有重要意义。Southern 杂交杂交（Southern bolting）：）：DNANorthern 杂交杂交（Northern bolting）：）：RNAWestern 杂交杂交（Western bolting）：蛋白质）：蛋白质4.分子杂交DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链55分子杂交操作过程示意图分子杂交操作过程示意图分子杂交操作过程示意图56第二章核酸化学课件57四、核酸的序列测定四、核酸的序列测定1.双脱氧链终止双脱氧链终止法（法（Sanger酶酶法）如右图：法）如右图：2.2.Gilbert化化学降解法（略）学降解法（略）四、核酸的序列测定双脱氧链终止法（Sanger酶法）如右图58第二章核酸化学课件59第二章核酸化学课件60本本 章章 小小 结结v核酸是遗传物质载体的证明和研究历史核酸是遗传物质载体的证明和研究历史v核酸的化学结构：戊糖、碱基（核酸的化学结构：戊糖、碱基（A A、T T、G G、C C、U U），核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原），核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号）子编号）vDNADNA的结构：一级结构的结构：一级结构(核苷酸排列顺序及其表核苷酸排列顺序及其表示、核苷酸之间的连接方式、基因及基因组、核示、核苷酸之间的连接方式、基因及基因组、核酸序列的测定酸序列的测定)、二级结构、二级结构(Watson-Crick(Watson-Crick双双螺旋模型、螺旋模型、Z ZDNA)DNA)、维持二级结构的化学键。、维持二级结构的化学键。vRNARNA种类、结构与功能，种类、结构与功能，RNARNA碱基组成上的特点。碱基组成上的特点。v核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交本 章 小 结核酸是遗传物质载体的证明和研究历史61谢谢谢谢62