ctDNA筛查癌症的挑战与困惑ppt课件

ctDNA筛查癌症：思考与困惑筛查癌症：思考与困惑南海区人民医院南海区人民医院 赵学峰赵学峰ctDNA筛查癌症：思考与困惑南海区人民医院赵学峰NIPT检验中发现意外孕妇肿瘤检验中发现意外孕妇肿瘤p450000例随访三年，其中例随访三年，其中79000 例深度研究追查例深度研究追查p共计共计55 例无法报告例无法报告NIPT结果，结果，40例孕妇证明存在肿瘤，例孕妇证明存在肿瘤，18 恶性、恶性、20例良性子宫纤维瘤例良性子宫纤维瘤、2例有影像学表现而未经病理例有影像学表现而未经病理证实证实p孕妇孕妇NIP筛查获得意外肿瘤检验结果率筛查获得意外肿瘤检验结果率1/万万NileshG.Dharajiya,DanielS.Grosu,DanielH.Farkas.IncidentalDetectionofMaternalNeoplasiainNoninvasivePrenatalTesting.Clinical Chemistry 64（2）：）：329335(2018)4000例孕妇，发现例孕妇，发现3例癌症例癌症FrdricAmant,PhD;MagaliVerheecke,MDIwonaWlodarsPresymptomaticIdentificationofCancersinPregnantWomenDuringNoninvasivePrenatalTesting.AMAOncology,2015：E1-E6我院：我院：2017年有年有4例显示多重染色体异常，无追踪数据例显示多重染色体异常，无追踪数据NIPT检验中发现意外孕妇肿瘤450000例随访三年，其中7正常人正常人13三体三体乳腺癌乳腺癌食道癌食道癌卵泡淋巴卵泡淋巴瘤瘤正常人13三体乳腺癌食道癌卵泡淋巴瘤术前术前术后术后术前术后NIPT的临床应用：的临床应用：6388例回顾分析例回顾分析258/6,388(4.04%)筛查阳性GrazianoPescia,NicolasGuex,ChristianIseli.Cell-freeDNAtestingofanextendedrangeofchromosomalanomalies:clinicalexperiencewith6,388consecutivecases.Geneticsinmedicine，2016NIPT的临床应用：6388例回顾分析258/6,388(ctDNA筛查胎儿异倍体的原理筛查胎儿异倍体的原理ctDNA筛查胎儿异倍体的原理ctDNA筛查癌症的挑战与困惑ppt课件肿瘤发生所涉及的基因变化肿瘤发生所涉及的基因变化p甲基化（SEPTIN9)p点突变p拷贝数变化p转位与倒位肿瘤发生所涉及的基因变化甲基化（SEPTIN9)ctDNA筛查需要考虑解决方案筛查需要考虑解决方案p费用p相对于cffDNA，ctDNA浓度满足吗？p点突变的检测方法pCNV的检测方法p倒位与转位的检测方法pctDNA与组织DNA的一致性及敏感性、特异性p全基因组测序Vs外显子测序Vs靶向panel测序p点突变、CNV的异常是否具有临床意义？ctDNA筛查需要考虑解决方案费用NGS到底要花多少钱？到底要花多少钱？NGS到底要花多少钱？NGS到底要花多少钱？到底要花多少钱？pIlluminaNextSeq500,HiSeq4000,HiSeqX5平台p全基因组测序：1669；全外显子测序：792p靶基因组合测序333p包含了样本制备、测序、拼接p非常依赖于技术熟练度，费用可相差2-5倍p没有计算仪器投入、人工、场地、后勤支持等费用p实际二代全基因组测序费用不低于5000美元/例NGS到底要花多少钱？NGS的工作流程的工作流程测序深度测序深度p测序深度：测序得到的碱基总量与基因组大小的比值p测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系p测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降p测序深度与花费呈正比测序深度与花费呈正比NGS的工作流程测序深度文库构建的作用文库构建的作用文库构建的作用对于对于NIPT，成本也是个重要因素，成本也是个重要因素对于NIPT，成本也是个重要因素ctDNA的生成与分类的生成与分类ctDNA的生成与分类pctDNA浓度受肿瘤大小、位置、分期影响浓度受肿瘤大小、位置、分期影响p癌症早期癌症早期ctDNA常常1%，晚期约，晚期约 75%的中晚期肿瘤：胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌、胃和食管癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、头颈癌pctDNA检出率检出率75%应用应用ctDNA对肝细胞肝癌的检测对肝细胞肝癌的检测(应用实例应用实例1）p来自肿瘤的ctDNA片段较短p85例A期肝癌和5例B期肝癌（巴塞罗那分期标准）p研究表明：肝癌患者主要涉及1和8号染色体异常p84%的肝细胞肝癌存在1或8号染色体CNV缺失或增多p同时分析肿瘤组织和血浆ctDNA，取得63%的一致性的一致性p肿瘤组织检出而ctDNA阴性（21%）：可能反映肿瘤小，ctDNA量少pctDNA检出而肿瘤组织阴性（15%）：反映肿瘤不均一性应用ctDNA对肝细胞肝癌的检测(应用实例1）来自肿瘤的ct红色：CNV增多绿色：CNV缺失Peiyong Jianga,Carol W.M.Chana,K.C.Allen Chan.Lengthening and shortening of plasma DNA in hepatocellular carcinoma patients.www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1500076112红色：CNV增多PeiyongJianga,CarolWctDNA筛查癌症的挑战与困惑ppt课件应用应用ctDNA对大肠癌的检测对大肠癌的检测(应用实例应用实例2）特点：染色体臂水平的缺失主要发生在6,8p,14qand1p,拷贝数增多主要发生在19,5,2,9p和20p.敏感性86.8%、特异性56.3%检出5例I期患者应用ctDNA对大肠癌的检测(应用实例2）特点：CellPhysiolBiochem2018;45:1444-1454患者健康人群CellPhysiolBiochem2018;45:1CNV的的Z评分用于活动或恶性预测（黑色素瘤）评分用于活动或恶性预测（黑色素瘤）CNV评分高于75th，预示活动病变ROC：0.9OR,46.7生存期：13.5月（75th）Vs73.8月（100Mb大小的CNVp事实上癌症时，CNV增多常至少一个拷贝，检出能力理论上高于上述表述NGS平台检出ctDNA的CNV能力假设目标片段仅存1个拷贝CNV检出率与测序深度、检出率与测序深度、CNV片段大小片段大小p在胎儿ctDNA检测得表现p有创侵入获取DNA样本CGH法比NIPT准确p在350万阅读深度，阳性率71.8%p42of45(93.3%)的CNV5Mbp35of35(100%)的CNV10Mbp仅有14of34(41.2%)的CNV2个CNV，5Mb2个CNV，100Mb不同癌症类型CNV检出数量与CNV片段大小Molparia100Mb：真阳性85.4%阳性预测值：99.7%5Mb：真阳性89.5%阳性预测值：99.5%CNV用于癌症组织起源的鉴别用于癌症组织起源的鉴别100Mb：5Mb：CNV用于癌症组织起源的鉴别p高分辨率（5Mb)与低分辨率（100Mb）CNV对组织起源鉴别无差异，而在于算法p胰腺腺癌、前列腺癌和甲状腺癌难以区分组织起源p无论高或低分辨率，对卵巢癌、乳腺癌,BRCA,GBMandKIRC的组织起源鉴别准确率95%p对于鳞癌类如HNSC,LUSC、BLCA，提高分辨率能改进鉴别能力（准确度提升5%以上）p鳞癌类LUSC,HNSC,ESCA和CESC的CNV相似，易于误分为同一种癌p胃肠道肿瘤如STAD,COAD和READ，也易误分为同一种肿瘤高分辨率（5Mb)与低分辨率（100Mb）CNV对组织起源鉴其它学者的研究：其它学者的研究：CNV模式与癌症类型模式与癌症类型p8例肺腺癌CTC，78%呈现一致CNV模式p同一癌症的不同亚型其CNV模式差异（治疗方法启示）p癌症患者治疗前后点突变基因此消彼长，但是CNV模式没有变化XiaohuiNi，MingleiZhuo.Reproduciblecopynumbervariationpatternsamongsinglecirculatingtumorcellsoflungcancerpatients.PNAS,2013（52）2108321088其它学者的研究：CNV模式与癌症类型8例肺腺癌CTC，78%肿瘤组织与血浆肿瘤组织与血浆ctDNA检出检出CNV的差异的差异肿瘤组织与血浆ctDNA检出CNV的差异靶向测序能减少成本吗？靶向测序能减少成本吗？靶向测序能减少成本吗？ctDNA样本检测样本检测CNV的困难的困难p外周血ctDNA量太少p采用PCR预先扩增目标基因片段势在必行p每一基因被打碎成100-200bp的片段，却无从得知断裂位置信息p每一基因必须设计众多引物以覆盖目的基因pPCR的扩增不均一性使得CNV计算不准确pCNV多是染色体臂得变化，多个相邻基因同时变化得可信度？p使用程序算法解决（ONCOCNV）ValentinaBoeva.Multi-factordatanormalizationenablesthedetectionofcopynumberaberrationsinampliconsequencingdata.BIOINFORMATICS，20414（30）：34433450ctDNA样本检测CNV的困难外周血ctDNA量太少ValeEser Kirkizlar的研究为的研究为ctDNA检测肿瘤检测肿瘤CNV提供思路提供思路p选取分布于5条染色体臂3168个SNPsp目标SNPs至少有10的人口次要等位基因频率（1000）p每个SNP设计多条引物p尽量减少引物二聚体产物形成的可能性pmmPCR-NGS工作流程涉及五个步骤：（1）库准备，（2）mmPCR，（3）条形码和汇集，（4）测序，和（5）序列读取比对p使用IlluminaHiSeq2500测序仪单向测序，BWA-MEM和samtoolsmpileup处理数据，p以hg19人类参考基因组做对照参考p样本构成：明确染色体臂细胞系掺入正常细胞系，包含0%-10%肿瘤ctDNAEserKirkizlar，BernhardZimmermann.DetectionofClonalandSubclonalCopy-NumberVariantsinCell-FreeDNAfromPatientswithBreastCancerUsingaMassivelyMultiplexedPCRMethodology.TranslationalOncology2015（8）：407-416EserKirkizlar的研究为ctDNA检测肿瘤CNV随机举例4条染色体臂p实测AAI与理论AAI高度相关p取得0.5%的AAI需要最少1%的ctDNApAAI:等位基因不平衡率随机举例4条染色体臂pctDNA在患者外周血的低浓度p一般外周血检出CNV需要ctDNA浓度3.7%-5.0%或AAI在2.2%-3.7%p采用规模SNP特异的PCR扩增后NGS检测CNV，AAI可低至0.5%,约需1%的肿瘤ctDNApmmPCR-NGS只能说明存在CNV异常，无法确定是缺失或增多pmmPCR-NGS需要知晓样本的单倍型（haplotype）信息EserKirkizlar，BernhardZimmermann.DetectionofClonalandSubclonalCopy-NumberVariantsinCell-FreeDNAfromPatientswithBreastCancerUsingaMassivelyMultiplexedPCRMethodology.TranslationalOncology2015（8）：407-416ctDNA在患者外周血的低浓度EserKirkizlar，以突变为主的肿瘤特征以突变为主的肿瘤特征p点突变与点突变与CNV之间存在反相关性之间存在反相关性p肾细胞肾癌(KIRC),胶质母细胞瘤(GBM),急性髓细胞性白血病(LAML),结直肠癌(COADREAD)、子宫癌(UCEC),pM1-M8型涉及PI3K-AKT信号途径pM9M14涉及APC,TP53和KRAS途径以突变为主的肿瘤特征点突变与CNV之间存在反相关性ctDNA筛查癌症的挑战与困惑ppt课件应用多基因组合评估乳腺癌风险时应用多基因组合评估乳腺癌风险时 必须谨慎小心必须谨慎小心p17国际顶级专家联合发表文章p在目前认为与乳腺癌相关的100多个基因中，仅有21被确认与遗传性乳腺癌相关。p尽管PTEN和TP53发生突变也与癌变相关，但是作者们认为选择偏倚的成分更多。p市场推出的多基因组合突变检验没有更多的科学证据，即使存在，与普通人群相比，其相对危险度不会超过1.5.NEJM2015;372:224357)应用多基因组合评估乳腺癌风险时基因基因panel判定体细胞判定体细胞 Vs 胚系突变胚系突变p采用111基因panel，误判为体系突变率31%p许多指南建议采用个别基因或包含少数基因的组合p基因与疾病关系明确的基因使得检验人员少犯错误基因panel判定体细胞Vs胚系突变采用111基因pan数据的生物信息学：巨大挑战数据的生物信息学：巨大挑战数据的生物信息学：巨大挑战ctDNA筛查癌症的挑战与困惑ppt课件ctDNA筛查癌症的挑战与困惑ppt课件p世界顶级实验室错误发生率：百万分之一p全基因组测序：30亿bp约产生3000个错误数据p肿瘤组织基因测序必须同时检测外周血或正常组织，意味着成本倍增、工作量倍增pSNP还是异常变异？0.5%0.05%？世界顶级实验室错误发生率：百万分之一小小有小王小小妈叔小亲小明明小亲了我小妈也妈写叔有有有有有妈有妈妈叔叔叔叔一一一一一正正正正在在在在在天天天天天写写写写作作作作作业业业业业在在王王王王亲亲亲亲亲亲来来来来来来爸爸爸爸爸爸电话话话话话话说说说说说小小有小王小小妈叔小亲小明明小亲了我小妈也妈写叔有有有有有妈有一天，小明在写作业，爸爸来电话，小明说王叔叔亲了我妈妈，也亲了我有一天，小明在写作业，爸爸来电话，小明说王叔叔亲了我，妈妈也亲了我有一天，王叔叔在写作业，爸爸来电话，小明说妈妈亲了王叔叔，王叔叔也亲了我.CNV的检出可能没有序列信息那么复杂有一天，小明在写作业，爸爸来电话，小明说王叔叔亲了我妈妈，也美国临床肿瘤学会和病理学会的联合声明美国临床肿瘤学会和病理学会的联合声明pctDNA对有些晚期癌症有确切临床帮助p没有证据表明ctDNA对早期癌症、疗效监测或疾病残留有用或价值有限p无证据表明ctDNA能用于癌症的筛查美国临床肿瘤学会和病理学会的联合声明ctDNA对有些晚期癌症请您批评指正！请您批评指正！请您批评指正！