组织学技术(特殊染色)

组织学技术组织学技术(特殊染色特殊染色)特殊染色用于显示标本中的一些结构，特殊染色用于显示标本中的一些结构，使其在显微镜下与其它组织或细胞区别使其在显微镜下与其它组织或细胞区别.特殊染色特殊染色单一特殊染色单一特殊染色复合特殊染色复合特殊染色一种染料对一种组织一种染料对一种组织结构或细胞进行染色结构或细胞进行染色多种染料对多种组多种染料对多种组织结构或细胞进行织结构或细胞进行染色染色糖原染色方法：糖原染色方法：糖原为细胞内的多糖或粘多糖，糖原为细胞内的多糖或粘多糖，肝细胞和肌细胞内的糖原最多。肝细胞和肌细胞内的糖原最多。糖原的多少，可以反映机体糖代谢的情况。糖原的多少，可以反映机体糖代谢的情况。例如：例如：先天性糖代谢紊乱先天性糖代谢紊乱-葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸酶缺乏、磷酸酶缺乏、淋巴肉瘤、间皮瘤、肾上腺瘤，肝细胞内淋巴肉瘤、间皮瘤、肾上腺瘤，肝细胞内都可聚集过多的糖原。都可聚集过多的糖原。过碘酸过碘酸-雪夫反应雪夫反应（periodic acid Schiff reaction，PAS)原理：原理：用过碘酸氧化多糖结构的碳键，用过碘酸氧化多糖结构的碳键，使其形成使其形成2-醛基，与无色的品红结合生成醛基，与无色的品红结合生成紫红色品红复合物，沉淀于细胞内糖原分布部位，紫红色品红复合物，沉淀于细胞内糖原分布部位，从而可证明从而可证明多糖或粘多糖的存在。多糖或粘多糖的存在。1、试剂配制、试剂配制（1）1%过碘酸水溶液：过碘酸水溶液：过碘酸过碘酸 1g 双蒸水双蒸水 100ml 将过碘酸溶于双蒸水中将过碘酸溶于双蒸水中（2）Schiff试剂：试剂：双蒸水双蒸水 200ml 碱性品红碱性品红 1g 1mol/L 盐酸盐酸 20ml 偏重亚硫酸钠偏重亚硫酸钠 2g（或亚硫酸氢钠）（或亚硫酸氢钠）活性炭活性炭 300mg 双蒸水煮沸后离火，慢慢加入品红，双蒸水煮沸后离火，慢慢加入品红，搅拌至完全溶解，冷却至搅拌至完全溶解，冷却至50时过滤，时过滤，加入盐酸，冷却至加入盐酸，冷却至25时加入偏重亚硫酸钠时加入偏重亚硫酸钠摇荡，密封置于暗处或摇荡，密封置于暗处或4冰箱内冰箱内24h。溶液呈草黄色时，加入活性炭摇荡溶液呈草黄色时，加入活性炭摇荡1min快速过滤。避光快速过滤。避光4保存备用。保存备用。(3)亚硫酸氢纳溶液亚硫酸氢纳溶液 10%偏重亚硫酸氢纳偏重亚硫酸氢纳 5ml 1mol/L盐酸盐酸 5ml 蒸馏水蒸馏水 90ml 用前配制用前配制(4)1mol/L盐酸盐酸 36%盐酸盐酸 85.6ml 蒸馏水蒸馏水 914.4ml2、染色步骤、染色步骤（1)切片入切片入1%过碘酸液过碘酸液 氧化氧化2-5 min。充分水洗后，过蒸馏水。充分水洗后，过蒸馏水。（2）入）入Schiff 液液10-20 min（室温（室温 暗处）暗处）（3）入亚硫酸氢纳液洗）入亚硫酸氢纳液洗3次每次次每次2min （去非特异性染色）流水冲洗（去非特异性染色）流水冲洗10min，过蒸馏水。过蒸馏水。（4)Mayer苏木精复染苏木精复染2-3min。流水冲洗，。流水冲洗，过蒸馏水，吸干。过蒸馏水，吸干。从从95%乙醇开始脱水、透明、封片。乙醇开始脱水、透明、封片。3、对照、对照用用1%淀粉糖化酶处理对照片淀粉糖化酶处理对照片20 min.或用唾液或用唾液（无气泡）消化对照片（无气泡）消化对照片30 min 2次。次。4、结果、结果细胞内糖原呈紫红色；对照片为阴性细胞内糖原呈紫红色；对照片为阴性5、注意事项：、注意事项：（1）糖原易溶于水，要用冷）糖原易溶于水，要用冷Carnoy液固定液固定（2）配制）配制Schiff试剂碱性品红杂质太多，试剂碱性品红杂质太多，或亚硫酸氢纳潮解，都不能使碱性品红脱色；或亚硫酸氢纳潮解，都不能使碱性品红脱色；盛盛Schiff试剂的瓶子不宜过大，以免试剂的瓶子不宜过大，以免SO2逸出；逸出；若若Schiff试剂变成粉红色即失效。试剂变成粉红色即失效。Carnoy固定液固定液:取纯乙醇、氯仿、冰醋酸，按取纯乙醇、氯仿、冰醋酸，按6:3:1的比例配制，的比例配制，现配现用。一般固定现配现用。一般固定1-2 h。固定后的组织块。固定后的组织块可直接入可直接入95%的乙醇脱水。的乙醇脱水。疏松结缔组织各种成分显示方法：疏松结缔组织各种成分显示方法：疏松结缔组织中含有：疏松结缔组织中含有：胶原纤维、弹性纤维、网状纤维；胶原纤维、弹性纤维、网状纤维；巨噬细胞、肥大细胞。巨噬细胞、肥大细胞。一、一、网状纤维网状纤维 分布：分布：肝、肾、脾、淋巴结肝、肾、脾、淋巴结等器官内。等器官内。纤维直径纤维直径0.2-2.0m，分支多，交织，分支多，交织成网。成网。网状纤维主要由网状纤维主要由型胶原蛋白组成，表型胶原蛋白组成，表面被覆糖蛋白，在镀银切片呈黑色称为面被覆糖蛋白，在镀银切片呈黑色称为嗜银纤维。嗜银纤维。Gomoris镀银法显示网状纤维镀银法显示网状纤维1、取材：、取材：淋巴结淋巴结2、试剂配制、试剂配制（1）硝酸银溶液：）硝酸银溶液：硝酸银硝酸银 10.2g，溶于，溶于100ml蒸馏水。蒸馏水。（2）氢氧化钠溶液：）氢氧化钠溶液：氢氧化钠氢氧化钠 3.1g，溶于，溶于100ml蒸馏水。蒸馏水。（3）银氨溶液的配置：）银氨溶液的配置：取取5ml 硝酸银硝酸银溶液，溶液，缓慢滴加缓慢滴加氨水氨水至溶液变得至溶液变得清亮清亮；再加入再加入5ml氢氧化钠氢氧化钠溶液，溶液，此时溶液此时溶液变黑色变黑色再滴加再滴加氨水氨水至溶液清亮后，至溶液清亮后，补加补加4滴氨水，加蒸馏水稀释至滴氨水，加蒸馏水稀释至100ml，保存于棕色瓶中备用。保存于棕色瓶中备用。（4）高锰酸钾溶液：高锰酸钾溶液：高锰酸钾高锰酸钾0.5g，蒸馏水蒸馏水95ml，3%硫酸硫酸5ml（5）氯化金溶液：氯化金溶液：氯化金氯化金 0.2g，蒸馏水蒸馏水100ml（6）草酸溶液：草酸溶液：草酸草酸2ml，蒸馏水，蒸馏水98ml（7）硫酸铁溶液：硫酸铁溶液：硫酸铁硫酸铁2g，蒸馏水蒸馏水100ml（8）甲醛溶液：甲醛溶液：甲醛甲醛20ml，蒸馏水蒸馏水80ml 3、染色程序、染色程序（1）新鲜组织）新鲜组织10%甲醛固定，石蜡切片，甲醛固定，石蜡切片，常规脱蜡入水；常规脱蜡入水；（2）入高锰酸钾溶液中）入高锰酸钾溶液中5min，水洗，水洗1min；（3）入草酸溶液中漂白）入草酸溶液中漂白2min，水洗，水洗2min；（4）硫酸铁中媒染）硫酸铁中媒染2min，水洗，水洗1min；（5）银氨溶液中处理）银氨溶液中处理1-5min（25），），蒸馏水洗蒸馏水洗2次，各次，各2min；（6）甲醛溶液中还原）甲醛溶液中还原5min，蒸馏水洗蒸馏水洗2次，各次，各2min；（7）氯化金溶中调色）氯化金溶中调色1-3min，蒸馏水洗，蒸馏水洗2次；次；（8）95%及无水乙醇脱水，及无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。二甲苯透明，中性树胶封片。4、结果、结果 淋巴结内可见黑色网状纤维，淋巴结内可见黑色网状纤维，粗细不等，交织成网。粗细不等，交织成网。5、注意事项、注意事项 配制氨银时氨液不可过多。配制氨银时氨液不可过多。二、弹性纤维二、弹性纤维 分布广泛，弹性纤维较细，直径分布广泛，弹性纤维较细，直径0.2-1.0m，交织成网。富有弹性，与胶原纤维交织在一起。交织成网。富有弹性，与胶原纤维交织在一起。弹性纤维核心部分由均质的弹性蛋白组成；弹性纤维核心部分由均质的弹性蛋白组成；外周覆盖微原纤维。外周覆盖微原纤维。在皮肤学和检测幼年机体组织中的弹性结构。在皮肤学和检测幼年机体组织中的弹性结构。常用的显示弹性纤维的染色有：常用的显示弹性纤维的染色有：地衣红染色、地衣红染色、Gomoris醛品红染色、醛品红染色、Weigert染色等。染色等。地衣红染色显示弹性纤维地衣红染色显示弹性纤维1、取材、取材 皮下组织皮下组织2、染液配制、染液配制地衣红染液：地衣红染液：地衣红地衣红0.1g，70%乙醇乙醇100ml，硝酸，硝酸2ml。3、染色程序、染色程序（1）石蜡切片脱蜡下行至）石蜡切片脱蜡下行至70%乙醇。乙醇。（2）地衣红染液，室温，）地衣红染液，室温，12h或过夜，或或过夜，或37,15-30min.（3）70%乙醇分色，必要时可用乙醇分色，必要时可用0.5%-1%盐酸乙醇分色，盐酸乙醇分色，去除胶原纤维颜色。去除胶原纤维颜色。（4）常规乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。）常规乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。4、结果、结果 弹性纤维为棕红色，背景淡棕色。弹性纤维为棕红色，背景淡棕色。三、胶原纤维三、胶原纤维胶原纤维，粗细不等，直径胶原纤维，粗细不等，直径0.5-10m，波浪，波浪状，有分支交织成网。胶原纤维由状，有分支交织成网。胶原纤维由型胶原蛋型胶原蛋白组成。胶原纤维对酸性染料的亲和力强，白组成。胶原纤维对酸性染料的亲和力强，如常用的如常用的酸性复红酸性复红及及苯胺蓝苯胺蓝等，对胶原纤维有等，对胶原纤维有选染性，而其它组织不易着色，从而有利于其选染性，而其它组织不易着色，从而有利于其他组织的复染。他组织的复染。显示胶原纤维的主要方法：显示胶原纤维的主要方法：如如van Gieson法、法、Mallory法、法、Masson法等。法等。Masson s三色染色法显示胶原纤维三色染色法显示胶原纤维1、取材：、取材：皮下组织或肠系膜铺片皮下组织或肠系膜铺片2、固定：、固定：ZenkerBouin 10%中性福尔马林缓冲液中性福尔马林缓冲液3、染液配制、染液配制（1）Weigert铁苏木精铁苏木精A液：液：苏木精苏木精 10g,95%乙醇乙醇100mlB液：液：29%三氯化铁水溶液三氯化铁水溶液 4ml 25%盐酸盐酸 1ml 蒸馏水蒸馏水 95ml用时甲乙两液等份混合，只能用数天。用时甲乙两液等份混合，只能用数天。（2）Masson 酸性复红染液：酸性复红染液：酸性复红酸性复红1g，冰醋酸，冰醋酸 1ml，蒸馏水，蒸馏水 99ml。（3）磷钼酸磷钼酸-磷钨酸水溶液：磷钨酸水溶液：磷钼酸磷钼酸 2.5g，磷钨酸，磷钨酸2.5g，蒸馏水，蒸馏水 100ml。（4）苯胺蓝染液：苯胺蓝染液：苯胺蓝苯胺蓝 2.5g，冰醋酸，冰醋酸 2ml，蒸馏水，蒸馏水 100ml。（5）1%醋酸水溶液：醋酸水溶液：冰醋酸冰醋酸 1ml，蒸馏水，蒸馏水 99ml。4、染色步骤、染色步骤（1）石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水。）石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水。（2）Weigert 铁苏木精染色，铁苏木精染色，10-20min。（3）流水冲洗，）流水冲洗，10min，光镜下查看。也可用，光镜下查看。也可用1%盐酸乙醇（盐酸乙醇（70%）分色。流水冲洗，）分色。流水冲洗，5min，蒸馏水浸洗。蒸馏水浸洗。（4）Masson 酸性复红染液，酸性复红染液，15min，蒸馏水洗。，蒸馏水洗。（5）磷钼酸）磷钼酸-磷钨酸水溶液分色，磷钨酸水溶液分色，10-15min，或至胶原纤维无红色。或至胶原纤维无红色。（6）苯胺蓝染液，）苯胺蓝染液，10-20min，蒸馏水洗。，蒸馏水洗。（7）1%醋酸水溶液分色，醋酸水溶液分色，3-5min。镜下查看分色程度。镜下查看分色程度。（8）95%乙醇脱水上行，二甲苯透明，树胶封固。乙醇脱水上行，二甲苯透明，树胶封固。5、结果：、结果：胶原纤维为蓝色；肌纤维为红色，细胞核为黑色。胶原纤维为蓝色；肌纤维为红色，细胞核为黑色。6、注意事项：、注意事项：标本为标本为10%福尔马林固定，切片染色前需用福尔马林固定，切片染色前需用Bouin再固定，再固定，56 固定固定1h，或室温过夜。，或室温过夜。伊红伊红-醛复红染色法醛复红染色法 同时显示胶原纤维和弹性纤维同时显示胶原纤维和弹性纤维 Gomori氏醛氏醛-复红染液是复红染液是Gomori在试验期间偶然在试验期间偶然发现的由发现的由碱性品红碱性品红、三聚乙醛三聚乙醛、浓盐酸浓盐酸配制而成。配制而成。一、试剂配制一、试剂配制Gomori醛醛-复红染液：复红染液：70%乙醇乙醇100ml，碱性品红，碱性品红0.5g，三聚乙醛三聚乙醛1ml，浓盐酸，浓盐酸1ml。注意：先将碱性品红溶于乙醇中，注意：先将碱性品红溶于乙醇中，然后加入三聚乙醛和浓盐酸，静置然后加入三聚乙醛和浓盐酸，静置1-2d，待溶液变为深紫色后，过滤置于冰箱待用。待溶液变为深紫色后，过滤置于冰箱待用。三、制作过程三、制作过程1、取皮下组织铺于干净的载玻片上，自然晾干。、取皮下组织铺于干净的载玻片上，自然晾干。2、放在甲醛、放在甲醛-乙醇固定液内固定乙醇固定液内固定5min；3、水洗、水洗3min；4、置于醛、置于醛-复红染液中，室温下染色复红染液中，室温下染色5min；5、水洗、水洗5min；6、置伊红染液中，染色、置伊红染液中，染色30s；7、常规脱水、透明、封片。、常规脱水、透明、封片。四、结果四、结果 胶原纤维为红色，长带状，波浪状走行；胶原纤维为红色，长带状，波浪状走行；弹性纤维为紫色，细丝状，直行，末端卷曲。弹性纤维为紫色，细丝状，直行，末端卷曲。二、取材二、取材 皮下组织皮下组织甲苯胺蓝染色显示肥大细胞甲苯胺蓝染色显示肥大细胞肥大细胞内含粗大的嗜碱性、异染性的水溶性颗粒，肥大细胞内含粗大的嗜碱性、异染性的水溶性颗粒，颗粒内含有组胺、肝素等活性物质，颗粒内含有组胺、肝素等活性物质，这些物质含有高分子的多硫酸脂和硫酸黏多糖类，能够与这些物质含有高分子的多硫酸脂和硫酸黏多糖类，能够与甲苯胺蓝、美篮、中性红、硫堇等染料结合。甲苯胺蓝、美篮、中性红、硫堇等染料结合。1、取材、取材 皮下组织皮下组织2、固定、固定 Carnoy液液 或或 10%中性福尔马林液中性福尔马林液 皮下组织铺于干净的载玻片上，自然晾干后固定，皮下组织铺于干净的载玻片上，自然晾干后固定，或石蜡切片，冰冻切片更好或石蜡切片，冰冻切片更好3、染液配制、染液配制甲苯胺蓝溶液：甲苯胺蓝甲苯胺蓝溶液：甲苯胺蓝0.2g 60%乙醇乙醇100ml 混匀即可反复使用。混匀即可反复使用。4、染色过程、染色过程（1）石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水；）石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水；（2）入甲苯胺蓝溶液染色，室温）入甲苯胺蓝溶液染色，室温10-30min；（3）蒸馏水洗；）蒸馏水洗；（4）丙酮或）丙酮或100%乙醇脱水两次，各乙醇脱水两次，各2min；（5）二甲苯透明，树胶封固。）二甲苯透明，树胶封固。5、结果、结果 肥大细胞颗粒呈紫色，核浅蓝色。肥大细胞颗粒呈紫色，核浅蓝色。胰岛内分泌细胞胰岛内分泌细胞Massons三色染色法三色染色法胰岛在胰尾部分布较多，胰岛细胞由胰岛在胰尾部分布较多，胰岛细胞由A、B、D、PP四种细胞组成，细胞间有丰富的毛细血管。四种细胞组成，细胞间有丰富的毛细血管。用用 Massons，Mallory 等特殊染色等特殊染色 方法可区别方法可区别A、B、D细胞。细胞。1、取材、取材 胰腺胰腺2、固定、固定 ZenkerBouin10%甲醛甲醛 3、染液配制、染液配制（1）丽春红酸性品红液：）丽春红酸性品红液：丽春红丽春红 0.7g，酸性品红，酸性品红0.4g，冰醋酸，冰醋酸 1ml，蒸馏水蒸馏水99ml，用用1%的冰醋酸的冰醋酸 溶解丽春红和酸性品红。溶解丽春红和酸性品红。（2）2%亮绿液：亮绿液：亮绿亮绿2g，冰醋酸，冰醋酸 2ml 蒸馏水蒸馏水98ml，用用2%冰醋酸溶解亮绿。冰醋酸溶解亮绿。4、染色程序、染色程序（1）切片脱蜡至水；）切片脱蜡至水；（2）入）入0.5%碘乙醇碘乙醇5-10min，自来水洗，蒸馏水洗；自来水洗，蒸馏水洗；（3）入）入0.5%硫代硫酸钠硫代硫酸钠3-5min；（4）Weigert 铁苏木精铁苏木精10-20min，自来水洗；，自来水洗；（5）1%盐酸乙醇分化，自来水洗蓝化；盐酸乙醇分化，自来水洗蓝化；（6）入丽春红酸性品红液）入丽春红酸性品红液3-5min，蒸馏水速洗；，蒸馏水速洗；（7）入）入1%磷酸钼水溶液磷酸钼水溶液5min；（8）倾去磷酸钼，直接用）倾去磷酸钼，直接用2%亮绿液染亮绿液染3-5min；（9）0.5%冰醋酸冲洗切片，将亮绿全部洗掉；冰醋酸冲洗切片，将亮绿全部洗掉；（10）95%乙醇，无水酒精脱水，乙醇，无水酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固。二甲苯透明，树胶封固。5、结果、结果 A 细胞染成红色，位于胰岛周边；细胞染成红色，位于胰岛周边；B细胞染成紫红色，位于胰岛中央；细胞染成紫红色，位于胰岛中央；D细胞染成绿色，位于细胞染成绿色，位于A 细胞与细胞与B细胞之间。细胞之间。6、注意、注意 用用10%甲醛固定，甲醛固定，再用重铬酸钾液处理，再用重铬酸钾液处理，也获得较好效果。也获得较好效果。甲绿甲绿-派若宁染色显示派若宁染色显示DNA和和RNA染色原理：甲绿和派若宁是碱性染料，染色原理：甲绿和派若宁是碱性染料，染色中甲绿染色中甲绿-派若宁染色与派若宁染色与 DNA和和RNA的聚合程度有关。的聚合程度有关。甲绿与聚合程度高的甲绿与聚合程度高的DNA亲和力较强；亲和力较强；派若宁与聚合程度低的派若宁与聚合程度低的RNA有亲和力。有亲和力。一、固定一、固定 ZenkerCarnoy(4)二、染液配制二、染液配制1、2%甲绿水溶液：甲绿水溶液：甲绿甲绿2g，蒸馏水，蒸馏水100ml甲绿提纯法：将甲绿溶解后，放入分液漏斗中，甲绿提纯法：将甲绿溶解后，放入分液漏斗中，加等量的纯氯仿洗，充分摇荡数分钟，静置，加等量的纯氯仿洗，充分摇荡数分钟，静置，待液体分层，放掉下层紫色氯仿液。按此法反复洗，待液体分层，放掉下层紫色氯仿液。按此法反复洗，直至洗不下紫色为止，需洗直至洗不下紫色为止，需洗5次左右。次左右。4保存。保存。2、2%派若宁水溶液：派若宁水溶液：派若宁派若宁 2g，蒸馏水，蒸馏水100ml此液提纯，应按甲绿方法进行。此液提纯，应按甲绿方法进行。3、醋酸缓冲液（、醋酸缓冲液（pH值值4.8）：）：0.2mol/L 醋酸醋酸 41ml，0.2mol/L醋酸钠醋酸钠 59ml。4、甲绿、甲绿-派若宁染液：派若宁染液：2%甲绿提纯液甲绿提纯液 7.5 ml，2%派若宁提纯液派若宁提纯液 12.5ml，醋酸缓冲液醋酸缓冲液 30ml。此液用前配制。此液用前配制。三、染色程序三、染色程序1、切片脱蜡入水；、切片脱蜡入水；2、切片入甲绿、切片入甲绿-派若宁染液派若宁染液5-10min；3、滤纸快速吸干，纯丙酮速洗分色；、滤纸快速吸干，纯丙酮速洗分色；4、丙酮二甲苯混合液（、丙酮二甲苯混合液（1:1）速洗）速洗2次次5、二甲苯透明，树胶封固。、二甲苯透明，树胶封固。四、染色结果四、染色结果 DNA呈蓝绿色，呈蓝绿色，RNA 呈红色。呈红色。苏木精苏木精本身不是染料，不能单独使用，本身不是染料，不能单独使用，因为对组织的亲和力很小。因为对组织的亲和力很小。苏木精必须氧化成苏木红才能染色，苏木精必须氧化成苏木红才能染色，常用的氧化剂如：氧化汞、过锰酸钾、常用的氧化剂如：氧化汞、过锰酸钾、碘酸钠、重铬酸钾。氧化的苏木精脱掉二个原子的氢。碘酸钠、重铬酸钾。氧化的苏木精脱掉二个原子的氢。也可用无水乙醇配成也可用无水乙醇配成10%干液，使其自然成熟。干液，使其自然成熟。氧化的苏木精为弱酸性，氧化的苏木精为弱酸性，pH为为6.5。氧化后的苏木精还必须加入电解质，如铁矾、銨矾、氧化后的苏木精还必须加入电解质，如铁矾、銨矾、钾矾等即变成带有强电荷的碱性染料。钾矾等即变成带有强电荷的碱性染料。Mayer 苏木精：苏木精：苏木精苏木精 1g 蒸馏水蒸馏水 1000ml 碘酸钠碘酸钠 0.2g 甲矾甲矾 50g加温溶解成紫蓝色，加水化氯醛加温溶解成紫蓝色，加水化氯醛50g及枸橼酸及枸橼酸1g，溶液变成，溶液变成红紫色，可长久保存。红紫色，可长久保存。内弹性膜内弹性膜内内膜膜中中膜膜外外膜膜大动脉和大静脉比较大动脉和大静脉比较1.1.内膜内膜 2.2.中膜中膜 3.3.外膜外膜 1.1.内膜内膜 2.2.中膜中膜 3.3.外膜外膜结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！53