蛋白质电泳技术介绍

LOGO电泳技术介绍SDSSDS聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳 SDS-PAGESDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)2完整完整ppt基本原理基本原理1.SDS1.SDS能能断断裂裂分分子子内内和和分分子子间氢键，破破坏坏蛋蛋白白质的的二二级和和三三级结构构，强还原原剂能能使使半半胱胱氨氨酸酸之之间的的二二硫硫键断裂。断裂。2.2.蛋蛋白白质样品品在在100100用用SDSSDS和和还原原剂处理理，可可解解聚聚成成亚基基,加入加入SDSSDS，改，改变了了蛋白蛋白质的构象的构象。3.3.各各种种SDS-SDS-蛋蛋白白质复复合合物物均均带相相同同密密度度的的负电荷荷，其其荷荷电超超过了了原原蛋蛋白白质，消消除除了了不不同同蛋蛋白白质的的荷荷电差异。差异。3完整完整ppt图解解4完整完整ppt多孔凝胶多孔凝胶混合大分子混合大分子电泳泳5完整完整ppt操作流程操作流程制胶制胶上上样电泳泳染色染色脱色脱色6完整完整pptv制胶制胶v1 1将玻璃板用蒸将玻璃板用蒸馏水洗水洗净晾干，把玻璃板在灌胶支架上固定好晾干，把玻璃板在灌胶支架上固定好v2 2 按照配方制按照配方制备分离胶，分离胶，TEMEDTEMED在灌胶前加入混匀，迅速灌胶在灌胶前加入混匀，迅速灌胶v3 3 在分离胶上迅速并在分离胶上迅速并轻柔的加上水或无水乙醇柔的加上水或无水乙醇进行水封（凝行水封（凝胶聚合好的胶聚合好的标志是胶与水志是胶与水层之之间形成清晰的界面）形成清晰的界面）v4 4 倒出水并用倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干把剩余的水分吸干,按比例配好按比例配好浓缩胶胶,连续平平稳加入加入浓缩胶至离胶至离边缘5mm5mm处,迅速插入迅速插入样梳梳,静置静置4040分分钟具体步骤7完整完整pptv上上样按一定按一定顺序在加序在加样孔中加入孔中加入样品，根据品，根据SDS-PAGESDS-PAGE电泳玻璃板泳玻璃板间隙厚度不同，隙厚度不同，选择加入加入样品量。品量。v电泳泳打开打开电源将源将电压调到到80v80v（一般（一般15min15min左右），待左右），待样品跑品跑过压缩胶后将胶后将电压调到到120v120v至至样品品电泳到胶底部泳到胶底部为止。止。8完整完整pptv染色染色将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液（考将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液（考马斯亮斯亮蓝），用），用摇床床摇2 23h3hv脱色脱色待条待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜。将脱色液倒掉夜。将脱色液倒掉，可以用，可以用Quality OneQuality One，或者相，或者相应的成像系的成像系统拍照、分析、拍照、分析、估算蛋白估算蛋白浓度。度。9完整完整ppt等等电聚焦聚焦电泳泳 (Isoelectro focusing IEF or EF)10完整完整ppt等等电聚焦聚焦电泳泳 ，是利用有，是利用有pHpH梯度的介梯度的介质分离分离等等电点不同点不同的蛋白的蛋白质的的电泳技泳技术。由于其分辨率。由于其分辨率可到达可到达0.01pH0.01pH单位，因此特位，因此特别适合于分离适合于分离分子量分子量相近而等相近而等电点不同点不同的蛋白的蛋白质组分。分。适用适用:1.:1.研究蛋白研究蛋白质微微观不均一性不均一性 2.2.测定蛋白定蛋白质等等电点点基本原理基本原理11完整完整ppt4形成形成电场3蛋白蛋白质加加样21用用电流在凝流在凝胶溶液中建胶溶液中建立一个立一个稳定定的的PHPH梯度梯度蛋白蛋白质移移动到它到它们各自的等各自的等电点，点，不同等不同等电点的蛋点的蛋白白质被分开被分开12完整完整ppt+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 13完整完整pptpHpH梯度构建梯度构建载体两性体两性电解解质pH梯度梯度(Carrier ampholytes pH gradients，CA):在在电场中通中通过两性两性缓冲离子建立的冲离子建立的pH梯度。梯度。固相固相pH梯度（梯度（immobilized pH gradients，IPG）将将缓冲基冲基团共价共价键合在介合在介质上成上成为凝胶介凝胶介质的一部分而建立的一部分而建立pH梯度（梯度（线性和非性和非线性），分辨率性），分辨率比前者高一个数量比前者高一个数量级。14完整完整ppt载体两性体两性电解解质（CA）应具具备的条件的条件v(1)在等在等电点点处必需有足必需有足够的的缓冲能力冲能力 v(2)在等在等电点必需有足点必需有足够高的高的电导 v(3)分子量要小，便于与被分离的高分子物分子量要小，便于与被分离的高分子物质用用透析或凝胶透析或凝胶过滤法分开。法分开。v(4)化学化学组成成应不同于被分离物不同于被分离物质，不干，不干扰测定。定。v(5)应不与分离物不与分离物质反反应或使之或使之变性。性。15完整完整ppt操作流程操作流程制胶制胶装管装管装槽，装槽，电泳泳剥胶剥胶固定固定测定定pHpH梯度梯度16完整完整ppt具体步具体步骤v1.1.配胶配胶v2.2.装管装管 每个学生装两支管，每每个学生装两支管，每组装四支。先用肥皂洗手，然后将装四支。先用肥皂洗手，然后将圆盘电泳槽的玻璃管洗泳槽的玻璃管洗净，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在直放在试管架上，用移液管将配好的胶液移入管内，（每根管架上，用移液管将配好的胶液移入管内，（每根玻璃管的容量玻璃管的容量约为1.5-1.8ml1.5-1.8ml）,液面加至距管口液面加至距管口1mm1mm处，用，用注射器注射器轻轻加入少加入少许H2OH2O，进行水封，以消除弯月面使胶柱行水封，以消除弯月面使胶柱顶端平坦。胶管垂直聚合端平坦。胶管垂直聚合约3030分分钟，聚合完成，聚合完成时可可观察到水察到水封下的折光面。封下的折光面。17完整完整pptv3.3.装槽和装槽和电泳泳 v用用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，将胶管垂直插入向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，泳槽内，调节好各管的高度，好各管的高度，记下管号。每支管下管号。每支管约1/31/3在上槽，在上槽，2/32/3在下槽。上槽加入在下槽。上槽加入500ml 0.1M H3PO4500ml 0.1M H3PO4，下槽加入，下槽加入500ml 0.1M NaOH500ml 0.1M NaOH，淹没各，淹没各管口和管口和电极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。上槽接正极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。上槽接正极，下槽接极，下槽接负极，开启极，开启电泳泳仪，恒，恒压160V160V，聚焦，聚焦2 2至至3 3小小时，至至电流近于零不再降低流近于零不再降低时，停止，停止电泳。泳。18完整完整pptv4.4.剥胶剥胶 取下胶管，用取下胶管，用H2O H2O 将胶管和两端洗将胶管和两端洗2 2次，用注射器沿管壁次，用注射器沿管壁轻轻插入插入针头，在，在转动胶管和内插胶管和内插针头的同的同时分分别向胶管两端向胶管两端注入注入H2OH2O少少许，胶条即自行滑出，若不滑出可用洗耳球，胶条即自行滑出，若不滑出可用洗耳球轻轻挤出。胶条置于小培养皿内，出。胶条置于小培养皿内，记住正极端住正极端为“头”，负极极端端为“尾尾”，若分不清，若分不清时，可用，可用pHpH试纸鉴定，酸性端定，酸性端为正，正，碱碱性端性端为负。19完整完整pptv5.5.固定固定 取取2 2支胶条置于一个小培养皿内，倒入支胶条置于一个小培养皿内，倒入10%10%三三氯乙酸溶液至没乙酸溶液至没过胶条，胶条，进行固定，行固定，约半小半小时后，即可看到胶条内蛋白后，即可看到胶条内蛋白质的的白色沉淀白色沉淀带。固定完。固定完毕，倒出固定液，用直尺量出胶条，倒出固定液，用直尺量出胶条长度度“L2”L2”和正极端到蛋白和正极端到蛋白质白色沉淀白色沉淀带中心（即聚焦部位）的中心（即聚焦部位）的长度度“L”L”。固定后的胶条可在康固定后的胶条可在康强860860紫外紫外/可可见分光光度分光光度计上用上用280nm280nm或或238nm238nm波波长作凝胶作凝胶扫描，然后用描，然后用扫描描图作相作相应的的测量和量和计算。算。20完整完整pptv6.6.测定定pHpH梯度梯度 将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测pHpH胶条的胶条的长度度“L1”L1”。按照由正极至。按照由正极至负极的极的顺序，用序，用镊子和子和小刀依次将胶条切成小刀依次将胶条切成10mm10mm长的小段，分的小段，分别置于小置于小试管中，管中，加入加入1ml H2O1ml H2O，浸泡半小，浸泡半小时以上或以上或过夜，用仔夜，用仔细校正后的校正后的带细长pHpH复合复合电极的极的pHpH计测出每管浸出液的出每管浸出液的pHpH值。21完整完整ppt优缺点缺点v优点：分辨率高，区点：分辨率高，区带清晰、窄，加清晰、窄，加样部位自部位自由，重由，重现性好，不性好，不仅可可测定蛋白或多定蛋白或多肽的等的等电点点而且能将不同等而且能将不同等电点的混合生物大分子点的混合生物大分子进行行分离分离和和鉴定定。v缺点：需无缺点：需无盐溶液，不适用于在等溶液，不适用于在等电点点不溶解不溶解或或发生生变性性的蛋白。的蛋白。22完整完整ppt双向双向电泳泳（2-D electrophoresis）23完整完整ppt基本原理第第一一向向进行行等等电聚聚焦焦，蛋蛋白白质沿沿pHpH梯梯度度分分离离（将将适适宜宜的的IPGIPG试剂添添加加至至混混合合物物中中用用于于凝凝胶胶聚聚合合，在在聚聚合合中中缓冲冲基基团通通过乙乙烯键共共价价聚聚合合至至聚聚丙丙烯酰胺胺骨骨架架中中而而形形成成pHpH梯梯度度），至至各各自自的的等等电点点；随后，再沿垂直的方向随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。行分子量的分离。24完整完整ppt第一向第一向第一向第一向：等等电聚焦聚焦电泳泳第二向第二向第二向第二向：SDS-PAGESDS-PAGE水平方向：反映出蛋白在水平方向：反映出蛋白在pIpI上的差异上的差异垂直方向：反映出它垂直方向：反映出它们在分子量上的差在分子量上的差别图解解25完整完整ppt2D2D电泳操作流程泳操作流程细胞裂解胞裂解匀匀浆预分分级除除杂质浓缩定量定量样品制品制备挖点挖点酶解解点靶点靶蛋白蛋白鉴定定分离分离双向双向电泳泳第一向第一向第二向第二向染色染色银染染 考染考染 荧光光图谱分析分析图像像获取取图谱分析分析26完整完整pptv1.1.样品制品制备v2.2.固相固相预制胶条的水化制胶条的水化v3.3.第一向等第一向等电聚焦聚焦v3.1.3.1.取出取出IPGIPG预制胶条（制胶条（7cm pH 4-77cm pH 4-7），室温平），室温平衡。衡。v3.2.3.2.在聚焦在聚焦盘或水化或水化盘中加入中加入样品。品。v3.3.3.3.去除去除预制制IPGIPG胶条上的保胶条上的保护层 。具体步具体步骤27完整完整pptv3.4.3.4.将将IPGIPG胶条置于聚焦胶条置于聚焦盘或水化或水化盘中中 。v3.5.3.5.在每根胶条上覆盖在每根胶条上覆盖1ml1ml矿物油。物油。v3.6.3.6.对好正、好正、负极，盖上盖子。极，盖上盖子。v3.7.3.7.设置等置等电聚焦程序。聚焦程序。v4.4.胶条的平衡胶条的平衡v4.14.1冰箱中取出的胶条，于室温放置冰箱中取出的胶条，于室温放置1010分分钟。28完整完整pptv4.24.2配制胶条平衡配制胶条平衡缓冲液冲液 I I。v4.34.3吸去胶条上的吸去胶条上的矿物油及多余的物油及多余的样品。品。v4.44.4第一次平衡。振第一次平衡。振荡1515分分钟。v4.54.5配制胶条平衡配制胶条平衡缓冲液冲液 IIII。v4.64.6第二次平衡第二次平衡 ，振，振荡1515分分钟。v4.74.7吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。29完整完整pptv4.84.8琼脂糖封胶液脂糖封胶液进行加行加热溶解。配制溶解。配制11电泳泳缓冲液。冲液。v5.5.第二向第二向SDS-PAGESDS-PAGE电泳泳v6.6.凝胶的染色及凝胶的染色及检测v7.PDQuest7.PDQuest软件分析件分析v8.8.质谱鉴定定30完整完整pptLOGO