ppt课件06重组DNA技术

基因工程基因工程-重组重组DNA技术技术2010-04-19基因工程基因工程-概概念念概概念念基因基因基因基因v基因是基因是DNADNA序列上的一个特定功能的片段，不同基序列上的一个特定功能的片段，不同基因的遗传信息有各自片段的碱基排列顺序所决定。因的遗传信息有各自片段的碱基排列顺序所决定。v基因通过转录出的信息是核糖核酸指导基因通过转录出的信息是核糖核酸指导mRNAmRNA合成合成特定的蛋白质，使基因的以表达，完成特定的生特定的蛋白质，使基因的以表达，完成特定的生命活动。命活动。基因基因分子克隆分子克隆 (基因克隆基因克隆)细胞克隆细胞克隆动物克隆动物克隆克隆（克隆（cloneclone）：来自同一始祖的相同副本或拷贝：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化（克隆化（cloningcloning）,即无即无性繁殖。性繁殖。分子克隆分子克隆(基因克隆基因克隆)细胞克隆动物克隆克隆（细胞克隆动物克隆克隆（clone）：来）：来重组重组DNA的定义的定义应用应用酶学酶学的方法，在体外将各种来源的的方法，在体外将各种来源的DNA与载体与载体DNA结合成具有自我复制能结合成具有自我复制能力的力的DNA分子，继而通过转化或转染宿分子，继而通过转化或转染宿主细胞主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。分子。又称又称基因克隆基因克隆或或重组重组DNA。重组重组DNA的定义的定义重组重组DNA技术技术1分离或合成目的基因2带有目的基因的DNA片段与载体DNA体外重组 重组DNA。3将重组体DNA分子导入宿主（受体）细胞。4重组体克隆的筛选和鉴定、扩增与表达。重组重组DNA技术技术1分离或合成目的基因分离或合成目的基因DNADNA克隆的基本过程1.分分：分离目的基因分离目的基因2.切切：对目的基因和载体适当切割对目的基因和载体适当切割3.接接：目的基因与载体连接目的基因与载体连接4.转转：重组重组DNA转入受体菌转入受体菌5.筛筛：筛选出含有重组体的受菌体筛选出含有重组体的受菌体DNA克隆的基本过程分：分离目的基因克隆的基本过程分：分离目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因基因载体基因载体基因载体基因载体重组体重组体重组体重组体分分切切接接转转筛筛表表总总体体技技术术路路线线目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线ppt课件课件06重组重组DNA技术技术目的基因目的基因 研究某个基因，或者要克隆某个基因用研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量于生产大量DNADNA和蛋白质分子和蛋白质分子,首先都要把它首先都要把它从庞大的基因组中分离出来。从庞大的基因组中分离出来。你所感兴趣和想研究的基因，称为你所感兴趣和想研究的基因，称为目的目的基因基因。分分目的基因目的基因研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量目的基因目的基因需要克隆的需要克隆的DNADNA片段片段。编码某种蛋白质编码某种蛋白质研究某基因结构研究某基因结构和功能的关系和功能的关系研究某基因与研究某基因与疾病的关系疾病的关系目的基因需要克隆的目的基因需要克隆的DNA片段。编码某种蛋白质研究某基因结构和片段。编码某种蛋白质研究某基因结构和目的基因的获取目的基因的获取化学合成法化学合成法 cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库文库聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCRPCR）目的基因的获取化学合成法目的基因的获取化学合成法cDNA文库聚合酶链式反应文库聚合酶链式反应化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNADNA序列序列序列序列化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶基因组基因组DNA基因重组基因重组基因重组基因重组转化细菌转化细菌转化细菌转化细菌体外包装体外包装体外包装体外包装基因组基因组DNADNA文库文库基因组基因组基因组基因组DNADNA文库文库文库文库存在于转化细胞内由存在于转化细胞内由存在于转化细胞内由存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有克隆载体所携带的所有克隆载体所携带的所有克隆载体所携带的所有基因组基因组基因组基因组DNADNA的集合的集合的集合的集合限制性内切酶基因组限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装基因组基因重组转化细菌体外包装基因组DNAcDNAcDNA文库的组建文库的组建：基因重组基因重组基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAcDNA经反转录合成的、经反转录合成的、与与RNA互补的互补的单链单链DNAcDNA文库的组建：基因重组反转录酶文库的组建：基因重组反转录酶mRNAcDNA 经反转录经反转录目的基因目的基因cDNA：complementaryDNA经反转录合成的、与经反转录合成的、与RNA互补的单链互补的单链DNA。基因组基因组DNA：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。序列。目的基因目的基因PCR可以把可以把指定的基因片段指定的基因片段数数量放大量放大染色体染色体PCR基因放大基因放大连琐连琐反反应应聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR(polymerase chain reaction,PCR(polymerase chain reaction,PCR(polymerase chain reaction,PCR)PCR可以把可以把指定的基因片段指定的基因片段数量放大染色体数量放大染色体PCR基因放基因放PCR法法,多聚酶链式反应多聚酶链式反应Polymerasechainreaction,PCR1985年，年，Mullis等人建立等人建立体外扩增体外扩增DNA片断片断把目的基因的寻找和把目的基因的寻找和扩增，放在一个步骤里扩增，放在一个步骤里完成完成PCR法法,多聚酶链式反应多聚酶链式反应PolymerasechaiPCR的条件的条件-5要素要素模板模板引物引物dNTPDNA聚合酶聚合酶Mg2+模板：双链模板：双链DNA DNA；原材料：核原材料：核苷酸；苷酸；辅助条件：辅助条件：解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶，聚合酶，DNA DNA 连接酶；连接酶；RNARNA引物引物PCR的条件的条件-5要素模板模板：双链要素模板模板：双链DNA；PCR PCR 的的三三个个步步骤骤为为一一次次循循环环，约约需需5 510 10 分分钟钟。每每经经一一次次循循环环，所所找找到到的的目目的的基基因因扩扩充充一一倍倍。经经过过 30 30 次次循循环环，即可扩增即可扩增 10109 9 倍，总共只需几个小时。倍，总共只需几个小时。PCR的三个步骤为一次循环，约需的三个步骤为一次循环，约需510PCRPCR的基本反应步骤的基本反应步骤1.1.变性变性：将反应系统加热至：将反应系统加热至95 95，使模板，使模板DNADNA完全变性成为单链；完全变性成为单链；2.2.退火退火：将温度下降至：将温度下降至5050左右，使引物与模左右，使引物与模板板DNADNA退火结合；退火结合；3.3.延伸延伸：将温度升至：将温度升至72 72，DNADNA聚合酶以聚合酶以dNTPdNTP为底物催化为底物催化DNADNA的合成反应。的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经上述三个步骤为一个循环，经25253030次循次循 环后，可将模板环后，可将模板DNADNA扩增达百万倍。扩增达百万倍。PCR的基本反应步骤的基本反应步骤1.变性：将反应系统加热至变性：将反应系统加热至95，使，使PCR PCR 的的三三个个步步骤骤为为一一次次循循环环，约约需需5 510 10 分分钟钟。每每经经一一次次循循环环，所所找找到到的的目目的的基基因因扩扩充充一一倍倍。经经过过 30 30 次次循循环环，即可扩增即可扩增 10109 9 倍，总共只需几个小时。倍，总共只需几个小时。PCR的三个步骤为一次循环，约需的三个步骤为一次循环，约需510P C RP C R操作流程操作流程9090 0 0 C C变性变性50 50 0 0 C C退火退火70 70 0 0 C C延伸延伸PCR操作流程操作流程900C500C700C基因载体（基因载体（vector）能携带目的基因，实现无性繁殖所采用的可独立复制的完能携带目的基因，实现无性繁殖所采用的可独立复制的完整整DNADNA分子。又称分子。又称克隆载体克隆载体。其中为表达出蛋白质设计的。其中为表达出蛋白质设计的载体又称载体又称表达载体表达载体。常用的载体常用的载体：质粒（质粒（plasmidplasmid）、噬菌体）、噬菌体DNADNA（phagephage）、病毒）、病毒DNADNA（virusvirus），），这些些载体均需体均需经人工构建，除去致病基因，并人工构建，除去致病基因，并赋予一些新予一些新的功能，如有利于的功能，如有利于进行行筛选的的标志基因、志基因、单一的限制一的限制酶切切点等。点等。基因载体（基因载体（vector）能携带目的基因，实现无性繁殖所采用的）能携带目的基因，实现无性繁殖所采用的载载 体体(vector)(vector)供插入目的基因并将其导入宿主细胞内供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具表达或复制的运载工具l载体具备条件载体具备条件l1 1.自主稳定复制自主稳定复制l2.2.多克隆位点多克隆位点l3.3.遗传标记遗传标记l4.4.插入容量大插入容量大l5.5.分子量小，拷贝多分子量小，拷贝多l6.6.安全安全l载体的分类载体的分类l按来源：质粒、噬菌体、按来源：质粒、噬菌体、病毒病毒l按产物：克隆载体、表按产物：克隆载体、表达载体达载体l按宿主细胞：原核细胞按宿主细胞：原核细胞载体、真核细胞载体载体、真核细胞载体载载体体(vector)供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达质粒（质粒（plasmid）存在于细菌染色体外的小型环状存在于细菌染色体外的小型环状存在于细菌染色体外的小型环状存在于细菌染色体外的小型环状DNADNA分子。分子。分子。分子。具有具有具有具有自我复制自我复制自我复制自我复制功能。功能。功能。功能。带有抗性基因及表型识别带有抗性基因及表型识别带有抗性基因及表型识别带有抗性基因及表型识别等等等等遗传性标记物遗传性标记物遗传性标记物遗传性标记物。经改造后具有经改造后具有经改造后具有经改造后具有多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点。质粒（质粒（plasmid）存在于细菌染色体外的小型环状存在于细菌染色体外的小型环状DNA分分举例：举例：pBR322质粒质粒最早使用的最早使用的质粒粒DNA是人工构建的是人工构建的pBR322，该质粒分子大小粒分子大小为4.3kb，带有有抗四抗四环素和抗氨素和抗氨苄青霉素基因，含青霉素基因，含EcoR，BamH，Hind等等单一的限制一的限制酶切点。切点。举例：举例：pBR322质粒质粒最早使用的质粒最早使用的质粒DNA是人工构建的是人工构建的pB抗抗抗抗AmpAmp宿主细菌宿主细菌含含Amp培养基培养基抗抗Amp宿主细菌含宿主细菌含Amp培养基培养基多种酶切口多种酶切口多克隆位点多克隆位点限制性内切酶限制性内切酶单一酶切口单一酶切口多种酶切口多克隆位点限制性内切酶单一酶切口多种酶切口多克隆位点限制性内切酶单一酶切口多克隆位点多克隆位点ori复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记AmpAmppolylinker基因载体基因载体多克隆位点多克隆位点ori复制起始点遗传标记复制起始点遗传标记Amppolylinker3病毒：病毒：常用的常用的为SV40，通，通过感染方感染方式将其式将其DNA送入哺乳送入哺乳动物物细胞中胞中进行增行增殖。目前殖。目前应用相用相对较少。少。3病毒：病毒：常用的为常用的为SV40，通过感染方式将其，通过感染方式将其DNA送入哺乳送入哺乳限制性内切限制性内切酶酶切酶酶切切切酶切酶切限制性内切酶酶切切酶切限制性内切酶酶切切酶切工具酶工具酶工具酶工具酶功功能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基形成二酯键羟基形成二酯键DNA聚合酶聚合酶Ia.合成合成cDNA的第二条链的第二条链b.缺口平移缺口平移c.测序测序d.补平补平反转录酶反转录酶合成合成cDNA多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化羟基末端磷酸化末端转移酶末端转移酶同聚物加尾同聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基工具酶工具酶工具酶工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶主主要要来来源源于于原原核核生生物物，具具有有识识别别自自身身DNA或或异异源源DNA的的功功能能，通通过过切切割割破破坏坏或或限限制制异异源源DNA分子侵入宿主细胞来保护自身。分子侵入宿主细胞来保护自身。限限制制酶酶目目前前已已经经发发现现400400多多种种，所所识识别别的的顺顺序序往往往往具具有有双双链链对对称称的的回回文文结结构构4-84-8个个碱碱基基对对，称为限制性位点或切点称为限制性位点或切点识别特性：识别特性：具有双链对称的回文结构具有双链对称的回文结构5GAATTC-33CTTAAG-5 限制性核酸内切酶主要来源于原核生物，具有识别自身限制性核酸内切酶主要来源于原核生物，具有识别自身DNA或异源或异源ppt课件课件06重组重组DNA技术技术ppt课件课件06重组重组DNA技术技术ppt课件课件06重组重组DNA技术技术ppt课件课件06重组重组DNA技术技术即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的得到重新组合后的DNADNA分子分子DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接接接即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后（一）粘性末端（一）粘性末端连接法：接法：当当载体体DNADNA和目的基因均用同一种限和目的基因均用同一种限制制酶进行切断行切断时，二者即可，二者即可带有相同的粘有相同的粘性末端。如将性末端。如将载体与目的基因混合在一起，体与目的基因混合在一起，二者即可通二者即可通过粘性末端粘性末端进行互行互补粘合，再粘合，再加入加入DNADNA连接接酶，即可封，即可封闭其缺口，得到重其缺口，得到重组体。体。较少的情况下，少的情况下，对产生的平端也可生的平端也可直接直接进行行连接。接。连接方式连接方式（一）粘性末端连接法：连接方式（一）粘性末端连接法：连接方式ppt课件课件06重组重组DNA技术技术（二）人工接尾法：（二）人工接尾法：即同聚物加尾即同聚物加尾连接法。接法。当当载体和目的基因无法采用同一种限制体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同的粘性末端行切断，无法得到相同的粘性末端时，可采，可采用此方法。用此方法。此法首先使用此法首先使用单链核酸核酸酶将粘性末端切平，将粘性末端切平，再在末端核苷酸再在末端核苷酸转移移酶的催化下，将脱氧核糖的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于核苷酸添加于载体或目的基因的体或目的基因的3-3-端，如端，如载体上添加一段体上添加一段polyApolyA，则可在目的基因上添加可在目的基因上添加一段一段polyTpolyT，故二者即可通，故二者即可通过碱基互碱基互补进行粘行粘合，再由合，再由DNADNA连接接酶连接。接。（二）人工接尾法：（二）人工接尾法：即同聚物加尾连接法。即同聚物加尾连接法。ppt课件课件06重组重组DNA技术技术（三）人工接（三）人工接头连接法：接法：将人工将人工连接器（即一段含有多种限接器（即一段含有多种限制制酶切点的切点的DNADNA片段）片段）连接到接到载体和目的体和目的基因上，即有可能使用同一种限制基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因体和目的基因进行切断，得到可以互行切断，得到可以互补的粘性末端。的粘性末端。（三）人工接头连接法：（三）人工接头连接法：ppt课件课件06重组重组DNA技术技术重组体的转化重组体的转化（transformationtransformation）受体细胞受体细胞转转重组重组DNA需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。由外来由外来DNA引起生物体遗引起生物体遗传性状改变的过程称为传性状改变的过程称为转转化化(transformation)。将质粒将质粒DNADNA或以其为载体构或以其为载体构建的重组子导入细菌的过建的重组子导入细菌的过程。程。重组体的转化（重组体的转化（transformation）受体细胞转）受体细胞转*转染转染(transfection)(transfection)l转染是染是转化的一种特殊形式。化的一种特殊形式。由由transformationtransformation（转化）和化）和 infectioninfection（感染）两（感染）两词构成。构成。l原指将噬菌体、病毒或以其原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重体构建的重组子子导入受体入受体细胞的胞的过程。程。l通通过感染方式感染方式将外来将外来DNADNA引入宿主引入宿主细胞，并胞，并导致宿致宿主主细胞胞遗传性状改性状改变的的过程称程称为转染染。l将任何将任何类型型DNADNA转移至移至动物物细胞内的胞内的过程均可叫程均可叫转染。染。*转染转染(transfection)转染是转化的一种特殊形式。转染是转化的一种特殊形式。JM109感受态感受态AmAm含氨苄平板含氨苄平板重组重组质粒质粒感受态感受态JM109感受态感受态Am含氨苄平板重组质粒感受态含氨苄平板重组质粒感受态转转重组体的转化重组体的转化1.重组体导入大肠杆菌重组体导入大肠杆菌（1）氯化钙法）氯化钙法（2）电击法）电击法（3）体外包装法）体外包装法2.重组体导入哺乳动物细胞重组体导入哺乳动物细胞（1）磷酸钙共沉淀法）磷酸钙共沉淀法（2）脂质体介导法）脂质体介导法（3）病毒感染法）病毒感染法（4）显微注射法）显微注射法转转重组体的转化重组体的转化1.重组体导入大肠杆菌重组体导入大肠杆菌原核细胞的转化（细菌转化）原核细胞的转化（细菌转化）1)1)受体细胞的选择受体细胞的选择限制缺陷型限制缺陷型限制缺陷型限制缺陷型:避免修饰和降解避免修饰和降解避免修饰和降解避免修饰和降解重组缺陷型：重组缺陷型：重组缺陷型：重组缺陷型：避免重组整合避免重组整合避免重组整合避免重组整合转化亲和型：转化亲和型：转化亲和型：转化亲和型：较高的可转化性较高的可转化性较高的可转化性较高的可转化性遗传互补型：遗传互补型：遗传互补型：遗传互补型：利于筛选利于筛选利于筛选利于筛选感染缺陷型：感染缺陷型：感染缺陷型：感染缺陷型：防止感染防止感染防止感染防止感染原核细胞的转化（细菌转化）原核细胞的转化（细菌转化）1)受体细胞的选择限制缺陷型受体细胞的选择限制缺陷型:2 2）转化方法）转化方法CaClCaCl2 2诱导转化诱导转化电穿孔电穿孔PEGPEG介导转化介导转化人工体外包装人工体外包装特殊处理特殊处理受体细胞受体细胞细胞膜特性细胞膜特性改变改变2）转化方法）转化方法CaCl2诱导转化特殊处理受体细胞细胞膜特性改变诱导转化特殊处理受体细胞细胞膜特性改变CaClCaCl2 2处理处理受体细菌受体细菌50-100mmol/LCaCl2感受态感受态细菌细菌重组体转重组体转入细菌入细菌CaCl2处理受体细菌处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2噬菌体噬菌体基因重组基因重组转染转染转染转染体外包装体外包装噬菌体体外包装噬菌体体外包装用用噬菌体作为载体的噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌为具有感染能力的噬菌体，再通过体，再通过转染转染(transfection)方式将重组方式将重组噬菌体噬菌体DNA导入大肠杆导入大肠杆菌等宿主细胞。菌等宿主细胞。重组重组DNA导入宿主细导入宿主细胞后，即可在适当的培胞后，即可在适当的培养条件下进行培养以扩养条件下进行培养以扩增宿主细胞。增宿主细胞。噬菌体基因重组转染体外包装噬菌体体外包装噬菌体基因重组转染体外包装噬菌体体外包装用用噬菌体作为噬菌体作为 3 3）转化率）转化率：转化细胞转化细胞/细胞总数细胞总数 影响因素：影响因素：影响因素：影响因素：载体：载体性质、空间结构、分子大小等载体：载体性质、空间结构、分子大小等载体：载体性质、空间结构、分子大小等载体：载体性质、空间结构、分子大小等 受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞 转化过程转化过程转化过程转化过程重组体克隆的筛选与鉴定重组体克隆的筛选与鉴定筛筛含氨苄平板含氨苄平板含氨苄平板含氨苄平板连接连接目的基因目的基因目的基因目的基因基因载体基因载体基因载体基因载体连接酶连接酶连接酶连接酶转化转化宿主细胞宿主细胞宿主细胞宿主细胞由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。重组体克隆的筛选与鉴定筛含氨苄平板连接目的基因转化宿主细胞重组体克隆的筛选与鉴定筛含氨苄平板连接目的基因转化宿主细胞转化后的克隆群体：转化后的克隆群体：转化后的克隆群体：转化后的克隆群体：（一）根据重组体的表型进行筛选（一）根据重组体的表型进行筛选：对于于带有抗有抗药基因的基因的质粒重粒重组体，可采用体，可采用插插入入灭活法活法进行行筛选。如。如pBR322pBR322中中带有抗氨有抗氨苄青青霉素和抗四霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起素基因后，就可引起该基因失活，基因失活，细菌菌对氨氨苄青霉素耐青霉素耐药，而，而对四四环素敏感。在含氨素敏感。在含氨苄青青霉素的培养基上能霉素的培养基上能够生生长，而在含四，而在含四环素的培素的培养基上不能生养基上不能生长的的细菌即菌即为带重重组体的体的细菌。菌。（一）根据重组体的表型进行筛选：（一）根据重组体的表型进行筛选：对于带有抗药基因的质粒重对于带有抗药基因的质粒重1 1）抗药性标志的选择）抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段插入片段插入片段插入片段AmpAmp平板平板平板平板TetTet平板平板平板平板1）抗药性标志的选择）抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段插入片段Amp平平（二）根据标志互补进行筛选（二）根据标志互补进行筛选 当宿主细胞存在某种基因及其表达产当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体即在载体DNADNA分子中插入相应的缺陷基因，分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。物，则说明该细胞中带有重组体。（二）根据标志互补进行筛选（二）根据标志互补进行筛选当宿主细胞存在某种基因及其表当宿主细胞存在某种基因及其表X-galLac Z蓝色化合物蓝色化合物X-gal2 2）标志补救（）标志补救（-半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）X-galLacZ蓝色化合物蓝色化合物X-gal2）标志补救（）标志补救（-半半（LacZLacZ基因基因基因基因 N N端序列）端序列）端序列）端序列）插入片段插入片段插入片段插入片段（LacZLacZ基因失活）基因失活）基因失活）基因失活）LacZLacZ基基基基因因因因 N N端序端序端序端序列列列列LacZLacZ酶酶酶酶（LacZ基因基因N端序列）插入片段（端序列）插入片段（LacZ基因失活）基因失活）Lac（三）根据（三）根据DNA限制酶谱进行分析限制酶谱进行分析 经过粗粗筛后的含重后的含重组体的体的细菌，菌，还需需进行限制行限制酶谱分析分析进一步一步鉴定。将定。将单一一细菌菌进行行扩增后分增后分别提取其提取其DNADNA，用重，用重组时所用的同一限制所用的同一限制酶进行行酶切，再将其切，再将其与不含目的基因的与不含目的基因的载体一起体一起进行行电泳比泳比较分析，如分析，如发现出出现目的基因片段的目的基因片段的电泳泳带即即证明重明重组体中体中带有目的基因。有目的基因。（三）根据（三）根据DNA限制酶谱进行分析限制酶谱进行分析经过粗筛后的含重组体的细经过粗筛后的含重组体的细电泳检测法电泳检测法凝胶电泳检测凝胶电泳检测加加样样孔孔DNAMarkerDNAMarker空质粒空质粒空质粒空质粒重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒 重组质粒酶切重组质粒酶切重组质粒酶切重组质粒酶切重组质粒的重组质粒的重组质粒的重组质粒的PCRPCR扩增片段扩增片段扩增片段扩增片段电泳检测法凝胶电泳检测加样孔电泳检测法凝胶电泳检测加样孔DNAMarker空质粒重组质空质粒重组质ppt课件课件06重组重组DNA技术技术（四）用核酸杂交法进行分析鉴定（四）用核酸杂交法进行分析鉴定：（四）用核酸杂交法进行分析鉴定：（四）用核酸杂交法进行分析鉴定：原位杂交原位杂交菌落杂交筛选法菌落杂交筛选法原位杂交菌落杂交筛选法原位杂交菌落杂交筛选法原原位位杂杂交交原原位位杂杂交交ppt课件课件06重组重组DNA技术技术外源基因在宿主细胞中的表达重组子重组子目的基因目的基因的的mRNA表达蛋白质表达蛋白质大肠杆菌（大肠杆菌（E.coliE.coli）受体细胞受体细胞表表外源基因在宿主细胞中的表达重组子目的基因的外源基因在宿主细胞中的表达重组子目的基因的mRNA表达蛋白质表达蛋白质基因载体基因载体目的基因目的基因 质粒质粒质粒质粒 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体 病毒病毒病毒病毒 PCR cDNA PCR cDNA PCR cDNA PCR cDNA 人工合成人工合成人工合成人工合成 基因文库基因文库基因文库基因文库限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶有切口的载体有切口的载体有切口的目的基因有切口的目的基因DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶 重组体重组体 转化转化转化转化 转染转染转染转染 体外包装体外包装体外包装体外包装带重组体的宿主细胞带重组体的宿主细胞 表型筛选表型筛选表型筛选表型筛选 电泳法电泳法电泳法电泳法 核酸杂交核酸杂交核酸杂交核酸杂交 免疫学方法免疫学方法免疫学方法免疫学方法目的基因的表达目的基因的表达基因载体目的基因基因载体目的基因质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒PCR实验仪器实验仪器实验仪器超净工作台超净工作台超净工作台超净工作台离心设备离心设备台式高速冷冻离心机台式高速冷冻离心机离心设备离心设备恒温空气摇床恒温空气摇床恒温空气摇床恒温空气摇床恒温培养箱恒温培养箱培养皿培养皿恒温培养箱培养皿恒温培养箱培养皿恒温水浴锅恒温水浴锅恒温水浴锅恒温水浴锅ppt课件课件06重组重组DNA技术技术材料及试剂E.coli DH5E.coli DH5pUC19质粒质粒DNAEcoRI酶酶3mol/LKac(pH5.2)Xgal(20mg/ml)IPTG(200mg/ml)材料及试剂材料及试剂E.coliDH53mol/LKac(材料及试剂1.T4DNA连接酶连接酶210T4DNA连接酶缓冲液连接酶缓冲液:400mmol/LTris-ClpH7.5100mmol/LMgCl2100mmol/LDTT,500g/mlBSA5-10mmol/LATP材料及试剂材料及试剂1.T4DNA连接酶连接酶试剂3限制性内切酶（限制性内切酶（PstI）410限制性内切酶缓冲液限制性内切酶缓冲液500mmol/LTris-Cl100mmol/LMgCl21000mmol/LNaCl 1mg/L BSA 1mg/L BSA5.5.灭菌去离子水灭菌去离子水试剂试剂3限制性内切酶（限制性内切酶（PstI）实验步骤1混合以下溶液于一个无菌离心管中混合以下溶液于一个无菌离心管中xlpUC19质粒质粒(0.1-4g)2l10酶切缓冲液酶切缓冲液15U限制性内切酶（限制性内切酶（EcoRI）yl去离子水去离子水终体积为终体积为20l2在推荐温度下育温在推荐温度下育温1小时（一般为小时（一般为37）加入加入5l5l电泳缓冲液终止反应，电泳检测结果。电泳缓冲液终止反应，电泳检测结果。酶切酶切实验步骤实验步骤1混合以下溶液于一个无菌离心管中酶切混合以下溶液于一个无菌离心管中酶切实验步骤1混合以下试剂混合以下试剂DNA7.7lpUC19DNA1.0l10T4DNA连接酶缓冲液连接酶缓冲液1.0lT4DNA连接酶连接酶(10u/l)0.3l混合液于混合液于1414培养培养1212小时小时连接连接实验步骤实验步骤1混合以下试剂连接混合以下试剂连接实验结果实验结果实验结果