基因工程的基本操作程序及基因工程的应用

基因工程的基本操作程序及基因工程的基本操作程序及基基因工程的应用因工程的应用 目的基因的获取目的基因的获取 基因表达载体的构建（基因表达载体的构建（核心核心）将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定四四 个个 步步 骤骤一、目的基因的获取一、目的基因的获取(一一)、目的基因、目的基因主要主要是是_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因（二）、获取目的基因的常用方法（二）、获取目的基因的常用方法从基因文库中获取从基因文库中获取利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增人工合成人工合成1)1)基因文库？基因文库？1.1.从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因将含有将含有某种生物某种生物不同基因的许多不同基因的许多DNADNA片断，片断，导入到导入到受体菌受体菌的群体中，各个受体菌分别含的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库有这种生物的不同基因，称为基因文库2)2)基因文库的种类基因文库的种类:种种类类基因组基因组DNA文库：文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNA文库文库概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项在生物，是一项在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段（2 2）利用）利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因过程过程1.1.变性变性（9595）双双链链DNADNA模板在热作用模板在热作用下，下，_断裂，形断裂，形成成_氢键氢键单链单链DNADNA2.2.复性复性 (55)(55)温度温度降低，降低，与与DNADNA模板结合，形成局模板结合，形成局部部_。双链双链引物引物3.3.延伸延伸（7272）在在 的作用下，的作用下，从引物的从引物的 连接连接 ，合，合 成与模板互补的成与模板互补的DNADNA链。链。33端端脱氧核苷酸脱氧核苷酸TaqTaq酶酶2 2、具体过程、具体过程PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶高温下变性解旋高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制(PCR扩增仪扩增仪内内)主要在细胞核内主要在细胞核内热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）酶）大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子解旋酶、解旋酶、普通的普通的DNADNA聚合酶等聚合酶等3.3.人工合成人工合成1)1)反转录法：反转录法：杂交双链杂交双链(单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA双链双链DNADNA(cDNAcDNA)目的基因目的基因的的mRNAmRNA某种酶某种酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录酶反转录酶2)2)根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ：蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的脱氧核苷酸序列基因的脱氧核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成二、基因表达载体的构建（二、基因表达载体的构建（核心核心）使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且可以，并且可以遗传遗传给下一代给下一代使目的基因能够使目的基因能够表达和发挥作用表达和发挥作用1 1、基因、基因表达载体表达载体构建的目的构建的目的？（？（P11P11）2 2、基因表达载体的组成、基因表达载体的组成启动子启动子目的基因目的基因终止子终止子标记基因标记基因三、将目的基因导入三、将目的基因导入受体细胞受体细胞目的基因进入目的基因进入_ _内，并且在受体内，并且在受体细胞内维持细胞内维持_ _ _和和_ _的过程的过程转化转化:受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：易感染易感染双子叶植物双子叶植物和和裸子植物裸子植物，对大多数单，对大多数单子叶植物没有感染能力子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA（可转移的（可转移的DNA)可以转移到受体细胞，并且整合到受可以转移到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的体细胞染色体的DNA上。上。农杆菌特点：农杆菌特点：（1）农杆菌转化法）农杆菌转化法(采用最多）两次拼接？两次导入？两次拼接？两次导入？组织培养技术组织培养技术（2 2）基因枪法）基因枪法（3 3）花粉管通道法）花粉管通道法 显微注射技术（最常用，最有效）显微注射技术（最常用，最有效）（3 3）将目的基因导入动物细胞）将目的基因导入动物细胞方法方法受体细胞受体细胞常用受精卵常用受精卵目的基因的表达载体提纯目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物过程：过程：（2 2）将目的基因导入微生物细胞）将目的基因导入微生物细胞过程：过程：Ca2+处理受体细胞处理受体细胞感受态细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子思考：早期的基因工程用什么作受体细胞？为什么？思考：早期的基因工程用什么作受体细胞？为什么？常用原核生物，因为原核生物繁殖快、多为单细常用原核生物，因为原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。胞、遗传物质相对较少等。方法方法CaCa2+2+处理法处理法用用CaCa2 2处理，处理，增加细菌细增加细菌细胞壁的通透胞壁的通透性性思考：思考：为什么为什么要用要用Ca2+处理处理受体细胞？受体细胞？受体生物受体生物 植物植物 动物物 微生物微生物受体受体细胞胞导入方法入方法受精卵受精卵体细胞体细胞受精卵受精卵细胞细胞/个体个体农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注显微注射技术射技术用用CaCa2+2+处理成处理成感受态细胞感受态细胞采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）的是（）A.A.将毒素蛋白注射到受精卵中将毒素蛋白注射到受精卵中B.B.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养感染棉的体细胞，再进行组织培养C.C.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵入受精卵D.D.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，注射到棉受精卵中序列，注射到棉受精卵中四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否上是否插入了目的基因插入了目的基因1 1、导入检测、导入检测目的：目的：方法：方法：DNADNA分子杂交技术分子杂交技术从转基因生物中提取的基因组从转基因生物中提取的基因组DNADNA探针？探针？杂交的对象？杂交的对象？用放射性同位素标记的用放射性同位素标记的含目的基因的含目的基因的DNADNA片段片段1515N N1515N N1414N N探针探针探针探针转基因生转基因生转基因生转基因生物的物的物的物的DNADNA变性变性变性变性变性变性变性变性1414N N过过程程.首先取出首先取出转基因生物的基因组转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用片段用放射性同位素等作标记放射性同位素等作标记,以此做以此做探针探针。使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出若显示出杂交带杂交带,表明目的基因已插入染色体表明目的基因已插入染色体DNA中中2 2、转录检测、转录检测目的：目的：检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA方法：方法：分子杂交技术分子杂交技术用放射性同位素标记的用放射性同位素标记的含目的基因的含目的基因的DNADNA片段片段探针？探针？杂交的对象？杂交的对象？从转基因生物中提取的从转基因生物中提取的mRNA.mRNA.3 3、翻译检测、翻译检测目的：目的：检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法:抗原抗体杂交技术抗原抗体杂交技术从转基因生物中提取的蛋白质从转基因生物中提取的蛋白质抗原？抗原？抗体？抗体？将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产生的相应抗体生的相应抗体4、个体生物学水平的鉴定、个体生物学水平的鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定、抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等活性鉴定等DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。归纳:基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法、农杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理法处理法4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：鉴定：个体生物学水平的鉴定个体生物学水平的鉴定基因工程的应用基因工程的应用1.1.植物基因工程硕果累累植物基因工程硕果累累抗虫转基因植物抗虫转基因植物方法：方法：目的基因：目的基因：从某些生物中分离出具有从某些生物中分离出具有杀虫活性杀虫活性的的基因，将其导入作物中，使其具有抗基因，将其导入作物中，使其具有抗虫性虫性BtBt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等因等成果：成果：转基因抗虫棉；转基因抗虫水稻转基因抗虫棉；转基因抗虫水稻等。等。抗虫棉（左）和普通棉（右）的叶抗虫棉（左）和普通棉（右）的叶子子转基因抗虫水稻（绿色植株）与对照（黄色枯萎植转基因抗虫水稻（绿色植株）与对照（黄色枯萎植株）株）1.1.植物基因工程硕果累累植物基因工程硕果累累目的目的基因：基因：病毒外壳蛋白基因（病毒外壳蛋白基因（CPCP基基因）因）病毒的复制酶基因病毒的复制酶基因成果：成果：抗烟草花叶病毒的转基因烟草抗烟草花叶病毒的转基因烟草抗病毒的转基因小麦、甜椒、番茄抗病毒的转基因小麦、甜椒、番茄等。等。1.1.植物基因工程硕果累植物基因工程硕果累累累抗病转基因植物抗病转基因植物抗病毒基因：抗病毒基因：几丁质酶基因几丁质酶基因抗毒素合成基因抗毒素合成基因抗真菌基因：抗真菌基因：引起植物生病的病原微生物有：病毒、真菌和引起植物生病的病原微生物有：病毒、真菌和细菌细菌1.1.植物基因工程硕果累植物基因工程硕果累累累抗逆转基因植物抗逆转基因植物成果：成果：A.A.利用调节利用调节细胞渗透细胞渗透压压的基因，提高作物的基因，提高作物抗旱和抗盐碱能力；抗旱和抗盐碱能力；B.B.将鱼的将鱼的抗冻蛋白抗冻蛋白基基因转入番茄，提高番因转入番茄，提高番茄的抗冻能力。茄的抗冻能力。C.C.将将抗除草剂抗除草剂基因导基因导入农作物中，在喷洒入农作物中，在喷洒除草剂时，杀死杂草除草剂时，杀死杂草而不杀死农作物。而不杀死农作物。1.1.植物基因工程硕果累植物基因工程硕果累累累利用转基因改良农作物品质利用转基因改良农作物品质成果：成果：A.A.将将富含赖氨酸的蛋白质富含赖氨酸的蛋白质的编的编码基因导入玉米，获得的转基码基因导入玉米，获得的转基因玉米赖氨酸含量提高因玉米赖氨酸含量提高3030。B.B.将将控制番茄成熟控制番茄成熟的基因带入的基因带入番茄，获得转基因延熟番茄，番茄，获得转基因延熟番茄，储存期可以达储存期可以达2 2个月。个月。C.C.将与将与植物花青素植物花青素有关的基因有关的基因导入矮牵牛中，转基因矮牵牛导入矮牵牛中，转基因矮牵牛出现颜色变异。出现颜色变异。2.2.动物基因工程前景广阔动物基因工程前景广阔用于提高动物生长速度用于提高动物生长速度目的基因？举例说明目的基因？举例说明用于改善畜产品品质用于改善畜产品品质举例说明举例说明用转基因动物生产药物用转基因动物生产药物如何操作？生产出哪些药物？如何操作？生产出哪些药物？用转基因动物做器官移植的供体用转基因动物做器官移植的供体如何操作？如何操作？2.2.动物基因工程前景广阔动物基因工程前景广阔用于提高动物生长速度用于提高动物生长速度目的基因：目的基因：生长激素基因生长激素基因例如：例如：将外源生长激素将外源生长激素基因导入鲤鱼体基因导入鲤鱼体内，内，9 9个月后转基个月后转基因鲤鱼比对照组因鲤鱼比对照组重重1.5Kg1.5Kg。转入生长激素基因的转入生长激素基因的鱼（上）和同龄的鱼鱼（上）和同龄的鱼肠乳糖酶基因肠乳糖酶基因例如：例如：将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使转基因奶牛中乳糖含量大大降低。使转基因奶牛中乳糖含量大大降低。用于改善畜产品品质用于改善畜产品品质目的基因：目的基因：2.2.动物基因工程前景广动物基因工程前景广阔阔药用蛋白基因药用蛋白基因用转基因动物生产药物用转基因动物生产药物目的基因：目的基因：过程：过程：获取目的基因获取目的基因（药用蛋白基因）（药用蛋白基因）构建基因表达载体构建基因表达载体（药用蛋白基因与（药用蛋白基因与乳腺蛋乳腺蛋白白基因启动子等调控组件基因启动子等调控组件重组）重组）显微注射显微注射（哺乳动物受精卵中（哺乳动物受精卵中）形成胚形成胚胎胎将胚胎送入母体动将胚胎送入母体动物物发育成转基因动物发育成转基因动物（只有在产下的雌性动物个（只有在产下的雌性动物个体中，转入的基因才能表达）体中，转入的基因才能表达）动物进入泌乳期动物进入泌乳期（分泌的乳汁中包含所（分泌的乳汁中包含所需要的药物）需要的药物）2.2.动物基因工程前景广阔动物基因工程前景广阔乳腺生物反应器：乳腺生物反应器：用转基因动物生产药物用转基因动物生产药物指以转基因雌性动物指以转基因雌性动物个体的乳腺分泌乳汁个体的乳腺分泌乳汁来生产所需药品。来生产所需药品。优点：优点：产量高产量高质量好质量好成本低成本低易提取易提取成果：成果：抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素、抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素、抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶2.2.动物基因工程前景广阔动物基因工程前景广阔用转基因动物做器官移植的供体用转基因动物做器官移植的供体供体动物：供体动物：猪猪存在难题：存在难题：解决方法：解决方法：将供体基因组导入某种基因调将供体基因组导入某种基因调节因子，以节因子，以抑制抗原决定基因抑制抗原决定基因的表达的表达，或设法除去抗原决定或设法除去抗原决定基因，基因，再结合克隆技术，培育再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。克隆猪器官。免疫排斥免疫排斥（T T细胞）细胞）3.3.基因工程药物基因工程药物l在传统的药品生产中，某些药品直接从生物的在传统的药品生产中，某些药品直接从生物的组织、细胞或血液组织、细胞或血液中提取。中提取。如胰岛素从生物胰腺中提取，干扰素从血液中如胰岛素从生物胰腺中提取，干扰素从血液中提取。提取。l传统生产方法的缺点传统生产方法的缺点由于受原料来源的限制，由于受原料来源的限制，数量少且价格十分数量少且价格十分昂贵。昂贵。l可利用什么方法来解决上述问可利用什么方法来解决上述问题？题？利用基因工程方法制造利用基因工程方法制造“工程菌工程菌”，可可高效率高效率地生产出各种地生产出各种高质量、低成本高质量、低成本的药品。的药品。一般临床上使用的胰岛素主要从一般临床上使用的胰岛素主要从猪、牛等家畜猪、牛等家畜的胰腺的胰腺中提取，每中提取，每100kg胰腺只能提取胰腺只能提取45g胰岛胰岛素。用该方法生产的胰岛素素。用该方法生产的胰岛素产量低，价格昂贵，产量低，价格昂贵，远不能满足社会需要远不能满足社会需要。1979年，科学家将动物体内的年，科学家将动物体内的胰岛素基因与大胰岛素基因与大肠杆菌肠杆菌DNA分子重组分子重组，并在大肠杆菌内实现了，并在大肠杆菌内实现了表达。表达。基因工程药品基因工程药品 胰岛素胰岛素3.3.基因工程药物基因工程药物 干扰素是干扰素是病毒侵入细胞后产生病毒侵入细胞后产生的一种的一种糖蛋白糖蛋白。几乎能几乎能抵抗所有抵抗所有病毒引起的病毒引起的感染感染，是一种，是一种抗病毒抗病毒的特效药的特效药。此外对治疗某些。此外对治疗某些癌症和白血病癌症和白血病也有一也有一定疗效。定疗效。传统的干扰素生产方法是从人血液中的传统的干扰素生产方法是从人血液中的白细白细胞内提取胞内提取，每，每300L血液只能提取出血液只能提取出1mg干扰素。干扰素。基因工程药品基因工程药品 干扰素干扰素3.3.基因工程药物基因工程药物 治疗侏儒症治疗侏儒症的的唯一方法唯一方法，是注射生长激素。，是注射生长激素。而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素需解剖尸体，从大脑的底部素需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体摘取垂体，并从中，并从中提取生长激素。提取生长激素。现利用基因工程方法，将人的现利用基因工程方法，将人的生长激素基因生长激素基因导入大肠杆菌导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。中，使其生产生长激素。人们从人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于激素，相当于6万具尸体的全部产量。万具尸体的全部产量。基因工程药品基因工程药品 生长激素生长激素3.3.基因工程药物基因工程药物目前我国生产的基因工程药物有白细胞介素目前我国生产的基因工程药物有白细胞介素2、干扰素、乙肝疫苗等。、干扰素、乙肝疫苗等。4.4.基因治疗基因治疗基因治疗：基因治疗：基因治疗是把基因治疗是把正常基因正常基因导入病人体内，导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。这是治疗到治疗疾病的目的。这是治疗遗传病遗传病的的最有效的手段。最有效的手段。载体载体治疗治疗基因基因受体细受体细胞胞重组受体细重组受体细胞胞患者患者体内体内导入导入形成形成体外培养后导体外培养后导入入直接导入直接导入体体外外基因治基因治疗疗体体内内基因治基因治疗疗40体外基因治疗：从病人体内获取某种细胞进体外基因治疗：从病人体内获取某种细胞进行培养，然后，在体外完成基因转移，再筛行培养，然后，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩大培养，最后重新输入选成功转移的细胞扩大培养，最后重新输入患者体内。患者体内。4.4.基因治疗基因治疗体外基因治疗体外基因治疗例如：例如：复合型免疫缺陷症的体外治疗复合型免疫缺陷症的体外治疗直接直接原因：原因：缺乏腺苷酸脱氨酶缺乏腺苷酸脱氨酶（ADAADA）根本根本原因：原因：腺苷酸脱氨酶（腺苷酸脱氨酶（ADAADA）基因缺）基因缺失失方方 法法：将将ADAADA基因转入患者的淋巴细基因转入患者的淋巴细胞胞4.4.基因治疗基因治疗体内基因治疗体内基因治疗：例如：例如：CFTRCFTR基因缺失基因缺失3 3个个碱基对碱基对CFTRCFTR蛋白缺少一个苯丙氨酸，导致蛋白缺少一个苯丙氨酸，导致CFTRCFTR蛋白结构异常蛋白结构异常CFTRCFTR蛋白转运氯离子的功能异常蛋白转运氯离子的功能异常患者支气管内黏液增患者支气管内黏液增多多黏液清除困难，细菌繁殖，肺部黏液清除困难，细菌繁殖，肺部感染感染囊性纤维病囊性纤维病直接向人体细胞中转移基因直接向人体细胞中转移基因4.4.基因治疗基因治疗治疗方法：治疗方法：利用修饰的利用修饰的腺病毒腺病毒作为载作为载体，将治疗囊性纤维病的体，将治疗囊性纤维病的正常基因转入患者的肺部正常基因转入患者的肺部组织中。组织中。体内基因治疗：体内基因治疗：直接向人体细胞中转移基因直接向人体细胞中转移基因