《发酵工艺》配套教学课件

绪论绪论发酵工程（发酵工程（fermentation engineeringfermentation engineering）直接利用微生物的机能将物料加工以直接利用微生物的机能将物料加工以提供产品的过程，又称微生物工程。提供产品的过程，又称微生物工程。是研究利用微生物的工业，即微生物是研究利用微生物的工业，即微生物参与的工艺过程。参与的工艺过程。一、生物工艺发展简史一、生物工艺发展简史 1.1.传统生物技术的追溯传统生物技术的追溯 SauceSauce Pickled vegetables Pickled vegetables Cheese Cheese Dough fermentation Dough fermentationFermentationFermentation最初来自拉丁语最初来自拉丁语“发泡发泡”（ferverefervere）发酵现象的早期认识发酵现象的早期认识16801680年荷兰年荷兰leenvenhoekleenvenhoek制成显微镜制成显微镜 微生物微生物(microbe)(microbe)的存在。的存在。18571857年法国巴斯德年法国巴斯德(Pasteur)(Pasteur)证明了酒精是由证明了酒精是由酵母菌发酵引起的。酵母菌发酵引起的。18971897年德国毕西纳（年德国毕西纳（BuchnerBuchner）发现磨碎的酵）发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精母仍使糖发酵形成酒精 酶。酶。2.2.初期出现的生物技术产品初期出现的生物技术产品 acetone-butanolacetone-butanol latic acid latic acid alcohol alcohol bread yeast bread yeast citric acid citric acid amylase and protease amylase and protease3.3.近代生物技术产品近代生物技术产品 2020世纪世纪4040年代，以抗生素的生产为标志年代，以抗生素的生产为标志Surface culturesSurface cultures Submerged fermentation Submerged fermentation antibiotic antibiotic amino acid amino acid enzyme preparation enzyme preparation organic acid organic acid发酵现象发酵现象酿造食品工业酿造食品工业非食品工业非食品工业青霉素青霉素抗菌素发酵工业抗菌素发酵工业氨基酸氨基酸,核酸发酵（代谢控制核酸发酵（代谢控制发酵）发酵）基因工程菌基因工程菌动物细胞大规模培养动物细胞大规模培养植植物细胞大规模培养物细胞大规模培养藻类细胞大规模培养藻类细胞大规模培养发酵工程的发展历史发酵工程的发展历史 工业发酵发展简史工业发酵发展简史时间时间 发酵阶段发酵阶段 主要产品主要产品 主要技术主要技术-1900 -1900 天然发酵天然发酵 酒酒 醋醋 干酪干酪 酵母酵母 天然分批天然分批1905-1905-纯培养纯培养 酒精酒精 丙酮丁醇丙酮丁醇 密闭纯培养密闭纯培养1940-1940-通气搅拌通气搅拌 抗生素抗生素 有机酸有机酸 通气搅拌通气搅拌 酶酶 维生素维生素 分批或连续分批或连续1957-1957-代谢控制代谢控制 氨基酸氨基酸 核苷酸核苷酸 选育缺陷菌株选育缺陷菌株1960-1960-开拓原料开拓原料 单细胞蛋白单细胞蛋白 连续发酵连续发酵1979-1979-基因工程菌基因工程菌 胰岛素胰岛素 干扰素干扰素 DNA DNA 重组重组纯培养纯培养:第一个转折点第一个转折点 通气搅拌通气搅拌:第二个转折点第二个转折点 代谢控制：第三个转折点代谢控制：第三个转折点 基因工程菌：第四个转折点基因工程菌：第四个转折点 二、生物反应的过程二、生物反应的过程 cell enzyme biocatalyst monitor sterlized air product bioreactor by product residue sterilizing mediumextract 发酵工程的概念和内容 菌种选育自然界筛选、诱变育种、基因工自然界筛选、诱变育种、基因工程、细胞工程程、细胞工程培养基配制根据培养基的配制原则制备，实践中根据培养基的配制原则制备，实践中需多次试验配方需多次试验配方灭菌杀灭杂菌杀灭杂菌扩大培养和接种发酵过程（中心阶段）检测进程，满足营养需要；严格控制温度、检测进程，满足营养需要；严格控制温度、pHpH、溶氧、转速等、溶氧、转速等分离纯化菌体：过滤、沉淀菌体：过滤、沉淀代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换 四部分组成四部分组成1.1.生物催化剂的制备生物催化剂的制备2.2.原料预处理及培养基的制备原料预处理及培养基的制备3.3.生物反应器及反应条件的选择生物反应器及反应条件的选择 厌氧：厌氧：alcohol,beer,acetone,alcohol,beer,acetone,发酵方式发酵方式 butanol,lactic acidbutanol,lactic acid 好氧：好氧：amino acid,antibioticamino acid,antibiotic4.4.产品的分离与纯化产品的分离与纯化三、三、微生物工业产品的类型微生物工业产品的类型1.1.微生物菌体的发酵微生物菌体的发酵 以获得具有某种用途的菌体为目的的以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵工业。发酵工业。2.2.微生物酶发酵微生物酶发酵 目前应用的酶大多来自微生物发酵。目前应用的酶大多来自微生物发酵。3.3.微生物代谢产物发酵微生物代谢产物发酵(1)(1)初级代谢产物初级代谢产物(primary metabolite)(primary metabolite)菌体生长繁殖所必需的，在对数生长期产菌体生长繁殖所必需的，在对数生长期产生的物质，如氨基酸、核苷酸、蛋白质等。生的物质，如氨基酸、核苷酸、蛋白质等。(2)(2)次级代谢产物次级代谢产物(secondary metabolite)(secondary metabolite)与菌体生长繁殖无明显关系，是在菌体生与菌体生长繁殖无明显关系，是在菌体生长的稳定期（静止期）合成的具有特定功能的长的稳定期（静止期）合成的具有特定功能的产物。如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生产物。如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子、色素等。长因子、色素等。初级代谢产物和次级代谢产物的异同初级代谢产物和次级代谢产物的异同4.4.微生物的生物转化微生物的生物转化 利用微生物细胞的一种或多种酶，把利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有价值的一种化合物转变成结构相关的更有价值的产物。产物。最显著的特点是特异性强。最显著的特点是特异性强。5.5.微生物特殊机能的利用微生物特殊机能的利用 利用微生物消除环境污染、保持生态利用微生物消除环境污染、保持生态平衡等。平衡等。发酵工程的应用发酵工程的应用 由于微生物许多独特的优点，使发酵工由于微生物许多独特的优点，使发酵工程在当前能源、资源紧张，人口、粮食以及程在当前能源、资源紧张，人口、粮食以及污染问题日益严重的情况下，发挥着重要的污染问题日益严重的情况下，发挥着重要的作用。作用。1.1.医药工业：抗生素、维生素、人胰岛素、医药工业：抗生素、维生素、人胰岛素、乙肝疫苗、干扰素、透明质酸等。乙肝疫苗、干扰素、透明质酸等。2.2.食品工业：微生物蛋白、氨基酸、新糖原、食品工业：微生物蛋白、氨基酸、新糖原、饮料、酒类和一些食品添加剂等。饮料、酒类和一些食品添加剂等。3.3.能源工业：纤维素、半纤维素的转化，利能源工业：纤维素、半纤维素的转化，利 用微生物采油、产氢及微生物新能源等。用微生物采油、产氢及微生物新能源等。4.4.化学工业：生产可降解的生物塑料、化工化学工业：生产可降解的生物塑料、化工 原料如乙醇、丙酮等、生物表面活性剂及原料如乙醇、丙酮等、生物表面活性剂及 生物凝集剂等。生物凝集剂等。5.5.冶金工业：黄金开采和铜、铀等金属的浸冶金工业：黄金开采和铜、铀等金属的浸 提等。提等。6.6.农业、牧业：生物固氮、生物杀虫剂、微农业、牧业：生物固氮、生物杀虫剂、微 生物农药、微生物饲料等。生物农药、微生物饲料等。7.7.环境保护：微生物降解。环境保护：微生物降解。（1 1）酿酒工业（啤酒、葡萄酒、白酒等）酿酒工业（啤酒、葡萄酒、白酒等）（2 2）食品工业（酱、酱油、食醋、面包、酸乳等）食品工业（酱、酱油、食醋、面包、酸乳等）（3 3）有机溶剂发酵工业（酒精、丙酮、丁醇等）有机溶剂发酵工业（酒精、丙酮、丁醇等）（4 4）抗生素发酵工业（青霉素、链霉素、土霉素等）抗生素发酵工业（青霉素、链霉素、土霉素等）（5 5）酸制剂发酵工业（柠檬酸、葡萄糖酸等）酸制剂发酵工业（柠檬酸、葡萄糖酸等）（6 6）酶制剂发酵工业（淀粉酶、蛋白酶等）酶制剂发酵工业（淀粉酶、蛋白酶等）（7 7）氨基酸发酵工业（谷氨酸、赖氨酸等）氨基酸发酵工业（谷氨酸、赖氨酸等）（8 8）核苷酸类物质发酵工业（肌苷酸、肌苷等）核苷酸类物质发酵工业（肌苷酸、肌苷等）（9 9）维生素发酵工业（维生素维生素发酵工业（维生素B2B2、维生素、维生素B12B12等）等）（1010）生物活性物质发酵工业（激素、赤霉素等）生物活性物质发酵工业（激素、赤霉素等）（1111）微生物菌体蛋白发酵工业（酵母、单细胞蛋白等）微生物菌体蛋白发酵工业（酵母、单细胞蛋白等）（1212）微生物环境净化工业（利用微生物处理废水、污水等）微生物环境净化工业（利用微生物处理废水、污水等）（1313）生物能源工业（沼气、纤维素等天然原料发酵生产酒精、）生物能源工业（沼气、纤维素等天然原料发酵生产酒精、乙烯等能源物质）乙烯等能源物质）（1414）微生物冶金工业（利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等）微生物冶金工业（利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等）第一章第一章 菌种选育菌种选育 第一节第一节 工业常用微生物及要求工业常用微生物及要求一、常见微生物一、常见微生物 （一）细菌（一）细菌（bacteriabacteria）醋杆菌属（醋杆菌属（AcetobacterAcetobacter）乳杆菌属（乳杆菌属（LactobacillusLactobacillus）芽孢杆菌属（芽孢杆菌属（BacillusBacillus）短杆菌属（短杆菌属（BrevibacteriumBrevibacterium）棒杆菌属（棒杆菌属（CorynebacteriumCorynebacterium）（二）放线菌（二）放线菌（actinomycesactinomyces）最大的经济价值在于产生多种抗生素最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibioticantibiotic）链霉菌（链霉菌（StreptomycesStreptomyces）小单孢菌属（小单孢菌属（MicromonosporaMicromonospora）（三）霉菌（三）霉菌（mouldmould）1.1.曲霉属（曲霉属（AspergillusAspergillus）黑曲霉（黑曲霉（A.nigerA.niger）米曲霉（米曲霉（A.oryzaeA.oryzae）黄曲霉（黄曲霉（A.flavusA.flavus）2.2.青霉属（青霉属（PenicillumPenicillum）桔青霉（桔青霉（P.citrinumP.citrinum）产生产生5 5磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。3.3.根霉属（根霉属（RhizopusRhizopus ）米根霉（米根霉（R.oryzaeR.oryzae）华根霉（华根霉（R.chinensisR.chinensis）4.4.红曲霉属（红曲霉属（MonascusMonascus）（四）酵母（四）酵母（yeastyeast）1.1.酵母属（酵母属（SaccharomycesSaccharomyces）啤酒酵母（啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）2.2.假丝酵母属（假丝酵母属（CandidaCandida）产朊假丝酵母（产朊假丝酵母（Candida utilisCandida utilis）3.3.毕赤酵母属（毕赤酵母属（PichiaPichia）（五）其它微生物（五）其它微生物1.1.担子菌（担子菌（basidiomycetesbasidiomycetes）即菇类）即菇类（mushroommushroom）2.2.藻类（藻类（algaalga）几几种种菌菌落落 （六）噬菌体（六）噬菌体（phagephage）危害以细菌和放线菌为生危害以细菌和放线菌为生产菌株的发酵工业。产菌株的发酵工业。特点：特点：1.1.体积比细菌小得多，可以通体积比细菌小得多，可以通 过细菌滤器。过细菌滤器。2.2.没有细胞结构，由核酸和蛋没有细胞结构，由核酸和蛋 白质构成。白质构成。3.3.营专性活物寄生，即只能在营专性活物寄生，即只能在 特异性寄主细胞中增殖。特异性寄主细胞中增殖。烈性噬菌体烈性噬菌体 引起寄主细胞迅速裂解。引起寄主细胞迅速裂解。受感染的细菌称敏感性细菌。受感染的细菌称敏感性细菌。温和噬菌体温和噬菌体 随寄主细胞的繁殖而繁殖。随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。吸附吸附吸附吸附注入核酸注入核酸注入核酸注入核酸合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质释放释放释放释放装配装配装配装配 二、微生物工业对菌种的要求二、微生物工业对菌种的要求1.1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。2.2.易控制培养条件，发酵周期较短。易控制培养条件，发酵周期较短。3.3.抗杂菌和噬菌体的能力强。抗杂菌和噬菌体的能力强。4.4.不易变异和退化，不产生任何有害物质和不易变异和退化，不产生任何有害物质和 毒素。毒素。第二节第二节 工业微生物菌种的选育工业微生物菌种的选育一、自然选育一、自然选育（一）从自然界分离获得菌种（一）从自然界分离获得菌种采样采样增殖培养增殖培养（富集培养（富集培养 enrichmentenrichment）提供有利于所需菌株生长而不利于提供有利于所需菌株生长而不利于其它菌型生长的条件，即其它菌型生长的条件，即让目的微生物让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。在种群中占优势，使筛选变得可能。方法：方法：（1 1）控制培养基成分）控制培养基成分（2 2）控制培养条件）控制培养条件（3 3）抑制不需要的菌类）抑制不需要的菌类3.3.纯种分离纯种分离（1 1）划线法：简单、快捷。）划线法：简单、快捷。（2 2）稀释法：菌落单一均匀，适合分）稀释法：菌落单一均匀，适合分 离具有蔓延性的微生物。离具有蔓延性的微生物。固体培养基四区固体培养基四区划法接种法划法接种法接种针先以火焰灭菌法灭菌接种针先以火焰灭菌法灭菌步骤一轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却步骤二以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。步骤三更换一个新的无菌营养平板更换一个新的无菌营养平板步骤四将接种针上的细菌划于一个新的营养平板将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区上。此为第一菌区 。步骤五重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。步骤六由第五步骤的第一区中划出第二由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。区，如右上图。步骤七重复第六以及第七步骤，由第七步骤的重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，如右上图。第二区中划出第三区，如右上图。步骤八重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。的营养平板，如右上图。步骤九 在营养平板上贴好标在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及作者姓名、菌种学名以及培养基名称。培养基名称。步骤十步骤十固体培养基的稀释涂固体培养基的稀释涂抹接种法抹接种法需要使用的仪器需要使用的仪器震荡机震荡机 吸取准备好欲稀释的菌液吸取准备好欲稀释的菌液吸取充分均匀后的菌液吸取充分均匀后的菌液 取含有取含有 9mL9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。将将试试管管于于震震荡荡机机上上，使使菌菌液液混混合合均均匀匀 取出试管中的第一次十倍稀释菌液取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL1mL，加入另一个新的含加入另一个新的含9mL9mL无菌水的试管中。无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。从最后稀释菌液中吸取从最后稀释菌液中吸取 0.1mL0.1mL菌液，菌液，置入准备好的无菌琼脂内。置入准备好的无菌琼脂内。将三角玻璃棒浸于酒精中将三角玻璃棒浸于酒精中 将三角玻璃棒在火焰上燃烧将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。数推算出菌液浓度。4.4.生产性能的测定生产性能的测定 一般采用两步法：一般采用两步法：初筛：以量为主初筛：以量为主 复筛：以质为主复筛：以质为主（二）从自发突变体中获得菌株（二）从自发突变体中获得菌株 自自然然状状态态下下，碱碱基基对对发发生生自自然然突突变变的的机机率为率为1010-8-81010-9-9，自然突变有两种情况，自然突变有两种情况：一一种种是是我我们们生生产产上上所所不不希希望望看看到到的的，表表现现为为菌菌株株的的衰衰退退和和生生产产质质量量的的下下降降，这这种种突突变称为负突变。变称为负突变。另另一一种种是是我我们们生生产产上上希希望望看看到到的的，对对生生产有利，这种突变称为正突变。产有利，这种突变称为正突变。二、诱变育种二、诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。因突变进行的筛选，称为诱变育种。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。称为诱变剂。诱变剂诱变剂物理：紫外线，快中子物理：紫外线，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍 诱变育种的主要环节诱变育种的主要环节（1 1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液 诱变诱变（2 2）用合适的方法淘汰负效应变异株，）用合适的方法淘汰负效应变异株，选出性能优良的正变异株选出性能优良的正变异株筛选筛选 （一）诱变育种的程序（一）诱变育种的程序选择出发菌株选择出发菌株 制备菌悬液制备菌悬液 前培养前培养 物理诱变物理诱变诱变诱变 变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选 化学诱变化学诱变（二）突变株的筛选（二）突变株的筛选1.1.随机筛选：传统方法随机筛选：传统方法（1 1）摇瓶筛选法）摇瓶筛选法（2 2）琼脂块筛选法）琼脂块筛选法2.2.理化性筛选理化性筛选方法一：降低终产物浓度方法一：降低终产物浓度a.a.筛选终产物营养缺陷型筛选终产物营养缺陷型nAaBbCcDdEnb.b.筛选细胞膜透性改变的突变株筛选细胞膜透性改变的突变株 使终产物排出细胞，以降低细胞内终使终产物排出细胞，以降低细胞内终产物浓度。产物浓度。如：用谷氨酸棒杆菌（如：用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium Corynebacterium glutamicumglutamicum）的生物素营养缺陷型）的生物素营养缺陷型（biotin deficiencybiotin deficiency）进行谷氨酸发酵。）进行谷氨酸发酵。生物素：生物素：B B族维生素的一种，又称维族维生素的一种，又称维生素生素H H或辅酶或辅酶R R。是合成脂肪酸所必需的。是合成脂肪酸所必需的。脂肪酸的生物合成：脂肪酸的生物合成：利用乙酰利用乙酰CoACoA（直接原料是丙二酸单（直接原料是丙二酸单酰酰CoACoA）在乙酰）在乙酰CoACoA羧化酶（辅基为生物羧化酶（辅基为生物素）催化下合成。素）催化下合成。脂肪酸甘油磷酸脂肪酸甘油磷酸 磷脂蛋白质磷脂蛋白质 生物膜生物膜 因此，脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。因此，脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷氨酸透过细胞膜分泌至体外。谷氨酸透过细胞膜分泌至体外。使胞内代谢产物迅速排出的方法使胞内代谢产物迅速排出的方法1.用生理学手段用生理学手段直接抑制膜合成或使膜受缺损直接抑制膜合成或使膜受缺损如如:Glu发酵中，控制生物素发酵中，控制生物素亚适量亚适量可大量分泌可大量分泌Glu；当培养液中生物素含量较高时采用当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉适量添加青霉素素的方法；的方法；2.利用膜缺损突变株利用膜缺损突变株油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸缺陷型、甘油缺陷型如如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，限制地添加油酸，用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，限制地添加油酸，合成有缺损的膜。合成有缺损的膜。应用甘油缺陷型菌株，即便在生物素或油酸过量的应用甘油缺陷型菌株，即便在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。情况下，也可以获得大量谷氨酸。控制细胞膜的渗透性控制细胞膜的渗透性1.1.通过生理学手段控制细胞膜渗透性通过生理学手段控制细胞膜渗透性2.2.通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性生物素生物素谷氨酸谷氨酸细胞膜渗透性细胞膜渗透性青霉素青霉素谷氨酸谷氨酸油酸缺陷型油酸缺陷型油酸油酸方法二：筛选抗反馈突变株方法二：筛选抗反馈突变株抗反馈控制突变株抗反馈控制突变株是指对反馈抑制不敏是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。抗反馈控制突变株可以从抗反馈控制突变株可以从终产物结构类终产物结构类似物抗性突变株似物抗性突变株中获得。中获得。营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型菌株的筛选诱变诱变淘汰野生型菌株：淘汰野生型菌株：抗菌素法、菌丝过滤法抗菌素法、菌丝过滤法检出缺陷型：检出缺陷型：影印法影印法夹层法夹层法逐个检出法逐个检出法限量补充培养法限量补充培养法确定生长谱确定生长谱 第三节第三节 生产菌种的改良生产菌种的改良 一、原生质体融合（一、原生质体融合（protoplast fusionprotoplast fusion）1.1.标记菌株的筛选标记菌株的筛选 2.2.原生质体的制备原生质体的制备 3.3.原生质体的融合与再生原生质体的融合与再生 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）脱水剂）脱水剂 助融剂助融剂 CaCa2+2+提高融合频率提高融合频率 4.4.融合子的选择融合子的选择二、二、DNADNA重组技术重组技术 （DNA recombination technologyDNA recombination technology）1.1.目标目标DNADNA片断的获得片断的获得2.2.与载体与载体DNADNA分子的连接分子的连接3.3.重组重组DNADNA分子引入宿主细胞分子引入宿主细胞4.4.从中选出所需重组从中选出所需重组DNADNA分子的宿主细胞分子的宿主细胞 第四节第四节 菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退、复壮与保藏一、菌种的衰退一、菌种的衰退 衰退原因衰退原因1.1.菌种保藏不当菌种保藏不当2.2.菌种生长条件没有得到满足菌种生长条件没有得到满足二、二、菌种的复壮菌种的复壮 1.1.纯种分离纯种分离 2.2.通过寄主体进行复壮通过寄主体进行复壮 3.3.淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体三、菌种保藏三、菌种保藏 1.1.原理原理 低温、干燥、缺氧、缺营养物质低温、干燥、缺氧、缺营养物质 2.2.方法方法 （1 1）斜面保藏法）斜面保藏法 （2 2）干燥保藏法）干燥保藏法 （3 3）悬液保藏法）悬液保藏法 （4 4）冷冻干燥保藏法）冷冻干燥保藏法 （5 5）液氮保藏法）液氮保藏法 （6 6）低温保藏法）低温保藏法 第五节第五节 种子的扩大培养种子的扩大培养一、微生物的培养方法一、微生物的培养方法 1.1.表面培养表面培养 2.2.固体培养固体培养 3.3.液体深层培养液体深层培养二、菌种的扩大培养二、菌种的扩大培养 种子扩大培养的概念种子扩大培养的概念 指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。为种子。菌种扩大培养的目的：菌种扩大培养的目的：为每次发酵罐的投料提供相当数量的为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。代谢旺盛的种子。q接种量的需要接种量的需要q菌种的驯化菌种的驯化q缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平 （一）种子制备的工艺流程（一）种子制备的工艺流程 摇瓶摇瓶保藏菌种保藏菌种 试管斜面活化试管斜面活化 茄瓶斜面茄瓶斜面 种子罐种子罐 固体培养基固体培养基生理代谢生理代谢菌种筛选菌种筛选种子培养种子培养发酵培养发酵培养（二）（二）斜面菌种的培养斜面菌种的培养 1.1.不宜多次移种。不宜多次移种。2.2.活化斜面中加活化斜面中加0.1%0.1%葡萄糖。葡萄糖。培养基特点：原料较精细。培养基特点：原料较精细。（三）一级种子培养（摇瓶）（三）一级种子培养（摇瓶）培养基特点培养基特点：使用的原料基本接近于发酵培养基。使用的原料基本接近于发酵培养基。（四）二级种子培养（种子罐）（四）二级种子培养（种子罐）培养基的特点培养基的特点：和一级种子相似，其中葡萄糖用和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，水解糖代替，更接近于发酵培养基。更接近于发酵培养基。（五）种子罐级数（五）种子罐级数制备种子需逐级扩大培养的次数。制备种子需逐级扩大培养的次数。谷氨酸：一级种子罐扩大培养（二级发酵）谷氨酸：一级种子罐扩大培养（二级发酵）摇瓶培养摇瓶培养一级种子（小罐）一级种子（小罐）发酵发酵青霉素：二级种子罐扩大培养（三级发酵）青霉素：二级种子罐扩大培养（三级发酵）摇瓶培养摇瓶培养一级种子（小罐）一级种子（小罐）二级种子（中罐）二级种子（中罐）发酵发酵发酵级数确定的依据发酵级数确定的依据q级数受发酵规模、菌体生长特性、接种级数受发酵规模、菌体生长特性、接种 量的影响。量的影响。q级数大，难控制、易染菌、易变异，管级数大，难控制、易染菌、易变异，管 理困难，一般理困难，一般2-42-4级。级。（六）种龄与接种量（六）种龄与接种量 1.1.种龄种龄 种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对 较大。较大。2.2.接种量接种量 移入种子的体积移入种子的体积接种量接种量 接种后培养液的体积接种后培养液的体积 一般：一般：细菌细菌 1 1 霉菌霉菌 7 7 1515双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。大量地接入培养成熟菌种的优点：大量地接入培养成熟菌种的优点：1.1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵 周期，提高了设备利用率。周期，提高了设备利用率。2.2.节约了发酵培养的动力消耗。节约了发酵培养的动力消耗。3.3.并有利于减少染菌机会。并有利于减少染菌机会。工业发酵的目的工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物大量积累人们所需要的微生物代谢产物。代谢的人工控制代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。着人们希望的方向进行。人工控制代谢的手段人工控制代谢的手段：改变微生物遗传特性改变微生物遗传特性(遗传学方法）；遗传学方法）；控制发酵条件（生物化学方法）；控制发酵条件（生物化学方法）；改变细胞膜透性；改变细胞膜透性；第二章第二章 培养基及制备培养基及制备 第一节第一节 工业发酵培养基工业发酵培养基 发酵培养基的作用：发酵培养基的作用：满足菌体的生长满足菌体的生长 促进产物的形成促进产物的形成一、工业上常用的碳源（一、工业上常用的碳源（carbon carbon sourcesource）1.1.谷物淀粉（玉米、马铃薯、木薯淀粉）谷物淀粉（玉米、马铃薯、木薯淀粉）应用最广。应用最广。使用条件：使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。缺点：缺点：a.a.难利用、发酵液比较稠、一般难利用、发酵液比较稠、一般2.0%2.0%时加入时加入 一定的一定的-淀粉酶。淀粉酶。b.b.成分较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。成分较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。优点：优点：来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。2.2.葡萄糖葡萄糖所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡萄糖效应。萄糖效应。工业上常用淀粉水解糖工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一但是糖液必须达到一定的质量指标。定的质量指标。3.3.糖蜜糖蜜 （制糖工业上的废糖蜜或结晶母液）（制糖工业上的废糖蜜或结晶母液）cane molassescane molasses包括包括 beet molassesbeet molasses 糖蜜使用的注意点：糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，对发酵产生除糖份外，含有较多的杂质，对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵例：谷氨酸发酵有害物质：胶体成分（起泡、影响结晶）、钙盐（影有害物质：胶体成分（起泡、影响结晶）、钙盐（影 响结晶）、响结晶）、生物素（代谢控制）。生物素（代谢控制）。预处理：澄清预处理：澄清脱钙脱钙脱除生物素脱除生物素例：柠檬酸发酵例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：黄血盐预处理：黄血盐二、工业上常用的氮源（二、工业上常用的氮源（nitrogen nitrogen sourcesource）1.1.无机氮：无机氮：种类：氨水、铵盐或硝酸盐、尿素种类：氨水、铵盐或硝酸盐、尿素特点特点：吸收快，也称之迅速利用的氮源。但无机：吸收快，也称之迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起氮源的迅速利用常会引起pHpH的变化的变化,如：如：(NH4)2SO42NH3+2H2SO4NaNO3+4H2NH3+2H2O+NaOH 无机氮源被菌体利用后，培养液中留下了酸性或无机氮源被菌体利用后，培养液中留下了酸性或碱性物质。碱性物质。代谢后形成酸性物质的无机氮源称代谢后形成酸性物质的无机氮源称生理酸性物质生理酸性物质，如硫酸铵。如硫酸铵。代谢后产生碱性物质的无机氮源称代谢后产生碱性物质的无机氮源称生理碱性物质生理碱性物质，如硝酸钠。如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的程的pHpH有积极作用。有积极作用。所以选择合适的无机氮源有两层意义：所以选择合适的无机氮源有两层意义：q 满足菌体生长满足菌体生长q 稳定和调节发酵过程中的稳定和调节发酵过程中的pHpH无机氮源的影响：硫酸铵硝酸铵硝酸钠尿素毛霉产蛋白酶的研究毛霉产蛋白酶的研究2.2.有机氮：有机氮：来源：一些廉价的原料，如玉米浆、豆饼粉、来源：一些廉价的原料，如玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、鱼粉、酵母浸出膏等。花生饼粉、鱼粉、酵母浸出膏等。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。提供大量的无机盐及生长因子。三、无机盐三、无机盐（inorganic mineralinorganic mineral）硫酸盐、磷酸盐、氯化物及一些微量元素。硫酸盐、磷酸盐、氯化物及一些微量元素。四、生长因子（四、生长因子（growth factorgrowth factor）微生物生长不可缺少的微量有机物质。如微生物生长不可缺少的微量有机物质。如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素。氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素。1.1.生物素生物素作用：主要影响细胞膜通透性，同时也影响作用：主要影响细胞膜通透性，同时也影响菌体的代谢途径。即：影响菌体生长和谷菌体的代谢途径。即：影响菌体生长和谷氨酸积累。氨酸积累。过量：菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸。过量：菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸。不足：菌体生长不好，谷氨酸产量也低。不足：菌体生长不好，谷氨酸产量也低。因此，要达到菌体生长需要的因此，要达到菌体生长需要的“亚适量亚适量”。2.2.提供生长因子的农副产品原料提供生长因子的农副产品原料（1 1）玉米浆：（）玉米浆：（corn steep liquor,CSLcorn steep liquor,CSL）最具代表性。最具代表性。（2 2）麸皮水解液）麸皮水解液（3 3）糖蜜）糖蜜（4 4）酵母）酵母五、发酵培养基的设计和优化五、发酵培养基的设计和优化 设计步骤：设计步骤：初步确定可能的培养基成分；初步确定可能的培养基成分；通过单因子实验确定适宜的培养基成分；通过单因子实验确定适宜的培养基成分；采用正交试验法确定各成分最适浓度。采用正交试验法确定各成分最适浓度。类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化郭秒,食品与工业发酵，2004类胡萝卜素的作用：色素、营养保健原培养基原培养基:初步确定可能的培养基成分初步确定可能的培养基成分(以碳源为例以碳源为例)通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源 正交设计确定优化的配方正交设计确定优化的配方结果结果：碳源：乙酸钠碳源：乙酸钠 0.2%0.2%氮源：氯化铵氮源：氯化铵 0.2%0.2%酵母膏酵母膏 0.03%0.03%无机盐无机盐:复合无机盐复合无机盐0.05%0.05%摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础发酵罐：反应器水平,可以得出最 终优化的基 础配方pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究 第二节第二节 淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备 在工业生产中，将淀粉水解为葡在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖（萄糖（glucoseglucose）的过程称淀粉的糖化，）的过程称淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。制得的溶液叫淀粉水解糖。一、淀粉水解制糖的意义一、淀粉水解制糖的意义1.1.大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生产菌不能直接利用）基酸生产菌不能直接利用）2.2.有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但必有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但必须在微生物产生淀粉酶后才能进行，过程缓须在微生物产生淀粉酶后才能进行，过程缓慢，发酵周期延长。慢，发酵周期延长。3.3.若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致淀粉结块，发酵液粘度剧增。导致淀粉结块，发酵液粘度剧增。二、淀粉水解糖的制备方法及原理二、淀粉水解糖的制备方法及原理（一）酸解法（一）酸解法（acid hydrolysis methodacid hydrolysis method）以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。生成葡萄糖的方法。1.1.水解过程：水解过程：总反应式：总反应式：(C(C6 6H H1010O O5 5)n n+nH+nH2 2O nCO nC6 6H H1212O O6 6过程：过程：(C(C6 6H H1010O O5 5)n n (C(C6 6H H1010O O5 5)x x C C1212H H2222O O11 11 C C6 6H H1212O O6 6 淀粉淀粉 糊精糊精 麦芽糖麦芽糖 葡萄糖葡萄糖 H H+对作用点无选择性，对作用点无选择性，-1,4-1,4-糖苷键和糖苷键和-1,6-1,6-糖苷糖苷键均被切断。键均被切断。2.2.葡萄糖的复合反应和分解反应葡萄糖的复合反应和分解反应 在水解过程中，由于受到酸和热的作用，在水解过程中，由于受到酸和热的作用，一部分葡萄糖会发生复合反应和分解反应。一部分葡萄糖会发生复合反应和分解反应。淀粉淀粉 葡萄糖葡萄糖 复合二糖复合二糖 5 5羟甲基糠醛羟甲基糠醛 复合低聚糖复合低聚糖 有机酸、有色物质有机酸、有色物质损失葡萄糖量损失葡萄糖量 7 7 1122 3.22 7.0 12 等电点等电点（2 2）不溶性盐沉淀法）不溶性盐沉淀法 某些代谢产物在一定某些代谢产物在一定pHpH下，能与酸、碱或金属下，能与酸、碱或金属离子等形成不溶性盐沉淀析出，再用适当方法使复离子等形成不溶性盐沉淀析出，再用适当方法使复合物溶解。合物溶解。锌盐法：提取谷氨酸锌盐法：提取谷氨酸钙盐法：提取柠檬酸钙盐法：提取柠檬酸单单 宁：提取酶宁：提取酶（3 3）有机溶剂沉淀法）有机溶剂沉淀法试剂试剂试剂试剂：丙酮、乙醇、甲醇等亲水溶剂：丙酮、乙醇、甲醇等亲水溶剂：丙酮、乙醇、甲醇等亲水溶剂：丙酮、乙醇、甲醇等亲水溶剂原理原理原理原理：v降低水的介电常数，使蛋白质分子间静电引力增降低水的介电常数，使蛋白质分子间静电引力增大，导致聚集沉淀。大，导致聚集沉淀。v蛋白质的溶剂化，与蛋白质争夺水化水，使蛋白蛋白质的溶剂化，与蛋白质争夺水化水，使蛋白质溶解度降低。质溶解度降低。乙醇沉淀多糖：乙醇沉淀多糖：在较高的醇浓度下，降低多糖分子与水之间的在较高的醇浓度下，降低多糖分子与水之间的亲和力，使多糖分子之间相互结合形成沉淀。亲和力，使多糖分子之间相互结合形成沉淀。2.2.色谱分离法色谱分离法 色谱法也称层析法，是色谱法也称层析法，是19031903年俄国植年俄国植物学家物学家Michael TswettMichael Tswett发现并命名的。将发现并命名的。将植物色素溶液通过装有植物色素溶液通过装有CaCOCaCO3 3 吸附剂的柱吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。的速率流动后形成不同的色带而被分开。色谱起源色谱起源色谱色谱组分色素石油醚石油醚碳酸钙颗粒 用色彩（用色彩（chromachroma）和图谱（）和图谱（graphsgraphs）组成色谱一）组成色谱一词（词（Chromatography)Chromatography)。（1）吸附层析）吸附层析（adsorption adsorption chromatography）原理原理 利用吸附剂对组分吸附能力的差异进行分离。利用吸附剂对组分吸附能力的差异进行分离。通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。的极性官能团作用。常用吸附剂常用吸附剂:活性炭、氧化铝、碳酸钙、磷酸钙（羟基活性炭、氧化铝、碳酸钙、磷酸钙（羟基磷灰石）、硅胶等。磷灰石）、硅胶等。（2 2）离子交换层析）离子交换层析（ionexchangechromatography）l2020世纪初期，工业上利用天然的无机离子交换剂泡沸世纪初期，工业上利用天然的无机离子交换剂泡沸石来软化硬水。石来软化硬水。l泡沸石的化学成分为硅铝酸盐泡沸石的化学成分为硅铝酸盐(Na(Na2 2A1A12 2SiSi4 4O O1212nHnH2 2O)O)，与水接触时，其中的与水接触时，其中的NaNa+与水中的与水中的CaCa2+2+、MgMg2+2+发生交换发生交换作用：作用：NaNa2 2Z+CaZ+Ca2+2+CaZ+2NaCaZ+2Na+，使水软化。，使水软化。l但这类无机离子交换剂的交换能力低，化学稳定性和但这类无机离子交换剂的交换能力低，化学稳定性和机械强度差，应用受到很大限制。机械强度差，应用受到很大限制。l近近年年来来合合成成的的有有机机离离子子交交换换剂剂离离子子交交换换树树脂脂，克克服服了无机离子交换剂的缺点而得到了广泛应用。了无机离子交换剂的缺点而得到了广泛应用。l原理原理:根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。即：离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有即：离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换。相同电荷的溶质离子进行可逆交换。离子交换剂离子交换剂：离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。如羧甲基纤维素离子交换剂组成如羧甲基纤维素离子交换剂组成 纤维素纤维素O OCHCH2 2COOCOO-NaNa+载体载体 电荷基团电荷基团 反离子反离子 疏水性：疏水性：化学原料合成化学原料合成：树脂类物质：树脂类物质载体载体 亲水性：亲水性：天然材料制成：天然材料制成：cellulosecellulose、sephadex 阳离子交换剂阳离子交换剂:电荷基团（一）电荷基团（一）,反离子（）反离子（）电荷基团电荷基团 阴离子交换剂阴离子交换剂:电荷基团（）电荷基团（）,反离子（）反离子（）离子交换亲和力离子交换亲和力 树脂对离子亲合力的大小，与离子的半径大树脂对离子亲合力的大小，与离子的半径大小和带电荷的多少有关。小和带电荷的多少有关。1.1.平衡阶段平衡阶段:离子交换剂与反离离子交换剂与反离子结合。子结合。2.2.吸附阶段：吸附阶段：样品与反离子进样品与反离子进行交换。行交换。3 3、4.4.解吸附阶段：解吸附阶段：用梯度缓用梯度缓冲液洗脱，先洗下弱吸附物质，冲液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质。后洗下强吸附物质。5.5.再生阶段：再生阶段：用原始平衡液进用原始平衡液进行充分洗涤，即可重复使用。行充分洗涤，即可重复使用。12345原始缓冲溶液的反离子样品溶液梯度浓度Ion-exchange chromatography 氨基酸的分离氨基酸的分离(阳离子交换树脂阳离子交换树脂)用用pHpH递增的柠檬酸盐缓冲溶液洗脱侧链递增的柠檬酸盐缓冲溶液洗脱侧链p pK Ka a增大的氨基酸增大的氨基酸3.3.萃取法萃取法 （1 1）双水相萃取技术双水相萃取技术 (two-aqueous phase extraction)(two-aqueous phase extraction)又称水溶液两相分配技术又称水溶液两相分配技术 （partion of two aqueous phase systempartion of two aqueous phase system）用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEGPEG）和葡聚糖）和葡聚糖（DextranDextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%70%90%90%），故称），故称“双水相双水相”系统。系统。几种典型的双水相系统几种典型的双水相系统聚丙二醇聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇聚乙二醇、聚乙烯醇 葡聚糖（葡聚糖（Dex）羟丙基葡聚糖羟丙基葡聚糖聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）葡聚糖（葡聚糖（Dex）硫酸葡聚糖钠盐硫酸葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖钠盐羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素甲基纤维素聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）磷酸钾、磷酸钾、硫酸铵硫酸铵 硫酸钠、硫酸镁硫酸钠、硫酸镁a双节线系线b双节线均相区均相区两相区两相区系线临界点PEG/DxPEG/Dx和和PEG/KPiPEG/KPi系统的典型相图系统的典型相图 优点：优点：可直接从细胞破碎匀浆液中萃取蛋白质而无需可直接从细胞破碎匀浆液中萃取蛋白质而无需将细胞碎片分离，一步操作可达到固液分离和纯化将细胞碎片分离，一步操作可达到固液分离和纯化两个目的。两个目的。l应用应用l 胞内酶的提取和精制胞内酶的提取和精制:l 除去细胞碎片，避免了高粘度的细除去细胞碎片，避免了高粘度的细胞匀浆液进行固液分离的困难。胞匀浆液进行固液分离的困难。（2）超临界流体萃取超临界流体萃取（SupercriticalF1uidExtraction,SFE）兼有蒸馏和溶液萃取的特征，兼有蒸馏和溶液萃取的特征，与常规溶剂萃取的区别与常规溶剂萃取的区别:将超临界流体作为萃将超临界流体作为萃取剂。取剂。超临界流体超临界流体(supercritical fluid(supercritical fluid，SCFSCF）：超过气液共存时的最高压力和最：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点高温度下物质特有的点临界点后的流体临界点后的流体。原理：原理：SFESFE是利用是利用SCFSCF作为萃取剂，从液体和固体作为萃取剂，从液体和固体中萃取出特定成分，以达到某种分离的目的。中萃取出特定成分，以达到某种分离的目的。临界点的概念临界点的概念可用临界温度和临界压力解释：可用临界温度和临界压力解释：临界温度：临界温度：高于此温度时，无论加压多大高于此温度时，无论加压多大 也不能使气体液化。也不能使气体液化。临界压力：临界压力：在临界温度下，液化气体所需在临界温度下，液化气体所需 要的压力。要的压力。lSCF性质性质介于液体和气体之间介于液体和气体之间：l1)SCF密度接近于液体，溶解度高。密度接近于液体，溶解度高。l2)SCF粘度和扩散系数接近于气体，粘度和扩散系数接近于气体，l 传质扩散快传质扩散快。基本过程：基本过程：1）在）在SCF中，溶解度大的物质溶于其中，中，溶解度大的物质溶于其中，与不溶解或溶解度小的物质分开。与不溶解或溶解度小的物质分开。2）降低压力，使）降低压力，使SCF变为气态（密度降低），变为气态（密度降低），溶解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。溶解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。超临界流体萃取设备超临界流体萃取设备钢瓶中高纯液体钢瓶中高纯液体COCO2 2经高压泵，流入保持经高压泵，流入保持在一定温度（高于在一定温度（高于TcTc）下的萃取池。）下的萃取池。在萃取池中，可溶于在萃取池中，可溶于SCFSCF的溶质溶解在的溶质溶解在SCFSCF中，并随中，并随SCFSCF一起流出一起流出萃取池。萃取池。经阻尼器减压进入收经阻尼器减压进入收集器，多余的集器，多余的SCFSCF排空排空或循环使用。或循环使用。l 常用超临界液态常用超临界液态CO2作为萃取剂，作为萃取剂，l 因为：因为：l1）液体）液体CO2无毒无毒l2）临界温度（）临界温度（304.06K）接近常温）接近常温l3）临界压力（）临界压力（7.38MPa）较低）较低l4）操作安全）操作安全超临界超临界CO2萃取技术在生物、食品萃取技术在生物、食品等工业中的应用等工业中的应用原料名称原料名称 产物名称产物名称 原料名称原料名称 产物名称产物名称小麦胚芽小麦胚芽 胚芽油胚芽油 豆子豆子 豆油精炼油豆油精炼油啤酒花啤酒花 啤酒花精油啤酒花精油 茉莉花茉莉花 净油净油辣椒辣椒 辣椒红色素辣椒红色素 菊花根菊花根 除虫菊酯除虫菊酯当归当归 精油精油 紫草