细胞凋亡实验

细胞凋亡实验细胞凋亡实验凋亡凋亡(apoptosis)(apoptosis)：机体在正常生理或：机体在正常生理或病理状态下发生的一种自发的、程序化病理状态下发生的一种自发的、程序化的死亡过程。的死亡过程。坏死坏死（NecrosisNecrosis）：各种致病因子，干）：各种致病因子，干扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成细胞的意外死亡。细胞的意外死亡。一、细胞的死亡方式一、细胞的死亡方式二、细胞坏死与凋亡的比较 坏死坏死 凋亡凋亡 性质性质病理性、非特异性病理性、非特异性生理性或病理性，特异性生理性或病理性，特异性 诱导因素诱导因素强烈刺激，随机发生强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生较弱刺激，非随机发生 生化特点生化特点被动过程，无新蛋白质合成，不被动过程，无新蛋白质合成，不耗能耗能主动过程，有新蛋白质合成，耗主动过程，有新蛋白质合成，耗能能 DNA DNA电泳电泳 形态变化形态变化弥散性降解，电泳呈均一弥散性降解，电泳呈均一DNADNA片片状状细胞结构全面溶解、破坏、细胞细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀肿胀DNADNA片段化（片段化（180200 bp180200 bp），电），电泳呈泳呈“梯梯”状条带状条带胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩核固缩 炎症反应炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反溶酶体相对完整，局部无炎症反应应 凋亡小体凋亡小体无无有有 基因调控基因调控无无有有三、细胞凋亡的生理意义1.1.确保正常发育、生长确保正常发育、生长 如：指（趾）间隙的形成如：指（趾）间隙的形成2.2.维持内环境稳定维持内环境稳定 如：清除受损、突变或衰老的细胞如：清除受损、突变或衰老的细胞3.3.发挥防御功能发挥防御功能 如：使受到病毒感染的细胞凋亡如：使受到病毒感染的细胞凋亡细胞变圆细胞变圆微绒毛消失微绒毛消失胞质浓缩胞质浓缩空泡化空泡化凋亡小体凋亡小体 初期：初期：核染色质高度浓缩核染色质高度浓缩凝集在核周边凝集在核周边,边集边集细胞体积缩小细胞体积缩小中期：中期：胞膜内陷胞膜内陷出芽出芽浓缩核裂解浓缩核裂解膜自行分割膜自行分割后期：后期：邻近的上皮细胞、邻近的上皮细胞、M、瘤细胞等吞噬凋亡小体瘤细胞等吞噬凋亡小体四、凋亡时细胞的主要变化（一）形态学改变Normal Cell Apoptotic cell（二）、生化改变、DNADNA片段化主要特征片段化主要特征 2 2、内源性核酸内切酶（、内源性核酸内切酶（nase)nase)激活激活 3 3、凋亡蛋白酶（、凋亡蛋白酶（CaspasesCaspases）激活）激活 内源性核酸内切酶的作用H1核心颗粒核心颗粒连接区连接区180-200 bp内源性核酸内切酶ZnZn2+CaCa2+MgMg2+五、细胞凋亡的检测方法五、细胞凋亡的检测方法1、形态学检测（一）HE染色（凋亡细胞呈圆形，胞浆红染，细胞核染色质聚集成团块状）（二）透射电镜观察（三）荧光显微镜观察 透射电镜观察透射电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜 期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1）2 2、DNADNA片断化检测片断化检测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50300 kbp长的DNA大片段,或180200 bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成3 3、流式细胞仪检测、流式细胞仪检测 flow cytometerflow cytometer（一）PI 单染（二）Annexin/PI双染色（一）（一）PI PI 单染单染 荧荧光光染染料料PIPI（碘碘化化丙丙啶啶）是是一一种种可可对对DNADNA染染色色的的细细胞胞核核染染色色试试剂剂，常常用用于于细细胞胞凋凋亡亡检检测测，英英文文全全称称是是Propidium Propidium IodideIodide。它它是是一一种种溴溴化化乙乙啶啶的的类类似似物物，在在嵌嵌入入双双链链DNADNA后后释释放红色荧光。放红色荧光。细细胞胞凋凋亡亡之之初初，由由于于核核酸酸内内切切酶酶的的激激活活，将将DNADNA从从核核小小体体间间切切断断，产产生生游游离离寡寡核核苷苷酸酸片片段段。这这些些片片段段弥弥散散到到胞胞浆浆中中，但是细胞膜完整，不能离开细胞。但是细胞膜完整，不能离开细胞。乙乙醇醇固固定定，PBSPBS洗洗涤涤，使使细细胞胞膜膜通通透透性性增增加加，并并从从细细胞胞浆浆弥弥散出胞外。但是大分子散出胞外。但是大分子DNADNA在胞内，不能被抽提。在胞内，不能被抽提。判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。（检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死）AB（二）（二）Annexin/PIAnnexin/PI双染色双染色 原理：磷脂酰丝氨酸（原理：磷脂酰丝氨酸（PSPS）主要存在于细胞膜内侧，细胞凋）主要存在于细胞膜内侧，细胞凋亡时，它移向细胞外侧。可能是亡时，它移向细胞外侧。可能是PSPS膜内外转位酶的早期激活膜内外转位酶的早期激活有关。有关。AnnexinAnnexin是一种是一种CaCa2 2依赖磷脂结合蛋白，对依赖磷脂结合蛋白，对PSPS有高度有高度亲和性。亲和性。PS PS外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死细胞膜完整性受到破坏细胞膜完整性受到破坏,可用可用PIPI区分。区分。检测标准：早期凋亡细胞：Annexin-FITC(+)；PI(-)；坏死细胞和晚期凋亡继发性坏死细胞：Annexin-FITC(+)；PI(+)；机械性坏死及非特异性染色：Annexin-FITC(-)；PI(+)；正常细胞：Annexin-FITC(-)；PI(-)；C-myc ASO200nmol/L 凋亡结果凋亡结果坏死结果坏死结果4、线粒体膜势能的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。亲脂性阳离子荧光探针JC-1以单体形式存在，可发出绿色荧光（527 nm），若以多聚体形式存在，可发出红色荧光（590 nm）.JC-1可透过正常细胞膜以单体状态进入胞内，正常健康线粒体的膜电位（）具有极性，JC-1依赖于的极性被迅速摄入线粒体内，并形成多聚体，发出红色荧光（590 nm，线粒体）和绿色荧光（527 nm，胞液）.而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，线粒体内红光强度减弱（590 nm），以单体的形式存在于胞液内而发绿色荧光（527 nm）.因此在双色滤光片下观察，正常细胞为高绿高红，凋亡细胞为高绿低红.正常细胞为高绿高红，凋亡细胞为高绿低红.5 5、Caspase-3Caspase-3活性的检测活性的检测Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。Western blot 分析caspase-3的活化Caspase 3，6，7Caspase-3Caspase-3正常以酶原正常以酶原(32KD)(32KD)活化的活化的Caspase-3Caspase-3由两个大亚基由两个大亚基(17KD)(17KD)和两个小亚基和两个小亚基(12KD)(12KD)组成组成原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。荧光分光光度计分析活化Caspase-3谢谢！