第23章 DNA操作的基本技术课件

目目 录录目目 录录1第二十三章第二十三章 DNADNA操作的基本技术操作的基本技术The Basic Technologies for DNA Manipulations1第二十三章 DNA操作的基本技术The Basic 1目目 录录2第一节第一节 核酸印迹技术与分子杂交核酸印迹技术与分子杂交Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization2第一节 核酸印迹技术与分子杂交Nucleic Aci2目目 录录3什么是核酸分子杂交什么是核酸分子杂交 核酸分子杂交（核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization）以以DNA的变性、复性为理论基础的变性、复性为理论基础指具有一定同源序列的两条核酸单链（指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程过复性处理后，形成异源双链的过程 3什么是核酸分子杂交 核酸分子杂交（nucleotide m3目目 录录4一、一、Southern 印迹可用于分析基因印迹可用于分析基因拷贝数的变化拷贝数的变化由由E.M.Southern在在1975年提出年提出可用于分析基因拷贝数的变化可用于分析基因拷贝数的变化基本操作过程包括基本操作过程包括待测待测DNA样品的制备和基因探针的标记；样品的制备和基因探针的标记；待测待测DNA样品的电泳分离；样品的电泳分离；电泳分离的电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的经变性、转移、固定到合适的固相支持物；固相支持物；特异性核酸探针与膜上特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自片段杂交，放射自显影或显色检测目的显影或显色检测目的DNA的存在。的存在。4一、Southern 印迹可用于分析基因拷贝数的变化由E4目目 录录5Southern印迹分析基本流程印迹分析基本流程滤纸NC膜凝胶滤纸电泳电泳 转移转移 杂交，显影杂交，显影酶切酶切DNADNA样品上样样品上样 DNADNA印迹印迹重物缓冲液5Southern印迹分析基本流程滤纸电泳 5目目 录录6二、二、Northern 印迹和印迹和RT-PCR可用于可用于分析基因转录水平的变化分析基因转录水平的变化Northern blot是是将将RNA从从凝凝胶胶中中转转印印到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，定定性性分分析析mRNA的的常常用用方方法；法；RT-PCR是是 以以 mRNA为为 模模 板板 反反 转转 录录 合合 成成cDNA、再再以以cDNA为为模模板板进进行行特特异异性性扩扩增增，进行进行RNA定性或定量分析的一种方法；定性或定量分析的一种方法；二者均可用于分析基因转录水平的变化二者均可用于分析基因转录水平的变化。6二、Northern 印迹和RT-PCR可用于分析基因转6目目 录录第23章 DNA操作的基本技术课件7目目 录录第23章 DNA操作的基本技术课件8目目 录录9FISH箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置9FISH箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置9目目 录录10（二）利用原位杂交技术确定特定基因的（二）利用原位杂交技术确定特定基因的表达定位表达定位RNA原位杂交原位杂交 整体原位杂交（整体原位杂交（Whole mount in situ hybridization,WISH）10（二）利用原位杂交技术确定特定基因的表达定位RNA原位10目目 录录11第二节第二节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction11第二节 聚合酶链式反应Polymerase Cha11目目 录录12什么是聚合酶链式反应什么是聚合酶链式反应聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；由由K.Mullis于于1983年建立年建立；可用于分析基因及其产物的水平变化；可用于分析基因及其产物的水平变化；可进行实时、定量分析可进行实时、定量分析；可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列序列的相互作用。的相互作用。12什么是聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerase12目目 录录13PCR技术的工作原理技术的工作原理53355335+55变性、退火变性、退火引物引物5335+55dNTPsTaq DNA聚合酶聚合酶不同长度新链不同长度新链DNA循环循环1+引物引物变性、退火变性、退火13PCR技术的工作原理5353+55变性、退13目目 录录142530 次循环后，模板次循环后，模板DNA得到扩增得到扩增5335+5335+5335+5335+dNTP Taq DNA 聚合酶聚合酶均一长度新链均一长度新链DNADNA循环循环2142530 次循环后，模板DNA得到扩增53+5314目目 录录15一、一、PCR技术分析基因及其产物技术分析基因及其产物反反转转录录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是是将将RNA的的反反转转录录反反应应和和PCR反反应联合应用的一种技术。应联合应用的一种技术。RT-PCR是是目目前前从从组组织织或或细细胞胞中中获获得得目目的的基基因因以以及及对对已已知知序序列列的的RNA进进行行定定性性及及半半定定量分析的最有效方法。量分析的最有效方法。15一、PCR技术分析基因及其产物反转录PCR（revers15目目 录录16mRNA 5 AAAAAA(n)3 mRNA 5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 mRNA 5 cDNA 3 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 oligo(dT)12-18反转录酶反转录酶RNase HDNA 聚合酶聚合酶S1 核酸酶核酸酶3 cDNATTTTTT(n)5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 反转录合成反转录合成cDNA16mRNA 5AAAAAA(n)3mRNA 516目目 录录17二、二、PCR技术可以进行实时、技术可以进行实时、定量分析定量分析QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 33557版17二、PCR技术可以进行实时、定量分析QR335517目目 录录18三、三、PCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的结合的DNA序列序列7版18三、PCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的DNA序列7版18目目 录录19第三节第三节 DNA序列测定序列测定DNA Sequencing19第三节 DNA序列测定DNA Sequencin19目目 录录20*DNA序列分析方法的演变和发展序列分析方法的演变和发展20世纪世纪70年代年代双脱氧链终止法：双脱氧链终止法：F.Sanger化学裂解法：化学裂解法：A.Maxam和和W.Gilbert20世纪世纪80年代年代PCR及自动测序技术及自动测序技术20*DNA序列分析方法的演变和发展20世纪70年代20目目 录录21一、一、DNADNA序列分析有双脱氧链终止法和序列分析有双脱氧链终止法和化学裂解法化学裂解法（一）（一）Sanger双脱氧链终止法利用双脱氧链终止法利用2，3 -双脱氧核苷酸掺入中双脱氧核苷酸掺入中（二）（二）Maxam-Gilbert化学裂解法利用化学化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基试剂裂解修饰碱基止聚合反应止聚合反应 21一、DNA序列分析有双脱氧链终止法和化学裂解法（一）21目目 录录22双脱氧链终止法双脱氧链终止法7版22双脱氧链终止法7版22目目 录录237版GATC 测序反应测序反应 电泳电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5 3 正极正极负极负极ddGddAddTddC237版GATC 测序反应 电泳5 3 正极负极dd23目目 录录24DNA序列自动分析序列自动分析ddG红红ddTddA绿绿ddC蓝蓝橙橙毛细管电泳毛细管电泳荧光标记荧光标记DNA合成合成测序结果展示测序结果展示24DNA序列自动分析ddG红ddTddA绿ddC蓝橙毛细管24目目 录录25二、二、DNA序列分析可以揭示基因和序列分析可以揭示基因和基因组一级结构变化基因组一级结构变化通过通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组序列分析可以鉴定基因和基因组的变异的变异通过通过DNA序列测定分析人工重组的基因序列测定分析人工重组的基因通过通过DNA序列测定对定点突变进行确认序列测定对定点突变进行确认25二、DNA序列分析可以揭示基因和基因组一级结构变化通过25目目 录录26第四节第四节 DNA芯片技术芯片技术DNA Chip Technologies26第四节 DNA芯片技术DNA Chip Tech26目目 录录27什么是什么是DNA芯片技术芯片技术DNA芯片（芯片（DNA chip）在固相支持物上有序固化寡核苷酸或在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，探针，与待测荧光标记样品进行杂交；与待测荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息品的遗传信息(基因序列及表达基因序列及表达)；亦被称作亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。27什么是DNA芯片技术DNA芯片（DNA chip）27目目 录录28基因芯片工作流程基因芯片工作流程7版28基因芯片工作流程7版28目目 录录29一、利用一、利用DNA芯片技术可同时进行高通量芯片技术可同时进行高通量基因转录活性的分析基因转录活性的分析cDNA芯芯片片每每个个探探针针是是cDNA片片段段或或基基因因的的一一段段PCR产产物物，可可以以同同任任何何具具有有同同源源序序列列的的样样品品形形成成杂杂交交体体，同同时时定定量量监监测测大大量量基基因的表达。因的表达。寡寡核核苷苷酸酸芯芯片片利利用用基基因因特特异异的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段为为探探针针，每每个个基基因因有有1020个个相相对对应应的的探探针针，对对低低丰丰度度基基因因表表达达水水平平变变化化的的检检测测具具有高度灵敏性。有高度灵敏性。29一、利用DNA芯片技术可同时进行高通量基因转录活性的分析29目目 录录30二、染色质免疫共沉淀与芯片技术结合二、染色质免疫共沉淀与芯片技术结合检测蛋白质检测蛋白质-DNA相互作用相互作用染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀-芯片（芯片（chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip）特特异异性性地地富富集集目目的的蛋蛋白白结结合合的的DNA片片段段，解解交交联联后后对对目目的的片片段段进进行行纯纯化化、扩扩增增和和荧荧光光标标记记，再用于芯片分析；再用于芯片分析；寻寻找找特特异异性性蛋蛋白白在在基基因因组组中中的的结结合合位位点点，获获得得蛋白质与蛋白质与DNA相互作用的信息。相互作用的信息。（一）（一）ChIP-on-chip的基本原理是染色质免疫的基本原理是染色质免疫共沉淀与芯片技术相结合共沉淀与芯片技术相结合30二、染色质免疫共沉淀与芯片技术结合检测蛋白质-DNA相互30目目 录录31ChIP-on-chip工作原理工作原理甲醛处理使细胞内蛋白质和甲醛处理使细胞内蛋白质和DNA交联交联 超声波打碎超声波打碎 特异性抗体免疫沉淀特异性抗体免疫沉淀目的目的DNA片段纯化、扩增片段纯化、扩增荧光标记和芯片检测荧光标记和芯片检测芯片数据分析芯片数据分析31ChIP-on-chip工作原理甲醛处理使细胞内蛋白质和31目目 录录32（二）采用两步模型法进行（二）采用两步模型法进行ChIP-on-chip数据分析数据分析两步模型法（两步模型法（two-step paradigm），可以从利用），可以从利用ChIP-on-chip获得的大量复杂数据中，经过聚类、获得的大量复杂数据中，经过聚类、挖掘、分析，得到有效的数据及信息，特别是可挖掘、分析，得到有效的数据及信息，特别是可以获得大量的转录因子在基因组上结合位点的信以获得大量的转录因子在基因组上结合位点的信息。息。第一步在获得的数据中抽取转录因子结合位点处第一步在获得的数据中抽取转录因子结合位点处5001 000 bp左右的序列信息，然后在这些序列中左右的序列信息，然后在这些序列中进行模式比对，寻找可能的模体（进行模式比对，寻找可能的模体（motif），获得），获得粗略的目的数据集。粗略的目的数据集。第二步对其进行数据挖掘和分析。第二步对其进行数据挖掘和分析。32（二）采用两步模型法进行ChIP-on-chip数据分32目目 录录33（三）（三）ChIP-on-chip适于适于DNA-核蛋白相互核蛋白相互作用及表观遗传学研究作用及表观遗传学研究主要集中在两个领域：主要集中在两个领域：第第一一，确确定定转转录录因因子子及及其其作作用用位位点点：能能够够将将直直接接与与蛋蛋白白结结合合的的基基因因作作为为靶靶点点，数数据据可可以以直直接接用用于于生生物物信信息息学学分析，更直接地识别转录因子结合元件。分析，更直接地识别转录因子结合元件。第第二二，确确定定基基因因表表观观遗遗传传修修饰饰，应应用用于于表表观观遗遗传传学研究。学研究。表表观观遗遗传传学学的的主主要要研研究究内内容容包包括括甲甲基基化化，组组蛋蛋白白修修饰饰和染色质重塑等。和染色质重塑等。ChIP-on-chip技技术术可可提提供供基基因因编编码码区区中中组组蛋蛋白白甲甲基基化化分分布布模模式式的的信信息息：CpG岛岛表表达达序序列列标标签签芯芯片片，可可以以显显示示基因组内基因组内CpG甲基化和组蛋白修饰之间的联系甲基化和组蛋白修饰之间的联系33（三）ChIP-on-chip适于DNA-核蛋白相互作33目目 录录34三、芯片技术的发展三、芯片技术的发展蛋白质芯片和蛋白质芯片和组织芯片组织芯片蛋蛋白白质质芯芯片片技技术术是是研研究究蛋蛋白白质质组组学学的的有有力力工具工具 蛋白质检测芯片蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片蛋白质功能芯片 组组织织芯芯片片是是以以形形态态学学为为基基础础进进行行高高通通量量检检测基因表达信息的芯片技术测基因表达信息的芯片技术多组织片多组织片组织阵列组织阵列组织微阵列组织微阵列 34三、芯片技术的发展蛋白质芯片和组织芯片蛋白质芯片技术34目目 录录35第五节第五节 酵母及哺乳动物细胞杂交系统酵母及哺乳动物细胞杂交系统Yeast and Mammalian Hybrid Systems35第五节 酵母及哺乳动物细胞杂交系统Yeast an35目目 录录36一、酵母双杂交探测蛋白一、酵母双杂交探测蛋白-蛋白的相互作用蛋白的相互作用酵母双杂交系统（酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）由）由S.Fields 和和O.Song 于于1989年提年提出并初步建立出并初步建立36一、酵母双杂交探测蛋白-蛋白的相互作用酵母双杂交系统（y36目目 录录37酵母双杂交技术的基本原理酵母双杂交技术的基本原理37酵母双杂交技术的基本原理37目目 录录38（一一）酵酵母母双双杂杂交交系系统统利利用用报报告告基基因因的的表表达达探探测测蛋白蛋白-蛋白的相互作用蛋白的相互作用（二二）酵酵母母双双杂杂交交可可通通过过蛋蛋白白质质相相互互作作用用鉴鉴定定/分分离新的相互作用蛋白及其编码基因离新的相互作用蛋白及其编码基因（三三）哺哺乳乳动动物物双双杂杂交交系系统统是是在在酵酵母母双双杂杂交交系系统统基础上发展的基础上发展的38（一）酵母双杂交系统利用报告基因的表达探测蛋白-蛋白的相38目目 录录39二、酵母单杂交系统需要构建二、酵母单杂交系统需要构建“报告报告”细胞细胞酵酵母母单单杂杂交交技技术术（yeast one-hybrid）由由J.Li于于1993年从酵母双杂交技术发展而来年从酵母双杂交技术发展而来是是体体外外分分析析DNA与与细细胞胞内内蛋蛋白白质质相相互互作作用用的的一一种方法；种方法；通通过过对对酵酵母母细细胞胞内内报报告告基基因因表表达达状状况况的的分分析析，鉴别鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因。结合位点并发现潜在的结合蛋白基因。39二、酵母单杂交系统需要构建“报告”细胞酵母单杂交技术（y39目目 录录40酵母单杂交技术的基本原理酵母单杂交技术的基本原理40酵母单杂交技术的基本原理40目目 录录41三、蛋白质三、蛋白质-RNA相互作用也可采用酵母相互作用也可采用酵母三杂交系统进行分析三杂交系统进行分析酵酵 母母 三三 杂杂 交交 系系 统统（yeast three-hybrid system）于于1996年年由由D.J.SenGupta等等首首先先报报道道（一一）用用于于蛋蛋白白质质-RNA相相互互作作用用分分析析的的酵酵母母三杂交系统需要杂合三杂交系统需要杂合RNA 41三、蛋白质-RNA相互作用也可采用酵母三杂交系统进行分析41目目 录录42酵母三杂交基本原理酵母三杂交基本原理 42酵母三杂交基本原理 42目目 录录43（二）酵母三杂交系统应用范围广泛（二）酵母三杂交系统应用范围广泛可进行与特定蛋白结合的未知可进行与特定蛋白结合的未知RNA的筛选；的筛选；确定确定RNA-蛋白质相互作用的结构域；蛋白质相互作用的结构域；鉴鉴定定、分分离离能能够够识识别别具具有有重重要要生生理理功功能能RNA的的RNA结合蛋白。结合蛋白。43（二）酵母三杂交系统应用范围广泛可进行与特定蛋白结合的未43