2011春第十一章DNA合成

生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室 Biochemistry BiochemistryDepartmentofBiochemistry&MolecularBiology燕燕秋秋第十一章第十一章 DNA的生物合成的生物合成(DNABiosynthesis)1953年年WatsonWatson&Crick&Crick提出提出DNADNA双螺旋结构模型。双螺旋结构模型。1958年年CrickCrick提出了提出了“中心法则中心法则”,揭示了遗传信息的传递规律。揭示了遗传信息的传递规律。Reversetranscription中心法则中心法则(CentralDogma)Replication贮存遗传信息贮存遗传信息直接模板直接模板有有功能的产物功能的产物复制复制转录转录翻译翻译 1868年年Miescher从脓细胞从脓细胞细胞核细胞核中提取到中提取到“核素核素”1944年年Avery证实证实DNA是遗传物质是遗传物质 1953年年Watson和和Crick提出提出DNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型 1965年年Nirenberg确定遗传密码表确定遗传密码表 1975年年Temin和和Baltimore发现逆转录酶发现逆转录酶 1981年年Gilbert和和Sanger建立建立DNA序列测定方法序列测定方法 1985年年Mullis发明发明PCR技术技术 1990年年美国启动人类基因组计划美国启动人类基因组计划 2001年年绘制绘制人类基因组草图人类基因组草图有关核酸研究的重大进展有关核酸研究的重大进展第三篇第三篇遗传信息的传递遗传信息的传递第十一章第十一章 DNA DNA 的生物合成的生物合成第十二章第十二章 RNA RNA 的生物合成的生物合成第十三章第十三章 蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成第十二章第十二章DNA的生物合成的生物合成第一节第一节DNA复制的一般规律复制的一般规律一、一、DNA的半保留复制的半保留复制二、二、DNA的双向复制的双向复制三、三、DNA的半不连续复制的半不连续复制四、四、DNA复制需引物复制需引物五、五、DNA复制的高保真性复制的高保真性第二节参与真核生物第二节参与真核生物DNA复制的有关酶类及蛋白因子复制的有关酶类及蛋白因子第三节第三节真核生物真核生物DNA的复制过程的复制过程一、一、DNA复制的起始复制的起始二、二、DNA链的延伸链的延伸三、三、DNA复制的终止的合成复制的终止的合成四、端粒四、端粒DNA的合成的合成第四节第四节原核生物原核生物DNA的复制过程的复制过程一、参与原核生物一、参与原核生物DNA复制的酶类及蛋白因子复制的酶类及蛋白因子二、原核生物二、原核生物DNA的复制过程的复制过程第五节第五节反转录过程及其他方式的复制反转录过程及其他方式的复制一、反转录过程一、反转录过程二、线粒体二、线粒体DNA的复制的复制三、噬菌体三、噬菌体DNA的滚环复制的滚环复制第六节第六节DNA的损伤和修复的损伤和修复一、基因突变一、基因突变二、二、DNA损伤的修复损伤的修复学习策略：学习策略：基本概念基本概念对比真核与原核生物复制的特点对比真核与原核生物复制的特点第一节第一节DNADNA复制的一般规律复制的一般规律General Survey of DNA General Survey of DNA ReplicationReplication真核细胞真核细胞DNA复制的时期复制的时期-S期期G G1 1期（期（DNADNA合成前期）、合成前期）、S S期（期（DNADNA合成期）合成期）、G G2 2期（期（DNADNA合成合成后期）、后期）、M M期（有丝分裂期）。期（有丝分裂期）。S S期：细胞内的期：细胞内的dNTPdNTP含量和含量和DNADNA聚合酶活性聚合酶活性，以及以及DNADNA合成速度合成速度均达高峰。均达高峰。19571957年年Matthew Matthew MeselsonMeselson和和Franklin Franklin StahlStahl证明了证明了DNADNA的半保留复制方式。的半保留复制方式。一、一、DNA的半保留复制的半保留复制半保留复制的实验依据半保留复制的实验依据1.1.同位素标记技术：同位素标记技术：1515，1414NHNH4 4ClCl3.DNA3.DNA分离技分离技术术4.4.密度梯度离心技术：密度梯度离心技术：1515NHNH4 4ClCl 1414NHNH4 4ClCl2.2.细菌培养技术细菌培养技术实验结果实验结果：（semi-conservativereplication）:DNADNA复制过程中，两条多核苷酸链复制过程中，两条多核苷酸链之间的之间的氢键断裂氢键断裂，以每条链各作为，以每条链各作为模模板板合成新的互补链。这样新形成的两合成新的互补链。这样新形成的两个个子代子代DNADNA分子分子与与原来原来DNADNA分子分子的的碱基碱基顺序完全一样顺序完全一样。每个子代分子的。每个子代分子的一条一条链来自亲代链来自亲代DNADNA。另一条链则是新合另一条链则是新合成的成的，这种复制方式称为半保留复制。，这种复制方式称为半保留复制。半保留复制半保留复制1.两条链在两条链在局部解开局部解开,以利于复制。以利于复制。2.局部解旋引起周围区域过度缠绕局部解旋引起周围区域过度缠绕,需要需要拓朴异构拓朴异构酶酶解旋及解链。解旋及解链。3.DNA聚合酶聚合酶以以5到到3方向合成。一条链的合成方向合成。一条链的合成是连续的，而另一条链的合成则是不连续的。是连续的，而另一条链的合成则是不连续的。4.DNA复制的复制的“高保真高保真”性，性，校正校正机制保证正确性。机制保证正确性。5.DNA的合成迅速，有许多的合成迅速，有许多酶及蛋白因子酶及蛋白因子。6.复制器本身不能复制线性复制器本身不能复制线性DNA的末端，的末端，端粒酶端粒酶参参与端粒的复制。与端粒的复制。DNA复制的一般特点复制的一般特点二、二、DNA的双向复制的双向复制（一）（一）DNA复制起始过程复制起始过程 复制是在特殊的位置上开始的，此位置称复制是在特殊的位置上开始的，此位置称复复制起始点制起始点（origins of replication,origins of replication,oriori）。）。真核生物有多个复制起始点。真核生物有多个复制起始点。每个复制点的形状象一个叉子，故称为每个复制点的形状象一个叉子，故称为复制复制叉叉(replication fork)(replication fork)。真核基因组真核基因组由多个染色体组成，每个染色体有由多个染色体组成，每个染色体有多个复制起点多个复制起点，形成，形成多个复制叉多个复制叉。两个相邻复制。两个相邻复制起点之间的距离为一个复制子起点之间的距离为一个复制子(replicon)。104-105bp。细菌基因组细菌基因组为环状为环状DNADNA，只有一个复制起点，但，只有一个复制起点，但 DNADNA从复制起点向两个方向解链，形成两个复制叉，从复制起点向两个方向解链，形成两个复制叉，称为称为双向复制双向复制 (bidirectional replication)(bidirectional replication)。细菌质粒细菌质粒DNADNA和病毒和病毒DNADNA的复制为单向复制。的复制为单向复制。(unidirectional replication)(unidirectional replication)。三、三、DNADNA的半不连续复制的半不连续复制3 5 3 5 解链方向解链方向35335前导链（领头链）前导链（领头链）(leadingstrand)后随链（随从链）后随链（随从链）(laggingstrand)四、四、DNA复制需引物复制需引物RNA引物。五、五、DNA复制的高保真性复制的高保真性proofreading(校正)第二节参与真核生物第二节参与真核生物DNA复制复制的有关酶类及蛋白因子的有关酶类及蛋白因子表表11-1真核生物真核生物DNA复制的两种主要聚合酶及有关因子复制的两种主要聚合酶及有关因子一、一、DNA聚合酶（聚合酶（DNApolymerase）dNTPdNTP为底物，为底物，DNADNA为模板为模板,催化脱氧多核苷酸链在催化脱氧多核苷酸链在3-OH3-OH端端与另一个脱氧核苷三磷酸的与另一个脱氧核苷三磷酸的5-5-磷酸磷酸生成生成磷酸二酯键，从而延长多核苷酸链。又称为磷酸二酯键，从而延长多核苷酸链。又称为DNADNA指导指导的的DNADNA聚合酶（聚合酶（DNA-directed DNA polymerase,DDDPDNA-directed DNA polymerase,DDDP）。需需MgMg2+2+。方向：方向：5353。(dNMP)ndNMP)n+dNTPdNTP (dNMP)n+1+(dNMP)n+1+PPiPPi5-磷酸二酯键磷酸二酯键方向方向：5真核生物的真核生物的DNA聚合酶的分类及功能聚合酶的分类及功能表表11-2真核真核细胞胞DNA聚合聚合酶酶的分的分类及功能及功能酶酶的名称的名称功能功能Pol引物合成及后随引物合成及后随链部分合成部分合成Pol碱基切除修复碱基切除修复Pol线粒体粒体DNA复制复制Pol主要复制主要复制酶酶Pol不清楚，复制或修复不清楚，复制或修复Pol损伤旁路修复旁路修复Pol损伤旁路修复旁路修复Pol损伤旁路修复旁路修复表表12-3真核生物的真核生物的DNA聚合酶的性质聚合酶的性质 DNA聚合酶聚合酶蛋白质分子量（蛋白质分子量（K）2503638160300170256细胞定位细胞定位核核核核线粒体线粒体核核核核相关连酶的活性相关连酶的活性35外切酶外切酶无无无无有有有有有有引物酶引物酶有有无无无无无无无无35 核酸外切核酸外切酶酶 能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。DNADNA复制复制的的高保真性高保真性 DNADNA复制过程是一个高度精确的过程，保证复制忠实复制过程是一个高度精确的过程，保证复制忠实性的原因主要有以下三点性的原因主要有以下三点:严格遵循碱基互补配对原则严格遵循碱基互补配对原则 DNADNA聚合酶在复制过程中对碱基的选择功能聚合酶在复制过程中对碱基的选择功能复制出错时的即时校读功能复制出错时的即时校读功能遗传和变异遗传和变异53 核酸外切核酸外切酶活性酶活性 5 5 3 3 外切酶活性外切酶活性,能切除突变的能切除突变的 DNADNA片片段。段。二、引发酶（二、引发酶（primerase）又称又称引物酶引物酶。在。在DNADNA复制过程中，需要合成一复制过程中，需要合成一小段小段RNARNA引物（引物（primerprimer）。）。RNARNA引物的碱基与引物的碱基与DNADNA模模板互补，并为板互补，并为DNADNA的合成提供游离的的合成提供游离的3-OH3-OH末端。末端。335DNA单链模板单链模板A T G G C T A T T G A A U A C C G AOHpppOHT5 3RNA引物引物三、拓扑异构酶三、拓扑异构酶（topoisomerase）作用：切断并连接作用：切断并连接DNADNA双链中的一股或双股，改变双链中的一股或双股，改变 DNADNA分子拓扑构象，避免分子拓扑构象，避免DNADNA分子打结、缠绕、分子打结、缠绕、连环，在复制的全程中都起作用。连环，在复制的全程中都起作用。类型：拓扑异构酶类型：拓扑异构酶I I：切断：切断DNADNA双链中一股并再连接双链中一股并再连接 断端，反应不需断端，反应不需ATPATP供能；供能；拓扑异构酶拓扑异构酶IIII：使：使DNADNA双链同时发生断裂和再双链同时发生断裂和再 连接，需连接，需ATPATP供能。供能。举例：抗肿瘤药物的靶点举例：抗肿瘤药物的靶点 四、解（螺）旋酶四、解（螺）旋酶（helicase）解开解开DNADNA双螺旋，其作用是在复制叉前解开一小段双螺旋，其作用是在复制叉前解开一小段DNADNA。五、单链五、单链DNA结合蛋白结合蛋白（single-strandDNAbindingprotein,SSB）作用：结合单链。作用：结合单链。维持模板的单链状态维持模板的单链状态,并保护模板不受核酸酶的并保护模板不受核酸酶的降解。降解。真核生物中的真核生物中的DNADNA单链结合蛋白是复制蛋白单链结合蛋白是复制蛋白A A （replication protein A,RPAreplication protein A,RPA）。）。A.A.一种夹子载体蛋白（一种夹子载体蛋白（RFC,RFC,复制因子复制因子C C）与）与DNADNA结合。结合。B.B.夹子载体与夹子载体与PCNAPCNA装配成滑动夹子。装配成滑动夹子。C.C.DNA DNA聚合酶与滑动夹子相结合，开始沿模板前进。聚合酶与滑动夹子相结合，开始沿模板前进。D.D.PCNAPCNA的结构，的结构，PCNAPCNA的三个亚基形成一个环，的三个亚基形成一个环，DNADNA从大孔从大孔中间自由通过。中间自由通过。滑滑动动夹夹子子六、复制因子六、复制因子C（replicationfactorC,RFC）作用：作用：RFCRFC协助协助滑动夹子的装配。滑动夹子的装配。是是DNADNA聚合酶聚合酶和和之间的连系物或纽带，之间的连系物或纽带，有助于前导链和后随链的同时合成。有助于前导链和后随链的同时合成。七、增殖细胞核抗原七、增殖细胞核抗原（Proliferatingcellnuclearantigen,PCNA）作用：作用：PCNAPCNA是是DNADNA聚聚合合酶酶的的辅辅助助蛋蛋白白质质，三三个个亚亚基基绕绕着着DNADNA形形成成一一个个滑滑动动夹夹子子（sliding sliding clampclamp）,DNADNA聚聚合合酶酶附附着着于于滑滑动动夹夹子子上上，沿沿DNADNA模模板板链不断前进。链不断前进。八、核酸酶八、核酸酶H和侧翼内切核酸酶和侧翼内切核酸酶（RNaseH&flapendonuclease1,FEN1）作用：去除作用：去除RNARNA引物。引物。核核酸酸酶酶H H降降解解RNARNA引引物物，留留下下一一个个核核苷苷酸酸连连在在冈冈崎崎片片段段的的末末端端,由由FEN1FEN1完完成成去去除除最最后后一一个个核苷酸。核苷酸。九、九、DNA连接酶（连接酶（DNAligase）作用：作用：催化催化 DNADNA链的缺链的缺口间形成口间形成3,5-3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键。HO5335DNA连接酶连接酶5353POO-O-OPOOO-O三种形成磷酸二酯键的酶的异同三种形成磷酸二酯键的酶的异同 酶酶作用作用结果结果DNA聚合酶聚合酶延长新合成的链延长新合成的链延长新链延长新链DNA连接酶连接酶复制中不连续的单链缺口复制中不连续的单链缺口使不连续的链变使不连续的链变之间的连接之间的连接为连续为连续DNA拓扑异构酶拓扑异构酶切断、连接整理后的单或双链切断、连接整理后的单或双链改变拓扑状态改变拓扑状态复制蛋白复制蛋白A（RPA）后随链模板聚合酶聚合酶/引发酶引发酶ABCDEFGPCNA复制因子复制因子C（RCF）聚合酶聚合酶 RNA引物RNaseH/FEN1冈崎片段参与真参与真核核DNA复制的部分酶及蛋白因子复制的部分酶及蛋白因子A：RPA,一一种种单单链链DNA结结合合蛋蛋白白，结结合合到到单链模板上，使连续的复制叉解开双链。单链模板上，使连续的复制叉解开双链。B：在聚合酶在聚合酶/引发酶复合物作用下开始合成引发酶复合物作用下开始合成RNA引物。引物。C：引物合成达到引物合成达到10个核苷酸后，复合物的聚个核苷酸后，复合物的聚合酶合酶 活性起作用，合成活性起作用，合成15-30个脱氧核苷酸个脱氧核苷酸以延长引物。然后，聚合酶以延长引物。然后，聚合酶/引发酶复合物引发酶复合物从模板上解离。从模板上解离。D：RFC结结合合到到这这个个部部分分的的冈冈崎崎片片段段的的末末端，催化装配由端，催化装配由PCNA构成的滑动夹子。构成的滑动夹子。E：聚聚合合酶酶复复合合物物结结合合到到滑滑动动夹夹子子上上，并并延长冈崎片段。延长冈崎片段。F：当复制复合物达到当复制复合物达到RNA引物时，引物被引物时，引物被RNaseH和和FENI共同作用下水解。共同作用下水解。G：留下的间隙由连续延长的冈崎片段所填留下的间隙由连续延长的冈崎片段所填补。补。存在的缺口由存在的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。引物引物第三节第三节真核生物真核生物DNA的复制过程的复制过程DNASyntheticProcessinEukaryote 底物：底物：dNTPdNTP,N=A,T,C,G,N=A,T,C,G 模板：模板：DNADNA单链单链 引物：引物：RNARNA或延长中的或延长中的DNADNA子链，提供子链，提供 3 3-OH-OH末端使末端使dNTPdNTP可以依次聚合可以依次聚合 酶和蛋白质因子：酶和蛋白质因子：DNA复制体系复制体系参与真核生物参与真核生物DNA复制的酶类及蛋白因子复制的酶类及蛋白因子 DNADNA聚合酶聚合酶 (DNA(DNA polymetasespolymetases)引发酶引发酶(primaseprimase)拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomerasetopoisomerase）DNADNA解螺旋酶解螺旋酶(DNA(DNA helicasehelicase)复制蛋白复制蛋白A A（RPARPA）DNADNA连接酶（连接酶（DNA DNA ligaseligase）增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（PCNAPCNA）复制因子复制因子C C（RFCRFC）核酸酶核酸酶H H（RNaseRNase）、核侧翼内切核酸酶（）、核侧翼内切核酸酶（FEN1FEN1）参与真核生物参与真核生物DNA复制酶类及蛋白因子复制酶类及蛋白因子一、真核生物一、真核生物DNA复制过程复制过程（一）（一）DNA复制起始过程复制起始过程 复制是在特殊的位置上开始的，此位置称复制是在特殊的位置上开始的，此位置称复复制起始点制起始点（origins of replication,origins of replication,oriori）。）。真核生物有多个复制起始点。真核生物有多个复制起始点。每个复制点的形状象一个叉子，故称为每个复制点的形状象一个叉子，故称为复制复制叉叉(replication fork)(replication fork)。真核真核基因组由多个染色体组成，每个染色体有基因组由多个染色体组成，每个染色体有多个复制起点多个复制起点，形成，形成多个复制叉多个复制叉。两个相邻复制。两个相邻复制起点之间的距离为一个复制子起点之间的距离为一个复制子(replicon)。细菌基因组为环状细菌基因组为环状 DNADNA，只有一个复制起点，但只有一个复制起点，但 DNA DNA 从复制起点向两个方向解链，形成两个复制叉，称从复制起点向两个方向解链，形成两个复制叉，称为为双向复制双向复制 (bidirectional replication)(bidirectional replication)。细菌质粒细菌质粒 DNA DNA 和病毒和病毒 DNA DNA 的复制为单向复制的复制为单向复制 。(unidirectional replication)(unidirectional replication)。图图11-9真核生物真核生物DNA复制的起始复制的起始A：起始辩认复合物（：起始辩认复合物（ORC）结合到起始位点上。）结合到起始位点上。B：小核染色体维系蛋白：小核染色体维系蛋白（MCM）结合到上面。）结合到上面。C：在细胞周期的调节信号作用下，起始复合物被激活，：在细胞周期的调节信号作用下，起始复合物被激活，解旋酶的活性打开亲代双链，形成一个复制小泡。解旋酶的活性打开亲代双链，形成一个复制小泡。RPA结合到暴露的单链上。解结合到暴露的单链上。解旋酶附着于旋酶附着于DNA上，小泡被扩大。上，小泡被扩大。D：聚合酶：聚合酶/引发酶引发酶复合物合成第一个复合物合成第一个RNA引引物和短的物和短的DNA。E：RNA引物被聚合酶引物被聚合酶延长，脱氧核苷酸参入。延长，脱氧核苷酸参入。（二）（二）RNA引物的合成引物的合成 引发酶引发酶与与DNADNA聚合酶聚合酶形成一个复合体，识形成一个复合体，识别起始位点，以底物（别起始位点，以底物（NTPNTP），），DNADNA为模板，合成为模板，合成一个一个短链短链RNARNA（8 81010个核苷酸）引物。个核苷酸）引物。RNARNA引物引物的的3-OH3-OH末端为合成新的末端为合成新的DNADNA单链的起点。单链的起点。DNADNA聚合酶聚合酶，以，以dNTPdNTP为原料，延长引物大约为原料，延长引物大约15-3015-30个个DNADNA。这种双反应使短的。这种双反应使短的DNADNA连接到引物上。连接到引物上。DNADNA聚合酶需要引物。聚合酶需要引物。前导链前导链在复制的开始只需一在复制的开始只需一个引物，而个引物，而后随链后随链中每个冈崎片段则需有各自的中每个冈崎片段则需有各自的引物。引物。3 5 3 5 解链方向解链方向35335前导链（领头链）前导链（领头链）(leadingstrand)后随链（随从链）后随链（随从链）(laggingstrand)复制方向：复制方向：复制叉移动方向复制叉移动方向二、二、DNA链的延伸链的延伸（一）（一）DNA片段的生成片段的生成顺着解链方向生成的子链为前导链，其合成是连续进行的。顺着解链方向生成的子链为前导链，其合成是连续进行的。复制方向与解链方向相反的子链为后复制方向与解链方向相反的子链为后随链随链 ，其合成是不，其合成是不连续的。连续的。半不连续复制半不连续复制（semi-discontinuousreplication）DNADNA复制时，以母链为模板合成的子链中，其复制时，以母链为模板合成的子链中，其延延长方向长方向与与复制叉复制叉方向一致，称方向一致，称前导链前导链（leading leading strandstrand），它是连），它是连续合成续合成的；而其延长方向与复制的；而其延长方向与复制叉方向相反的链称后随链叉方向相反的链称后随链(lagging strand)(lagging strand)，是不，是不连续合成的。连续合成的。DNADNA这一复制过程又称半不连续复制。这一复制过程又称半不连续复制。冈崎片段冈崎片段（Okazakifragment）1968年，冈崎冈崎(Reiji Okazaki)(Reiji Okazaki)等人用等人用3 3H-H-胸胸腺嘧啶核苷酸培养大肠杆菌，然后用密度梯度离腺嘧啶核苷酸培养大肠杆菌，然后用密度梯度离心法分离标记的心法分离标记的DNADNA产物，发现短时间内首先合成产物，发现短时间内首先合成的是较短的的是较短的DNADNA片段，接着再出现较大的分子。这片段，接着再出现较大的分子。这说明这条新链是一段一段地、不连续合成的。这说明这条新链是一段一段地、不连续合成的。这些些DNADNA片段称冈崎片段。片段称冈崎片段。复制方向与解链复制方向与解链(复制叉移动方向复制叉移动方向)方向相反方向相反的子链为后的子链为后随链随链，其合成是不连续的。，其合成是不连续的。（二）（二）RNA引物的水解引物的水解一定长度的一定长度的DNADNA片段形成后，在片段形成后，在核酸酶核酸酶和和FEN I FEN I 的作用下，水解除去的作用下，水解除去RNARNA引物。出引物。出现的缺口由现的缺口由DNADNA聚合酶聚合酶催化催化DNADNA片段继续片段继续延长加以填补。延长加以填补。（三）（三）DNA大分子的形成大分子的形成-终止终止 DNADNA连接酶将后随链相邻的两个连接酶将后随链相邻的两个DNADNA片段片段连接起来，形成大分子连接起来，形成大分子DNADNA链。链。端粒（端粒（telomeretelomere）是染色体是染色体3-3-末端末端的结构，富含鸟嘌呤脱氧核苷酸特殊重复顺序及相的结构，富含鸟嘌呤脱氧核苷酸特殊重复顺序及相关蛋白质组成的复合体。端粒维持染色体结构的稳关蛋白质组成的复合体。端粒维持染色体结构的稳定，避免定，避免DNADNA分子重组及衰老有关。分子重组及衰老有关。端粒酶（端粒酶（telomerasetelomerase）是催化端粒合成的酶。是催化端粒合成的酶。端粒酶由端粒酶由蛋白质及蛋白质及RNARNA组成，具有逆转录酶的活性，组成，具有逆转录酶的活性，它能以自身携带的它能以自身携带的RNARNA为模板，逆转录合成端粒为模板，逆转录合成端粒DNADNA。端粒酶使端粒的端粒酶使端粒的3 3 末端延长，防止子代末端延长，防止子代DNADNA端粒端粒的缩短的缩短。人端粒重复顺序：人端粒重复顺序：TTAGGGTTAGGG 四膜虫端粒重复顺序：四膜虫端粒重复顺序：TTGGGGTTGGGG四、端粒的合成四、端粒的合成端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬爬行行模模型型结合结合:端粒端粒DNADNA与端粒酶与端粒酶RNARNA互互补结合补结合聚合聚合:以端粒酶以端粒酶RNARNA为为模板模板,在在端粒端粒DNA3DNA3 聚合聚合延长延长移位移位:端粒酶移端粒酶移动到动到3 3 端端,端粒端粒DNADNA与端粒酶与端粒酶RNARNA重新结合重新结合PCR是利用热稳定是利用热稳定DNA聚合酶在体外快速聚合酶在体外快速扩增扩增(复制复制)某一特定某一特定DNA片段的方法。片段的方法。PCRKaryB.Mullis1983发明发明PCR技术技术1993获得诺贝尔化学奖获得诺贝尔化学奖美国美国Yellowstone公园公园嗜热水生细菌嗜热水生细菌Thermus aquaticus PCR过程过程1.模板变性模板变性(Denaturation)双链双链DNA模板在模板在95 C变变性性为单链为单链DNA。2.引物退火引物退火(Annealing)引物与单链引物与单链DNA互补并互补并退火。退火。3.延伸反应延伸反应(Extention)耐热的耐热的DNA聚合酶催化聚合酶催化子链的合成子链的合成。缓冲液缓冲液(Tris-HCl,KCl)MgCl2或或MgSO4DNA模板模板上游引物上游引物(upstreamprimer,senseprimer)下游引物下游引物(downstreamprimer,antisenseprimer)底物底物dNTPs热稳定热稳定 DNA聚合酶聚合酶PCR反应体系反应体系第四节第四节原核生物的原核生物的DNADNA复制过程复制过程DNA Synthetic Process in DNA Synthetic Process in ProkaryotesProkaryotesE.Coli genometerminationpoint(ter)at32minute.replicationorigin8232replicationterminatorReplicationorigin(oriC)at82minute(100minutes,eachminute40000bp一、参与原核生物一、参与原核生物DNA复制的酶类及蛋白因子复制的酶类及蛋白因子表表11-3细菌与真核生物具有相似功能组分的比较细菌与真核生物具有相似功能组分的比较1.主要复制酶主要复制酶原核：原核：DNA聚合酶聚合酶III（真核：（真核：DNA聚合酶聚合酶）2.DNA聚合酶聚合酶I切除引物、填补空隙切除引物、填补空隙2.1.原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶主要复制主要复制酶酶DNA损伤的损伤的修复修复切除引物、切除引物、填补空隙填补空隙功能功能2040400分子数分子数/细胞细胞1011亚基数亚基数-+5 外切酶活性外切酶活性+5 外切酶活性外切酶活性+5 聚合酶活性聚合酶活性polIIIpolIIpolI140120109分子量（分子量（kb）功能：功能：原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。（1）DNA-polDNADNA聚合酶聚合酶 两个两个 亚基夹住亚基夹住DNADNA 核心酶核心酶聚合聚合校读校读滑动滑动夹子夹子大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶III同时催化同时催化DNA两条链的复制两条链的复制两个聚合酶两个聚合酶IIIIII结合在一起，后随链形成环。结合在一起，后随链形成环。两条链在一个位置上合成。两条链在一个位置上合成。图图11-16功能功能：切除引物、填补空隙。切除引物、填补空隙。具有具有RNARNA酶酶 H,FEN 1H,FEN 1功能。功能。（2）DNA-pol（109kD）50aaDNA323aa604aa大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow大片段大片段KlenowKlenow 片段是片段是 E.coliE.coli DNA DNA 聚合酶聚合酶 I I 的羧基的羧基端片段，长度为全酶的端片段，长度为全酶的 7070。5 5 3 3 聚合酶活性聚合酶活性 3 3 5 5 外切酶活性外切酶活性蛋白酶酶切位点蛋白酶酶切位点Klenow片段片段36kDa53外切酶活性外切酶活性323个氨基酸个氨基酸76kDa53聚合酶活性聚合酶活性35外切酶活性外切酶活性604个氨基酸个氨基酸木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶NC真核和原核细胞真核和原核细胞DNA复制的相同点复制的相同点 半保留复制半保留复制 半不连续复制半不连续复制 有复制起始点有复制起始点 新链合成方向是新链合成方向是5-35-3 需要需要DNADNA聚合酶聚合酶 复制过程可分为起始延长终止三步复制过程可分为起始延长终止三步真核和原核细胞真核和原核细胞DNA复制的不同点复制的不同点约约50nt/s约约10000nt/s二、原核生物二、原核生物DNA的复制过程的复制过程（一）复制的起始（一）复制的起始E.colireplicationorigin,oriCoriC245bp1.复制起始点复制起始点-DNA上的特异重复序列上的特异重复序列DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 引发体（引发体（primosomeprimosome）：）：解螺旋酶解螺旋酶 （DnaBDnaB）、）、DnaCDnaC蛋白、引物酶（蛋白、引物酶（DnaGDnaG）和）和DNADNA复制起始区域的复合结构。复制起始区域的复合结构。DnaG辨认起始点辨认起始点解链方向解链方向二、原核生物二、原核生物DNA的复制过程的复制过程（一）复制的起始（一）复制的起始（二）（二）DNA片段的延长片段的延长 在在DNA-DNA-polpol催化下，以催化下，以dNMPdNMP的方式逐个加入引物或的方式逐个加入引物或延长中的子链上，本质是磷酸二酯键的不断生成。延长中的子链上，本质是磷酸二酯键的不断生成。酶：酶：DNA-DNA-polpol III III核心酶（核心酶（、）催化磷酸二）催化磷酸二酯键形成，酯键形成，2 2个个亚基构成环形的滑动夹子，亚基构成环形的滑动夹子，亚基将亚基将滑动夹子组装到滑动夹子组装到DNADNA上。上。原料：四种原料：四种dNTPdNTP方向：方向：5 5 3 3（半不连续复制，冈崎片段的合成）（半不连续复制，冈崎片段的合成）（三）（三）DNA复制的终止复制的终止图12-12 原核生物DNA复制前导链在聚合酶前导链在聚合酶IIIIII与滑动夹子结合，连续合成。与滑动夹子结合，连续合成。后随链合成不连续：解旋酶（后随链合成不连续：解旋酶（DnaBDnaB）和引物酶）和引物酶（DnaGDnaG）沿着模板移动。每）沿着模板移动。每1000-2000bp1000-2000bp合成一个引合成一个引物。聚合酶物。聚合酶IIIIII延伸引物，达前一个冈崎片段。聚合延伸引物，达前一个冈崎片段。聚合酶酶I I去去RNARNA引物，并填补空隙。缺口由连接酶封闭。引物，并填补空隙。缺口由连接酶封闭。图图11-19PolLigasePol35DnaGPolPrimer533PolEnd 第五节第五节反转录过程及其他方式的复制反转录过程及其他方式的复制 逆转录逆转录（reverse transcriptionreverse transcription）遗传信息从遗传信息从RNARNA流向流向DNADNA，在，在RNARNA指导下的指导下的DNADNA合成的过程合成的过程。（一）概念（一）概念 逆转录酶逆转录酶（reverse transcriptasereverse transcriptase）催化以单链催化以单链RNARNA为模板合成双链为模板合成双链DNADNA反应的反应的酶。具有三种酶活性：酶。具有三种酶活性：RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶；聚合酶；RNARNA酶；酶；DNADNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性。聚合酶活性。（二）逆转录过程（二）逆转录过程RNA模板模板RNARNA指导的指导的DNADNA聚聚合酶活性合酶活性DNA-RNA杂化双链杂化双链RNA酶活性酶活性单链单链DNA双链双链DNADNADNA指导的指导的DNADNA聚聚合酶活性合酶活性逆转录酶逆转录酶 AAAA TTTTAAAASISI核酸酶核酸酶DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 TTTTcDNA complementaryDNA：以以mRNAmRNA为模板，经逆转录为模板，经逆转录合成的与合成的与mRNAmRNA碱基序列互补碱基序列互补的的DNADNA链。分子生物学研究中，链。分子生物学研究中，可应用逆转录酶，作为获取可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为法之一，此法称为cDNAcDNA法，法，体外合成体外合成cDNAcDNA。Someretrovirusescausecancer5.ViralproteinsandRNAareassembledandvirusesbudfromthecellmembrane（三）逆转录的生物学意义（三）逆转录的生物学意义扩充了中心法则扩充了中心法则有助于对病毒致癌机制的了解有助于对病毒致癌机制的了解与真核细胞分裂和胚胎发育有关与真核细胞分裂和胚胎发育有关逆转录酶是分子生物学重要工具酶逆转录酶是分子生物学重要工具酶二、线粒体二、线粒体DNA的复制的复制复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(CaimsCaims实验实验)ABC环状环状DNA的复制的复制 ABC 3 3H-H-胸苷标记大肠杆菌胸苷标记大肠杆菌DNADNA，经过近两代的时间，经过近两代的时间，3 3H-H-胸苷胸苷掺入大掺入大肠杆菌肠杆菌DNA DNA。用溶菌酶消化细胞壁，释放完整的大肠杆菌染色体用溶菌酶消化细胞壁，释放完整的大肠杆菌染色体DNADNA，放射自显影，得到上图。非复制部分（放射自显影，得到上图。非复制部分（C C）银粒子密度较低，由一股放银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分中的一条双链（射性链和一股非放射性链构成。已复制部分中的一条双链（B B）仅有仅有一股链是标记的，另外一条双链（一股链是标记的，另外一条双链（A A）的两股链都是标记的，银粒子的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为密度为前二者的两倍。染色体全长约为11001100微米。微米。滚环复制滚环复制（rolling circle replicationrolling circle replication）：）：简单低等生物的复制方式。简单低等生物的复制方式。+-+-+-+-553333+-533+-533355+-5335+-+-+切断外环切断外环外环外环不断不断剥离内环剥离内环外环的互补外环的互补链间断合成链间断合成核酸酶切核酸酶切终止阶段终止阶段 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNADNA，复制的终止包括双向，复制的终止包括双向复制的复制片段在复制的终止点复制的复制片段在复制的终止点(terter)处汇合；处汇合；RNARNA引引物切除并填补空隙；将冈崎片段连接成完整的子链。物切除并填补空隙；将冈崎片段连接成完整的子链。oriterE.coli8232oriterSV40500第六节第六节DNADNA的损伤与修复的损伤与修复DNA Damage and DNA RepairingDNA Damage and DNA Repairing 一、基因突变（一、基因突变（GeneMutation）一个或多个脱氧核苷酸（碱基）的变化。一个或多个脱氧核苷酸（碱基）的变化。（一）引起突变的因素（一）引起突变的因素1.1.自发突变自发突变 2.2.诱发突变诱发突变 （1 1）物理因素：紫外线物理因素：紫外线(ultra violet,UV)(ultra violet,UV)、各种辐射。各种辐射。UV（2 2）化学因素：）化学因素：烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物等。烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物等。（二）基因突变的类型（二）基因突变的类型1.点突变点突变 DNADNA分子上一个碱基被另一个碱基取代。分子上一个碱基被另一个碱基取代。（1 1）转换转换（transitiontransition）：）：发生在同型碱基之间，即嘌发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤或嘧啶代替另一嘧啶。呤代替另一嘌呤或嘧啶代替另一嘧啶。（2 2）颠换颠换(transversioontransversioon)：发生在异型碱基之间，即嘌：发生在异型碱基之间，即嘌呤变呤变 嘧啶或嘧啶变嘌呤。嘧啶或嘧啶变嘌呤。（3 3）错义突变错义突变（missensemissense mutation mutation）：单一碱基的改变）：单一碱基的改变产生新的密码子，编码不同的氨基酸所造成的突变。产生新的密码子，编码不同的氨基酸所造成的突变。（4 4）无义突变无义突变（nonsense mutationnonsense mutation）：由于一个碱基改）：由于一个碱基改变使正常的密码子成为终止密码子而导致转录终止。变使正常的密码子成为终止密码子而导致转录终止。镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基亚基N-val his leu thr proval glu C肽链肽链CACGTG基因基因正常成人正常成人Hb(HbA)亚基亚基N-val his leu thr proglu glu C肽链肽链CTCGAG基因基因正常人正常人Hb(HbAHb(HbA)：链链N N端第端第6 6个个氨基酸为氨基酸为GluGluHbSHbS：链链N N端第端第6 6个个氨基酸为氨基酸为ValVal导致：导致：HbSHbS携氧能力携氧能力下降下降,缺氧时缺氧时RBCRBC呈呈镰刀状，脆性增加，镰刀状，脆性增加，溶血溶血2.缺失缺失(deletion)一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNADNA分子上消失。分子上消失。3.插入插入（insertion）一个碱基或一段核苷酸链插入到一个碱基或一段核苷酸链插入到DNADNA分子中间。分子中间。移码突变移码突变(frame-shift),又称又称框移突变框移突变 三联体密码的阅读方式改变，造成蛋三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸种类和排列顺序发生改变。白质氨基酸种类和排列顺序发生改变。缺失引起移码突变缺失引起移码突变谷谷酪酪蛋蛋丝丝5GCAGUACAUGUC丙丙缬缬组组缬缬正常正常5GAGUACAUGUC缺失缺失C4.DNA链间共价交联链间共价交联5.三联体扩增三联体扩增(tripletexpansion)重复三联体数目的大量增加。重复三联体数目的大量增加。Huntingtonsdisease，Huntington舞蹈病舞蹈病 常染色体显性遗传的神经变性疾病常染色体显性遗传的神经变性疾病。临床上表现为运动、临床上表现为运动、认知和精神三方面的障碍认知和精神三方面的障碍,呈进行性加重呈进行性加重,平均病程平均病程1515至至2020年年.病理改变为纹状体和大脑皮质选择性的神经元脱失。对病理改变为纹状体和大脑皮质选择性的神经元脱失。对HDHD目目前没有特异有效的治疗方法。前没有特异有效的治疗方法。Huntington蛋白（蛋白（350kD）由由IT15IT15基因（基因（210kb）编码。）编码。开放阅读框开放阅读框55端有一段端有一段CAGCAG三核苷酸重复序列，翻译出一段三核苷酸重复序列，翻译出一段聚谷氨酰胺连接于聚谷氨酰胺连接于N N端。端。CAGCAG的异常扩增导致了该病，正常人的异常扩增导致了该病，正常人CAGCAG的重复次数为的重复次数为11-3411-34之间，而患者在之间，而患者在4242次以上。次以上。重排重排(recombination)DNADNA分子内较大片段的交换。分子内较大片段的交换。由基因重排引起的两种地中海贫血基因型由基因重排引起的两种地中海贫血基因型（三）基因突变的意义（三）基因突变的意义突变是进化、分化的分子基础突变是进化、分化的分子基础突变导致基因型改变突变导致基因型改变突变导致死亡突变导致死亡突变是某些疾病的发病基础突变是某些疾病的发病基础二、二、DNA损伤的修复损伤的修复（一）（一）光修复光修复(lightrepairing)光修复酶光修复酶(photolyase)UV（二）错配修复二）错配修复 错配修复酶：错配修复酶：MSHMSH（三）（三）碱基切除修复碱基切除修复A A：六边型表示错误的碱基六边型表示错误的碱基 B B：一种一种DNADNA糖基化酶切除错误的糖基化酶切除错误的 碱基碱基C C：APAP内切核酸酶及内切核酸酶及APAP裂解酶切裂解酶切 除磷酸二酯链及糖基除磷酸二酯链及糖基D D：DNADNA聚合酶填补单一核苷酸。聚合酶填补单一核苷酸。E E：DNADNA连接酶封闭缺口连接酶封闭缺口 ABCDE（四）（四）核苷酸核苷酸切除修复切除修复A.A.DNADNA一条链损伤一条链损伤B.B.B B、C:C:核酸内切酶核酸内切酶识别损伤部位并在识别损伤部位并在损伤部位的两端切损伤部位的两端切除一段除一段DNADNAC.C.D:D:DNADNA聚合酶聚合酶以另以另一条完好的一条完好的DNADNA链链为模板合成一段新为模板合成一段新的的DNADNAD.D.E:E:缺口处由缺口处由DNADNA连连接酶接酶封闭封闭。AB CDE最主要修复方式。最主要修复方式。着色性干皮病着色性干皮病 （xerodermaxeroderma pigmentosispigmentosis,XP,XP）常染色体隐性遗传。皮肤对日光，尤其是对紫常染色体隐性遗传。皮肤对日光，尤其是对紫外线敏感。主要临床表现是皮肤雀斑样色素沉外线敏感。主要临床表现是皮肤雀斑样色素沉着，毛细血管扩张，局限性萎缩，疣状增生，着，毛细血管扩张，局限性萎缩，疣状增生，浅表溃疡，最后可癌变。浅表溃疡，最后可癌变。病人的病人的XPXP类基因（类基因（XPAXPA、XPBXPB、XPCXPC、XPFXPF、XPG XPG）有缺陷，导致有缺陷，导致DNADNA损伤后的修复障碍。损伤后的修复障碍。（五）重组修复（五）重组修复(recombinant repairing)(recombinant repairing)DNADNA损伤较长，不能完全修复。损伤较长，不能完全修复。A.A.DNADNA一条链损伤一条链损伤B.B.B BDNADNA复复制制后后，其其中中一一个个子子代代是是正正常常的的，而而另另一一个个子代的一条链出现空隙。子代的一条链出现空隙。C C以以正正常常子子代代中中原原来来自自母母链链的的一一段段DNADNA序序列列通通过过重重组组，将缺损部分修复。将缺损部分修复。D.D.再以子代中完整的链为模再以子代中完整的链为模板，修补缺失的互补序列板，修补缺失的互补序列。ABCD（六）（六）跨损伤修复跨损伤修复(bypasssynthesis)(TT)(TT)表示模板的损伤的部位表示模板的损伤的部位一些特殊的一些特殊的DNADNA聚合酶可以修补损伤部位。聚合酶可以修补损伤部位。旁路合成旁路合成SOSSOS修复修复(SOSrepairing)当当DNADNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。系列复杂的反应。在在E.coliE.coli，各种与修复有关的基因，组成一个称，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子为调节子(regulonregulon)的网络式调控系统。的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过通过SOSSOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而然而DNADNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。变。共同阻遏物：共同阻遏物：LexALexADNADNA损伤时，损伤时，RecARecA活性，结合活性，结合LexALexA,无活性片段。被无活性片段。被LexALexA抑制的基因被开放。抑制的基因被开放。概念：概念：半保留复制半保留复制复制叉复制叉领头链领头链随从链随从链冈崎片冈崎片段段端粒端粒端粒酶端粒酶逆转录逆转录逆转录酶逆转录酶cDNADNA重组重组基因突变基因突变无义突变无义突变移码突变移码突变简述：简述：1.DNA复制的一般特点。复制的一般特点。2.保证保证DNA复制忠实性的原因。复制忠实性的原因。3.参与参与DNA复制的主要酶类有哪些，各有何主复制的主要酶类有哪些，各有何主要功能。要功能。4.原核和真核生物原核和真核生物DNA复制的区别。复制的区别。5.DNA突变的类型和意义。突变的类型和意义。6.DNA修复的种类。修复的种类。本章完本章完下一章下一章RNA的生物合成的生物合成