酶抑制法和免疫测定技术课件

第六章第六章 酶抑制法和酶抑制法和免疫测定技术免疫测定技术学习指南学习指南观察思考观察思考课外阅读课外阅读复习自测复习自测退出本章退出本章演示文稿演示文稿本章目录本章目录辽农职院辽农职院 工程系工程系 质检中心质检中心20242024年年5 5月月1818日日1感谢您的观看2019年6月16第六章 酶抑制法和免疫测定技术学习指南观察思考课外阅读复习n n目的要求：生物测定技术以其简单、快速、特异性强、目的要求：生物测定技术以其简单、快速、特异性强、目的要求：生物测定技术以其简单、快速、特异性强、目的要求：生物测定技术以其简单、快速、特异性强、样品量少而得到迅速发展，应用酶抑制技术、酶联免样品量少而得到迅速发展，应用酶抑制技术、酶联免样品量少而得到迅速发展，应用酶抑制技术、酶联免样品量少而得到迅速发展，应用酶抑制技术、酶联免疫技术、生物技术等快速测定农药残留，已成为一定疫技术、生物技术等快速测定农药残留，已成为一定疫技术、生物技术等快速测定农药残留，已成为一定疫技术、生物技术等快速测定农药残留，已成为一定的市场需求，但此类方法仍只能达到定性和半定量的的市场需求，但此类方法仍只能达到定性和半定量的的市场需求，但此类方法仍只能达到定性和半定量的的市场需求，但此类方法仍只能达到定性和半定量的水平。水平。水平。水平。通过本章的学习，目的是使学生掌握酶制技术、酶联通过本章的学习，目的是使学生掌握酶制技术、酶联通过本章的学习，目的是使学生掌握酶制技术、酶联通过本章的学习，目的是使学生掌握酶制技术、酶联免疫技术等常用的快速测定农药残留的方法，了解与免疫技术等常用的快速测定农药残留的方法，了解与免疫技术等常用的快速测定农药残留的方法，了解与免疫技术等常用的快速测定农药残留的方法，了解与免疫法相关的一些知识。免疫法相关的一些知识。免疫法相关的一些知识。免疫法相关的一些知识。n n学习要点学习要点学习要点学习要点 1 1、一般了解：农药残留生物检测技术的问题和展望。、一般了解：农药残留生物检测技术的问题和展望。、一般了解：农药残留生物检测技术的问题和展望。、一般了解：农药残留生物检测技术的问题和展望。2 2、一般掌握：生物传感器在农药残留检测中的应用。、一般掌握：生物传感器在农药残留检测中的应用。、一般掌握：生物传感器在农药残留检测中的应用。、一般掌握：生物传感器在农药残留检测中的应用。3 3、重点掌握：酶抑制技术；酶联免疫技术；生物技术、重点掌握：酶抑制技术；酶联免疫技术；生物技术、重点掌握：酶抑制技术；酶联免疫技术；生物技术、重点掌握：酶抑制技术；酶联免疫技术；生物技术等快速测定农药残留方法等。等快速测定农药残留方法等。等快速测定农药残留方法等。等快速测定农药残留方法等。2感谢您的观看2019年6月16目的要求：生物测定技术以其简单、快速、特异性强、样品量少而得第六章第六章 酶抑制法和免疫测定技术酶抑制法和免疫测定技术本节首页本节首页退出本章退出本章一、酶抑制分析测定法一、酶抑制分析测定法1 1、酶法概述、酶法概述2 2、酶法检验原理、酶法检验原理3 3、酶原、酶原4 4、底物与显色剂、底物与显色剂5 5、测定方法、测定方法二、免疫检测技术二、免疫检测技术1 1、免疫反应、免疫反应2 2、免疫分析、免疫分析3 3、酶联免疫吸附测定、酶联免疫吸附测定法法4 4、农药抗体制备、农药抗体制备5 5、ELISAELISA法的特点法的特点3感谢您的观看2019年6月16第六章 酶抑制法和免疫测定技术本节首页退出本章一、酶抑制分析本节首页本节首页退出本章退出本章一、酶抑制分析测定法一、酶抑制分析测定法1 1、酶法概述、酶法概述4感谢您的观看2019年6月16本节首页退出本章一、酶抑制分析测定法1、酶法概述4感谢您的观本节首页本节首页退出本章退出本章真性胆碱酯酶与胆碱能神经的生理功能极为密切。其生理功能是，当神经冲动到达胆碱能神经末梢时，突触小泡内的Ach外排至突触间隙，作用于突触后膜的胆碱能受体，引起下一级神经元或效应器的激发。在正常生理条件下，Ach完成传递冲动作用后，随即被突触后膜上的AchE在数毫秒内水解，生成乙酸和胆碱。2 2、酶法检验原理、酶法检验原理5感谢您的观看2019年6月16本节首页退出本章真性胆碱酯酶与胆碱能神经的生理功能极为密切。本节首页本节首页退出本章退出本章神经性毒剂分子中含有亲电子的正磷原子(P+)，它与Ach分子中的正碳原子(C+)同样具有亲电子性质。但神经性毒剂的亲电子能力此Ach强，这是因为毒剂分子中，PO和P-F键上的O、F原子相对电负性比P原子大得多(相对电负性P2.1，O3.5，F4.0，C&S2.5)。因此，相对电负性大的O、F原子吸收电子成为负极，使P成为低电子密度的正极，即P原子带有较多的正电荷和更强的亲电子能力。所以神经性毒剂对AchE有更大的亲和力和抑制力。(1)(1)神经性毒剂对神经性毒剂对AchEAchE的抑制机理的抑制机理6感谢您的观看2019年6月16本节首页退出本章神经性毒剂分子中含有亲电子的正磷原子(P+本节首页本节首页退出本章退出本章胆碱酯酶根据其水解基质的专一性和速度不同分真性胆碱酯酶和假性胆碱酯酶，前者又称乙酰胆碱酯酶(AchE)，后者包括丁酰胆碱酯酶(BuchE)和丙酰胆碱酯酶(PrchE)。假阳性：水果、蔬菜的提取物中含有对有抑制作用的杂质，如氯代烟碱类物质。(2)(2)对胆碱酯酶的抑制作用对胆碱酯酶的抑制作用 假阳性假阳性7感谢您的观看2019年6月16本节首页退出本章胆碱酯酶根据其水解基质的专一性和速度不同分真本节首页本节首页退出本章退出本章敌敌畏 乙酰胆碱乙酰胆碱AchE 产生假阳性的作用机理产生假阳性的作用机理8感谢您的观看2019年6月16本节首页退出本章敌敌畏 乙酰胆碱AchE 产生假阳性的作用3、酶、酶 原原本节首页本节首页退出本章退出本章蜜蜂头的脑酯酶液蜜蜂头的脑酯酶液条件：条件：3日龄，日龄，-200.24g/ml磷酸缓冲液磷酸缓冲液（pH7.5）保质期：保质期：3个月个月9感谢您的观看2019年6月163、酶 原本节首页退出本章蜜蜂头的脑酯酶液9感谢您的观看24、底物与显色剂、底物与显色剂本节首页本节首页退出本章退出本章乙酰胆碱乙酰胆碱+H2O胆碱胆碱+乙酸乙酸pH为为6.2（黄）（黄）7.6（蓝色）（蓝色）（1）乙酰胆碱）乙酰胆碱-溴百里酚蓝溴百里酚蓝10感谢您的观看2019年6月164、底物与显色剂本节首页退出本章乙酰胆碱+H2O胆碱+乙酸本节首页本节首页退出本章退出本章乙酸乙酸-萘酯固蓝萘酯固蓝B盐盐+H2O-萘酚萘酚+乙酸（紫红色）乙酸（紫红色）（2 2）乙酸）乙酸-萘酯固蓝萘酯固蓝B B盐盐11感谢您的观看2019年6月16本节首页退出本章乙酸-萘酯固蓝B盐+H2O（2）乙酸-本节首页本节首页退出本章退出本章（3 3）乙酸羟基吲哚显色法）乙酸羟基吲哚显色法乙酸羟基吲哚乙酸羟基吲哚+H2O吲哚酚吲哚酚+乙酸乙酸吲哚酚吲哚酚+O2 靛蓝（蓝色）靛蓝（蓝色）12感谢您的观看2019年6月16本节首页退出本章（3）乙酸羟基吲哚显色法乙酸羟基吲哚+H2O本节首页本节首页退出本章退出本章（4 4）乙酸靛酯显色法）乙酸靛酯显色法乙酸靛酯乙酸靛酯+H2O靛酚蓝（蓝色）靛酚蓝（蓝色）+乙酸乙酸13感谢您的观看2019年6月16本节首页退出本章（4）乙酸靛酯显色法乙酸靛酯+H2O靛酚蓝水解水解加酶加酶显色剂显色剂未水解未水解显色剂显色剂不显色不显色显色显色5 5、测定方法、测定方法（1 1）测定原理）测定原理无农药无农药有农药有农药14感谢您的观看2019年6月16水解加酶显色剂未水解显色剂不显色显色5、测定方法（1）测定原5、测定方法、测定方法加入20ml提取试剂提 取 取2g样品（非叶菜类取4g），切碎取 样振荡12min抑制反应将上清液倒入试管中，静止3min，加入50ul酶，3ml样品提取液，50ul显色剂培 养倒入比色杯测定仪器测定（2）、比色法）、比色法15感谢您的观看2019年6月165、测定方法加入20ml提取试剂提 取 取2g样品（非叶菜本节首页本节首页退出本章退出本章（3）、酶片法）、酶片法酶片为浸渍有胆碱酯酶的或其他敏感酶片为浸渍有胆碱酯酶的或其他敏感酯类的滤纸片或类似载体物质，其基酯类的滤纸片或类似载体物质，其基本技术原理与比色法相同。本技术原理与比色法相同。16感谢您的观看2019年6月16本节首页退出本章（3）、酶片法酶片为浸渍有胆碱酯酶的或其他敏本节首页本节首页退出本章退出本章6、技术问题、技术问题（1 1）分析对象：有机磷、氨基甲酸酯类）分析对象：有机磷、氨基甲酸酯类（2 2）灵敏度不高，需用）灵敏度不高，需用GCGC进一步定性和定进一步定性和定 量、重现性不好量、重现性不好（3 3）农药含量影响酶抑制程度）农药含量影响酶抑制程度（4 4）影响因子：酶的浓度、温度、）影响因子：酶的浓度、温度、pHpH17感谢您的观看2019年6月16本节首页退出本章6、技术问题（1）分析对象：有机磷、氨基甲酸本节首页本节首页退出本章退出本章二、免疫检测技术二、免疫检测技术Pathogen18感谢您的观看2019年6月16本节首页退出本章二、免疫检测技术Pathogen18感谢您的1、免疫反应、免疫反应本节首页本节首页退出本章退出本章免疫反应：细菌、病毒免疫反应：细菌、病毒入入侵侵抵御的抗体，即识别和抵御的抗体，即识别和排除进入体内的抗原性异物排除进入体内的抗原性异物的保护性反应。的保护性反应。抗原：外来物抗原：外来物19感谢您的观看2019年6月161、免疫反应本节首页退出本章免疫反应：细菌、病毒入侵抵御2、免疫分析、免疫分析本节首页本节首页退出本章退出本章免疫分析：以抗原和抗体的特异性、可免疫分析：以抗原和抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析方法。逆性结合反应为基础的分析方法。免疫反应特点：高度选择性。免疫反应特点：高度选择性。20感谢您的观看2019年6月162、免疫分析本节首页退出本章免疫分析：以抗原和抗体的特异性、本节首页本节首页退出本章退出本章3、酶联免疫吸附测定法、酶联免疫吸附测定法ELISA（Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)原理：在测定过程中，样品提取液中的农药原理：在测定过程中，样品提取液中的农药与已知数量的酶联剂竞争有限数量的抗体吸与已知数量的酶联剂竞争有限数量的抗体吸附位点。（加入显色剂）附位点。（加入显色剂）21感谢您的观看2019年6月16本节首页退出本章3、酶联免疫吸附测定法ELISA（Enzym（1）、直接）、直接ELISA原理原理AgAg*AbSPAbAb：Ag：Ag*22感谢您的观看2019年6月16（1）、直接ELISA原理AgAg*AbSPAbAb：Ag（2）、间接）、间接ELISA原理原理AgAb*SPAg：AbAgAg：AbAb*Ag：Ab：Ab*23感谢您的观看2019年6月16（2）、间接ELISA原理AgAb*SPAg：AbAgAg：本节首页本节首页退出本章退出本章4、农药抗体制备、农药抗体制备Antibody（Ab）：动物肌体某些活性）：动物肌体某些活性细胞在某些物质（抗原）刺激下产生，细胞在某些物质（抗原）刺激下产生，并能与这些物质特异性结合的一类活性并能与这些物质特异性结合的一类活性物质。物质。24感谢您的观看2019年6月16本节首页退出本章4、农药抗体制备Antibody（Ab）：动本节首页本节首页退出本章退出本章5、ELISA法的特点法的特点（1）适用于常规方法无法测定的农药）适用于常规方法无法测定的农药（2）适用于环境监控）适用于环境监控（3）适用于单一农药品种残留检测）适用于单一农药品种残留检测25感谢您的观看2019年6月16本节首页退出本章5、ELISA法的特点（1）适用于常规方法无复习思考题复习思考题1、酶抑制法测定农药残留的基本原理是什么、酶抑制法测定农药残留的基本原理是什么？2、免疫分析法应用于农药残留检测的关键问、免疫分析法应用于农药残留检测的关键问题是什么？题是什么？3、农药快速检测技术的检测原理是什么？、农药快速检测技术的检测原理是什么？本节首页本节首页退出本章退出本章26感谢您的观看2019年6月16复习思考题复习自测1、酶抑制法测定农药残留的基本原理是什么？