干细胞移植治疗脊髓损伤研究进展

干细胞移植治疗脊髓损伤研究进展神经生物学研究室王特为脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是中枢神经系统的一种严重创伤，多系车祸、坠落伤等造成脊柱脱位、骨折所致。由于损伤后脊髓缺乏自身修复能力，脊髓功能的损害往往呈不可逆性改变，患者受伤后往往终身丧失劳动力，生活不能自理，造成沉重的家庭和社会负担。因此，如何促进脊髓损伤后神经元再生、引导脊髓功能恢复是神经科学领域迫切需要解决的课题。近年发现，在适当的微环境下，中枢神经系统内的一些受损的神经元轴突有少许再生，并能与靶细胞形成功能性的突触联系。随着神经病理生理及神经发育学研究的不断深入，以及对胚胎干细胞、神经干细胞等分离技术的成熟和定向分化技术的发展。目前治疗脊髓损伤应用比较多的方法是干细胞移植治疗和神经营养因干细胞移植治疗和神经营养因子的应用子的应用。移植的细胞可在损伤部位存活、整合入宿主组织中，分化出神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，并且和宿主细胞之间可形成突触样结构，使中枢神经系统的功能得到部分恢复。大量的动物实验研究表明干细胞移植修复神经损伤的前景被普遍看好。目前用于实验性移植治疗脊髓损伤的常用细胞有：神经干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、雪旺氏细胞、嗅鞘细胞甚至成纤维细胞等。尽管采用不同干细胞移植的研究都取得了肯定性的神经修复效果，但对于不同种类干细胞的适用范围、疗效差异等却缺乏足够的认识。鉴于干细胞类型选择对神经修复效果可能具备的决定性作用，本专题对此问题进行阐述。神经干细胞神经干细胞(neural stem cells(neural stem cells，NSCs)NSCs)神经干细胞属于多能干细胞，最先是Reynolds和Weiss等1992年首先从小鼠纹状体中分离获得的，改变了神经细胞损伤后没有再生能力的传统观念。迄今为止，在哺乳动物胚胎的中枢神经系统的大部分区域包括大脑皮质、侧脑室、室管膜下层、海马、纹状体等区域都存在神经干细胞，而且在成年动物的大脑皮质、海马齿状回、室管膜下层、纹状体、脊髓中央管室管膜区和嗅球中也有神经干细胞存在。1无血清培养第3d。2无血清培养第5d。3无血清培养第7d。4贴壁的次代神经球。5神经球 Nestin染色6贴壁后大量细胞迁出，长出突起7.8贴壁后，行BrdU染色9贴壁分化生长第7天25010,11分化成的Tuj1神经元12,13分化成的GFAP星形胶质14,15分化成的Galc少突胶质2000年Gage将神经干细胞的特性概括为：可生成神经组织或来源于神经系统：具有自我更新能力；可通过不对称细胞分裂产生新细胞。神经干细胞作为治疗脊髓损伤最理想的细胞移植材料前景喜人。它不仅能促进神经元的再生和脑组织的修复，而且通过基因修饰还可用于神经系统疾病的基因治疗，表达外源性的神经递质、神经营养因子及代谢性酶。将这种多能干细胞移植入中枢神经系统损伤部位，不仅可以存活和整合入宿主组织中，分化出神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，填充因损伤造成的空洞，并且和宿主细胞之间可以形成突触样的结构，使神经组织损伤区域的组织结构得以修复，使中枢神经系统的功能得到一些恢复。Galin等把人类神经干细胞植入脊髓损伤动物模型后细胞成活并使运动功能得到部分恢复。Gao等将NSCs移植入胆碱能运动神经元缺陷的大鼠模型后，发现由NSCs分化的胆碱能神经元的轴突能穿越腹侧神经根和坐骨神经，并与外周肌肉组织形成神经-肌肉接头，其运动功能得到明显改善。Akiyama等报道，将来源于手术中取出的成人脑组织的神经前体细胞移植入大鼠脱髓鞘的脊髓中，发现这些细胞以一种相似于雪旺氏细胞成髓鞘的方式形成髓鞘，并且这些形成髓鞘的轴突能以近似正常的速度传导冲动，这表明有功能性的髓鞘形成。国内也有学者报道，从胚胎大鼠皮质分离的NSCs可以在体外大量的增殖，并保持干细胞的特性。将这种细胞移植入大鼠脊髓L4节段全横切处，BrdU免疫组织化学显示NSCs移植促进模型大鼠后肢功能的恢复，皮层体感诱发电位和HRP逆行示踪显示脊髓的传导功能得到部分恢复。Liang等从自然流产胎儿皮层中获得人NSCs，经过离心提纯以及体外增殖后将其植入T11脊髓全横断的小鼠体内，小鼠皮质脊髓束纤维显著再生并且重新形成突触连接，小鼠的后肢运动功能得到明显恢复。有研究者将从大鼠胚胎脑组织中分离的NSCs植入脊髓挤压伤后710d的模型中，通过免疫双标染色证实，移植的NSCs部分向神经元分化；并且电镜观察发现，新生神经元与宿主神经元间有新建立的突触，运动学检测表明，移植组大鼠后肢运动功能得到了明显的改善，但与正常动物相比仍有较大差距。电生理皮质运动诱发电位也证实，移植组诱发电位的潜伏期明显较损伤组的潜伏期缩短，但仍长于正常对照组。加强NSC定向分化，解决轴突定向研究将是今后研究的重点。然而，动物实验发现，在受损脊髓内炎症细胞因子的作用下，神经干细胞植入体内后不再分化或仅向星形胶质细胞分化从而参与瘢痕组织形成。某些神经因子可能对神经干细胞的分化也有影响。Ishii等将从小鼠胚胎中提取的神经干细胞植入受损的小鼠脊髓后，采用睫状神经营养因子(CNTF)抗体阻断CNTF作用，8周后组织学观察发现脊髓内胶质瘢痕形成显著减少。与仅移植神经干细胞而未使用CNTF抗体的对照组相比，实验组小鼠脊髓内神经干细胞分布较广且再生的传导纤维数量显著增多。因此神经干细胞在脊髓损伤治疗中的应用受到限制。另外，虽然相比胚胎干细胞。神经干细胞具备取材不牵涉伦理学纠纷的优势，但取材来源有限，获取材料时手术具有侵袭性，治疗的同时会对患者造成损伤，难以获得患者认同。而且，神经干细胞分离提纯技术要求苛刻，诸多限制因素，使得神经干细胞在脊髓损伤修复组织工程中应用的研究进展缓慢，目前尚未进入临床试验阶段。胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESs)ESs 细胞是一种高度未分化的全能细胞，具有发育成各种类型细胞的潜能。在体外培养系统中可扩增并可维持其全能性。能广泛参与宿主胚胎各组织、器官生长发育，形成嵌合体。Ogawa等将原代培养的ESs体外诱导分化，移植到脊髓损伤处，可在受损脊髓部位形成突触样结构，在一定程度上分化为少突胶质细胞，有助于形成轴突髓鞘，促进脊髓功能改善，可减少空洞面积。ABCDA 饲养细胞上生长的ESCsB 无饲养层细胞培养5天的ESCsC 无饲养层细胞培养10天的ESCsD 无饲养层细胞培养14天的ESCs胚胎干细胞胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)胚胎干细胞培养过程胚胎干细胞培养过程ESC的分化潜能的分化潜能人胚胎干细胞来源人胚胎干细胞来源有人认为8090的胚胎细胞在移植入成年脊髓损伤动物的脊髓后能存活，移植物所释放的营养因子能促进宿主神经元的再生，且再生轴突能快速穿越移植物与宿主组织的边界，重建轴突的连续性。武明鑫等研究发现在脊髓损伤小鼠体内移植胚胎干细胞的衍生细胞，可改善受损的脊髓神经功能和提高生存率。Yanai等在免疫耐受的脑区，移植24细胞期的C57BL和BALBc小鼠杂交的胚胎、胚胎干细胞或拟胚体培养物到异种HSIbg小鼠的海马，胚胎干细胞和拟胚体广泛生长，最后比脑本身大，造成宿主在29 d内死亡。这些证据显示直接移植胚胎干细胞到脑内，对其生长缺乏控制，造成脑神经移植畸胎瘤的生成，危险性较大。另外，现在胚胎干细胞的研究虽然在世界范围内很广泛，但是在各个国家都存在伦理与法律上的争论。目前，神经再生科学的研究重点应放在轴突生长和靶特异性相互作用的机制上。胚胎干细胞在神经损伤修复中的优势在于成功定向诱导分化后经过长时间培养仍能表现出较高的增殖稳定性。为其临床应用的疗效确切性初步奠定了基础。但是胚胎干细胞的应用存在颇多障碍，由于采用的胚胎干细胞取材于人类胚胎，有限的来源和取材过程难以回避的伦理学问题成为其广泛应用过程中的障碍。此外，未分化的胚胎干细胞具有潜在的致瘤效应，且植入成熟中枢神经系统的非神经区后保持不分化或主要向神经胶质细胞分化。因此，进行细胞移植之前，需要对胚胎干细胞进行细胞分筛以及定向诱导分化。然而，将人胚胎干细胞作为修复脊髓损伤靶细胞的研究时间尚短，目前仅处于实验室研究阶段。人胚胎干细胞在体内的分化受到干细胞前分化期的影响，也为疗效的稳定性增添了不少变数。因此，目前应用于临床还比较困难间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)又称为骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)，是成年动物或人骨髓中的非造血组织干细胞，具有多能干细胞的特点，能分化成多种类型的细胞。该细胞除具备干细胞的基本特征外，还可根据所锚靠局部组织的微环境定向分化为靶组织细胞，其多向分化潜能受到学术界广泛关注。图 实验研究证实，MSCs具有诱导分化为神经细胞的潜能，并且能向神经干细胞一样在中枢神经组织(脑、脊髓)里迁移和整合，为治疗脊髓损伤展示了一种全新和理想的方法，动物实验及临床应用中也有报道MSCs移植对脊髓损伤治疗有效而且是安全的。Hofstetter等将来源于路易鼠股骨和胫骨内的BMSCs移植入同种鼠受损脊髓中，组织学检查发现植入的BMSCs可以向神经细胞分化，使受损脊髓恢复功能。此外，BMSCs可能还分泌一些营养物质从而促进内源性细胞增殖、生长。MSCs来源丰富，提取方便，容易分离纯化和体外扩增，自体移植克服了伦理学争议和排斥反应问题。MSCs免疫原性弱，移植时可不使用免疫抑制剂，也未发生不良反应，植入部位没有观察到肿瘤的发生。MSCs注入新生小鼠脑内后可迁移至整个前脑和小脑。将MSCs移植入大鼠脊髓损伤部位，显示MSCs可以存活，并能很好地整合到宿主组织中，并在没有基因修饰时也能促进轴突的生长骨髓间充质干细胞的发现、分离与成功诱导分化为神经细胞，为脊髓损伤的移植治疗提供了“种子细胞”。其移植可能成为一种保护和促进损伤的脊髓功能恢复的崭新治疗手段。与其他移植细胞相比，BMSCs易于提取、分离，能够自体移植且组织兼容性好。然而和其他类型的干细胞一样，BMSCs在体内的定向分化也受到脊髓病理微环境的影响，可能定向不佳。此外，Himes等发现将来源于小鼠骨髓的BMSCs植入同种小鼠受损脊髓后，BMSCs的数量将随时间的推移而减少。因此，如何使BMSCs在体内病理环境下获得稳定的定向分化以及提高移植细胞在体内的存活时间是目前迫切需要解决的问题。多年以来，脊髓损伤的治疗是困扰神经科学研究者的难点问题，移植治疗为解决这个难题提供了可能性。但细胞移植的应用研究中还存在着许多尚未解决的问题，如体外扩增速度问题，分化神经元的比例控制、功能性神经元的定向分化问题，移植方法、途径、细胞状态、支架、佐剂、适应症等等问题，距离临床应用还有诸多困难，亟待深入研究和解决。随着人们对干细胞研究的不断深入，细胞移植治疗脊髓损伤的临床应用将有望在不远的将来取得突破性进展。总之，干细胞移植修复脊髓损伤到目前为止仍然处于实验室研究阶段。由于不同类型干细胞取材、定向分化效率、分化稳定性等方面的特点优劣互现、参差不齐，干细胞移植修复脊髓损伤迄今为止仍然缺乏一种优化的方案。但干细胞移植修复脊髓损伤的研究已经取得了阶段性的成果，相信随着干细胞定向分化技术的逐步成熟，干细胞移植修复脊髓损伤的疗效必然趋于稳定，临床应用前景值得期待。