移植排斥反应

移植免疫及相关问题探讨移植免疫及相关问题探讨瑞金医院检验科瑞金医院检验科顾志冬顾志冬 免疫排斥与器官移植相关检验技术l l移植移植(transplantation):指用自体或异指用自体或异体的正常细胞、组织或器官置换病变的体的正常细胞、组织或器官置换病变的或功能缺损的细胞、组织与器官，以维或功能缺损的细胞、组织与器官，以维持和重建机体生理功能的治疗方法。持和重建机体生理功能的治疗方法。l l供者（供者（donor）l l受者（受者（recipient）l l移植物（移植物（graft）l l移植排斥反应（移植排斥反应（graft rejection）目的：救治末期器官衰竭、恶性血液病、目的：救治末期器官衰竭、恶性血液病、肿瘤以及某些遗传病。肿瘤以及某些遗传病。要求：尽可能让移植物能在受体体内生存要求：尽可能让移植物能在受体体内生存 或暂存常时间。或暂存常时间。困惑：排斥反应、继发感染。困惑：排斥反应、继发感染。策略策略“immunotoleranceimmunotolerance”（免疫耐受），（免疫耐受），监测和预防。监测和预防。免疫排斥（免疫排斥（immune rejectionimmune rejection）：指器官、）：指器官、组织或细胞移植后，受体发生免疫应答，组织或细胞移植后，受体发生免疫应答，引起针对移植物的免疫损伤而使其丧失功引起针对移植物的免疫损伤而使其丧失功能的一个过程。能的一个过程。表现：表现：hyperacutehyperacute rejection rejection acute rejection acute rejection chronic rejection chronic rejection移植类型：移植类型：1、autologous transplantation自身移植自身移植2、syngeneic transplantation同系移植同系移植3、allogeneic transplantation同种异体、同种异体、异基因移植异基因移植4、xenogeneic transplantation异种移植异种移植 根据移植物所植部位根据移植物所植部位原位原位 异位异位主要内容一、免疫排斥反应发生的机制一、免疫排斥反应发生的机制二、移植排斥反应的类型二、移植排斥反应的类型三、移植中的组织配型三、移植中的组织配型四、移植排斥的免疫学防治四、移植排斥的免疫学防治五、干细胞移植五、干细胞移植六、移植排斥的特殊免疫学问题六、移植排斥的特殊免疫学问题七、排斥反应的免疫学检验七、排斥反应的免疫学检验八、移植后药物浓度的检测八、移植后药物浓度的检测一、免疫排斥反应发生的机制（一）移植抗原（一）移植抗原（一）移植抗原（一）移植抗原（transplantation antigentransplantation antigentransplantation antigentransplantation antigen）1 1 1 1、主要组织相容性抗原、主要组织相容性抗原、主要组织相容性抗原、主要组织相容性抗原（major major major major histohistohistohisto compatibility antigen compatibility antigen compatibility antigen compatibility antigen，MHAMHAMHAMHA）又人类白细胞抗原又人类白细胞抗原又人类白细胞抗原又人类白细胞抗原（human leukocyte antigenhuman leukocyte antigenhuman leukocyte antigenhuman leukocyte antigen，HLAHLAHLAHLA）2 2 2 2、次要组织相容性抗原、次要组织相容性抗原、次要组织相容性抗原、次要组织相容性抗原（minor minor minor minor histohistohistohisto compatibility antigen compatibility antigen compatibility antigen compatibility antigen，mHAmHAmHAmHA）3 3 3 3、其他同种异型抗原、其他同种异型抗原、其他同种异型抗原、其他同种异型抗原（血型、不同组织特异性抗原）（血型、不同组织特异性抗原）（血型、不同组织特异性抗原）（血型、不同组织特异性抗原）1 1、主要组织相容性抗原（、主要组织相容性抗原（MHAMHA）：一组存在）：一组存在于各种脊椎动物某对染色体特定区域的基于各种脊椎动物某对染色体特定区域的基因群，其编码的基因产物分布于各种有核因群，其编码的基因产物分布于各种有核细胞的表面，为重要的细胞膜抗原，也称细胞的表面，为重要的细胞膜抗原，也称之主要组织相容性复合体（之主要组织相容性复合体（MHCMHC）。）。人和脊椎动物都有各自独特的人和脊椎动物都有各自独特的MHAMHA。除小鼠。除小鼠 和大鼠有专门命名外，其他种属的和大鼠有专门命名外，其他种属的MHAMHA均称均称白细胞抗原（白细胞抗原（leukocyte antigenleukocyte antigen，LALA）。）。（Human leukocyte antigenHuman leukocyte antigen，HLAHLA）l lHLAHLA：位于人类的第：位于人类的第6 6对染色体的短臂上，对染色体的短臂上，由由400400万个碱基组成，分万个碱基组成，分、类（复杂）类（复杂）。例例HLA HLA 类基因：类基因：HLA-A,-B,-CHLA-A,-B,-C和和-E-E-H,-X;-H,-X;HLA HLA 类基因：类基因：HLA-DP,-DQ,-DRHLA-DP,-DQ,-DR和和-DN-DN-DO-DOHLA HLA 类基因：位于类基因：位于HLA-HLA-和和的之间。的之间。关于关于HLA HLA、类分子的结构（略）。类分子的结构（略）。关于关于HLAHLA分型、应用与鉴定（后叙）。分型、应用与鉴定（后叙）。（二）T细胞识别同种异型抗原的机制直接识别直接识别 间接识别间接识别 同种异型抗原的直接识别和间接识别同种异型抗原的直接识别和间接识别l l直接识别（直接识别（direct recognition）：指受者）：指受者T细胞直接识别供者抗原递呈细胞表面的细胞直接识别供者抗原递呈细胞表面的MHC分子等。（急性、反应强）分子等。（急性、反应强）l l间接识别（间接识别（indirect recognition）：指受者）：指受者T细胞识别经过受者抗原递呈细胞加工处理细胞识别经过受者抗原递呈细胞加工处理的来源供者的来源供者MHC分子的肽。（慢性、弱）分子的肽。（慢性、弱）direct recognition对环孢素敏感对环孢素敏感 indirect recognition对环孢素不敏感对环孢素不敏感（三）移植排斥反应的效应机制1、超急性排斥反应：、超急性排斥反应：时间：几分、几时时间：几分、几时48小时小时发生机制：预存于受体的抗移植物抗体随血发生机制：预存于受体的抗移植物抗体随血 流进入移植物，通过与血管内皮流进入移植物，通过与血管内皮 细胞结合，激发一系列免疫损伤细胞结合，激发一系列免疫损伤 应答。应答。过程：补体活化过程：补体活化-血小板黏附聚集血小板黏附聚集-凝血系统凝血系统 活化活化-血栓形成血栓形成-缺血性坏死缺血性坏死 血型不符、多次妊娠、反复输血、移植过血型不符、多次妊娠、反复输血、移植过 2 2 2 2、急性排斥反应：、急性排斥反应：、急性排斥反应：、急性排斥反应：时间：数周数月内时间：数周数月内时间：数周数月内时间：数周数月内机制：机制：机制：机制：残留于供体移植物中的残留于供体移植物中的残留于供体移植物中的残留于供体移植物中的APCAPCAPCAPC对受体的对受体的对受体的对受体的 免疫系统提供最初的抗原性刺激，激免疫系统提供最初的抗原性刺激，激免疫系统提供最初的抗原性刺激，激免疫系统提供最初的抗原性刺激，激 活免疫应答（活免疫应答（活免疫应答（活免疫应答（direct pathdirect pathdirect pathdirect path）通过受体的通过受体的通过受体的通过受体的APCAPCAPCAPC对移植物抗原的识别对移植物抗原的识别对移植物抗原的识别对移植物抗原的识别 后，再刺激并激活免疫应答反应后，再刺激并激活免疫应答反应后，再刺激并激活免疫应答反应后，再刺激并激活免疫应答反应 （indirect pathindirect pathindirect pathindirect path）分类：急性体液排斥反应分类：急性体液排斥反应分类：急性体液排斥反应分类：急性体液排斥反应/急性细胞排斥反应急性细胞排斥反应急性细胞排斥反应急性细胞排斥反应1 1）急性体液排斥反应：）急性体液排斥反应：（急性脉管排斥反应），主要由抗内皮细胞（急性脉管排斥反应），主要由抗内皮细胞表面表面HLAHLA分子的抗体所介导，不引起血栓，分子的抗体所介导，不引起血栓，出现移植组织和器官的血管炎。对免疫移出现移植组织和器官的血管炎。对免疫移植剂治疗无效，被迫切除移植物。植剂治疗无效，被迫切除移植物。2 2）急性细胞排斥反应：）急性细胞排斥反应：（加速性细胞排斥反应），发生此类反应（加速性细胞排斥反应），发生此类反应患者的血液中，可以有抗供者的抗体，但患者的血液中，可以有抗供者的抗体，但不一定引发急性脉管排斥反应，却以移植不一定引发急性脉管排斥反应，却以移植组织或器官实质性损害、坏死为主，伴淋组织或器官实质性损害、坏死为主，伴淋巴细胞侵润。（巴细胞侵润。（CD8CD8+CTLCTL的细胞毒作用等）的细胞毒作用等）3 3、慢性排斥反应：、慢性排斥反应：时间：术后数月数年时间：术后数月数年机制：与免疫相关机制：与免疫相关 系急排发作致移植物退系急排发作致移植物退 行性变，由迟发超敏反行性变，由迟发超敏反 应介导的免疫炎症。应介导的免疫炎症。非免疫相关非免疫相关 局部缺血、微生物感染局部缺血、微生物感染二、移植排斥反应的类型l lHVGR（host versus graft reaction）l lGVHR（graft versus host reaction）l lHVGR指宿主对移植物攻击，排斥指宿主对移植物攻击，排斥l lGVHR指移植物中的过路指移植物中的过路T细胞对宿主细胞对宿主攻击，排斥攻击，排斥 临床上临床上HVGR多见。多见。HVGR：（一）超急性排斥反应（一）超急性排斥反应（一）超急性排斥反应（一）超急性排斥反应（48484848小时）小时）小时）小时）受者体内预存针对移植物抗体受者体内预存针对移植物抗体受者体内预存针对移植物抗体受者体内预存针对移植物抗体（二）急性排斥反应（几天（二）急性排斥反应（几天（二）急性排斥反应（几天（二）急性排斥反应（几天2 2 2 2周）周）周）周）CD4CD4CD4CD4+Th1Th1Th1Th1介导的超敏反应，介导的超敏反应，介导的超敏反应，介导的超敏反应，CD8CD8CD8CD8+CTLCTLCTLCTL毒性毒性毒性毒性 受体产生抗移植物抗体；受体产生抗移植物抗体；受体产生抗移植物抗体；受体产生抗移植物抗体；NKNKNKNK、M M M M激活激活激活激活（三）慢性排斥反应（数周、月、年）（三）慢性排斥反应（数周、月、年）（三）慢性排斥反应（数周、月、年）（三）慢性排斥反应（数周、月、年）未明了，与上述免疫学机制有关；有非特异未明了，与上述免疫学机制有关；有非特异未明了，与上述免疫学机制有关；有非特异未明了，与上述免疫学机制有关；有非特异性免疫学机制参与（感染、并发症等）性免疫学机制参与（感染、并发症等）性免疫学机制参与（感染、并发症等）性免疫学机制参与（感染、并发症等）GVHR（GVHD）l l发生的前提：发生的前提：受、供者受、供者HLAHLA型不匹配，型不匹配，移植物中存在足够量的免疫细胞（成熟移植物中存在足够量的免疫细胞（成熟T T），），受者免疫无能或极低。受者免疫无能或极低。l l移植物抗宿主反应导致移植物抗宿主病，移植物抗宿主反应导致移植物抗宿主病，临床表现为急性临床表现为急性/慢性，难以逆转死亡率高慢性，难以逆转死亡率高l lT T细胞是介导细胞是介导GVHR的主要效应细胞，去除的主要效应细胞，去除骨髓中成熟骨髓中成熟T细胞有效预防细胞有效预防GVHR的发生。的发生。三、移植中的组织配型（一）选择组织相匹配的供者（一）选择组织相匹配的供者1、一般情况（供物状态、全身情况、年龄）、一般情况（供物状态、全身情况、年龄）2、ABO血型相容（拟输血）血型相容（拟输血）3、HLA相容性（受、供者相容性（受、供者HLA等位基因相等位基因相合的数目越多越好）合的数目越多越好）（二）（二）HLA相容程度测试相容程度测试1、血清学分型、血清学分型2、细胞学分型、细胞学分型3、基因分型、基因分型1、血清学分型：、血清学分型：原理原理利用各种已知的利用各种已知的HLA标准血清型，标准血清型，与检测细胞反应，添加补体后观察与检测细胞反应，添加补体后观察 细胞反应（细胞反应（CDC）（micro-complement dependent micro-complement dependent cytotoxicitycytotoxicity）技术要点技术要点分离淋巴细胞，与标准抗血清分离淋巴细胞，与标准抗血清 反应，添加补体，死细胞染色反应，添加补体，死细胞染色 记数、判断记数、判断 评价评价较理想，标准抗血清难较理想，标准抗血清难2、细胞学分型、细胞学分型采用淋巴细胞混合培养采用淋巴细胞混合培养（MLC），分双向），分双向/单向。单向。l l双向双向MLC受、供体淋巴细胞混合体外培受、供体淋巴细胞混合体外培 养，彼此作用，观察细胞形态养，彼此作用，观察细胞形态 与细胞增殖，互不影响示受、与细胞增殖，互不影响示受、供体间供体间HLA型相匹配，否则型相匹配，否则 技术要点技术要点分离计数彼此淋巴细胞，共孵分离计数彼此淋巴细胞，共孵 育，染色计数转化细胞育，染色计数转化细胞 评价评价用于移植前的交叉配合试验，但不用于移植前的交叉配合试验，但不 能判定能判定HLA-D型型l l单向单向MLC用已处理的标准型细胞与测试用已处理的标准型细胞与测试 细胞共孵育，观察测试细胞的细胞共孵育，观察测试细胞的 反应。反应。标准型细胞为只表达标准型细胞为只表达LD抗原的细胞，经丝裂抗原的细胞，经丝裂霉素霉素C或线处理失去增殖能力，作为刺激细或线处理失去增殖能力，作为刺激细胞，与测试细胞孵育，观察测试细胞的增殖胞，与测试细胞孵育，观察测试细胞的增殖反应，称纯合子细胞分型试验（反应，称纯合子细胞分型试验（HTC）。测）。测试细胞无增殖反应示彼此相同，又称阴性分试细胞无增殖反应示彼此相同，又称阴性分型试验。型试验。当标准型细胞为只能对单倍型细胞具有识别当标准型细胞为只能对单倍型细胞具有识别而增殖的现处于静止状态的淋巴细胞，经预而增殖的现处于静止状态的淋巴细胞，经预处理后成为致敏淋巴细胞（处理后成为致敏淋巴细胞（PL），作为反应），作为反应细胞，与测试细胞孵育时，经测试细胞的刺细胞，与测试细胞孵育时，经测试细胞的刺激使激使PL转化、增殖，又称其为阳性分型试验转化、增殖，又称其为阳性分型试验（PLT）。）。HTC/PLT均为单向均为单向MLC，技术要点类同，技术要点类同双向，但有许多预处理等。双向，但有许多预处理等。评价评价实际但繁琐、技术要求高实际但繁琐、技术要求高3、基因分型、基因分型限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLPRFLP）分型）分型聚合酶链反应聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针序列特异性寡核苷酸探针 （PCR-SSOPPCR-SSOP）PCR-PCR-序列特异性引物（序列特异性引物（PCR-SSPPCR-SSP）分型）分型PCR-PCR-单链构象多态性（单链构象多态性（PCR-SSCPPCR-SSCP）分型）分型PCRPCR指纹图谱技术指纹图谱技术其他其他限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLPRFLP）分型：）分型：利用不同个体的利用不同个体的HLAHLA相应碱基序列不同，相应碱基序列不同，其内源性酶切位点不同，经同一组内切酶的其内源性酶切位点不同，经同一组内切酶的酶切反应后，出现酶切片段的个数、长短不酶切反应后，出现酶切片段的个数、长短不一（酶切图谱）。一（酶切图谱）。与已知型的比对、分与已知型的比对、分析析 用以定型。用以定型。聚合酶链反应聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针序列特异性寡核苷酸探针 （PCR-SSOPPCR-SSOP）：）：将待检细胞将待检细胞HLAHLA基因片段经基因片段经PCRPCR扩增、产扩增、产物转移至尼龙膜上，再与核素标记的特异性物转移至尼龙膜上，再与核素标记的特异性寡核苷酸探针进行杂交，寡核苷酸探针进行杂交，结合完好说明结合完好说明其基因序列相似（互补）。其基因序列相似（互补）。PCR-PCR-序列特异性引物（序列特异性引物（PCR-SSPPCR-SSP）分型：）分型：先设计特异性引物（先设计特异性引物（SSPSSP），因为此），因为此SSPSSP只能只能和相应的等位基因特异性片段的碱基序列互和相应的等位基因特异性片段的碱基序列互补结合补结合PCR-PCR-单链构象多态性（单链构象多态性（PCR-SSCPPCR-SSCP）分型：）分型：相同长度的单链相同长度的单链DNADNA，其碱基顺序不同即便只，其碱基顺序不同即便只有单个碱基不同，经不变性的中性聚丙烯胺有单个碱基不同，经不变性的中性聚丙烯胺凝胶电泳后，可反映不同的空间构象（泳动凝胶电泳后，可反映不同的空间构象（泳动速度、迁移率）。速度、迁移率）。PCRPCR指纹图谱技术：指纹图谱技术：DNADNA指纹图是指，由于不同个体的指纹图是指，由于不同个体的DNADNA具有不具有不同的分子构象，其在非变性聚丙烯胺凝胶电同的分子构象，其在非变性聚丙烯胺凝胶电泳中呈现的特异性区带图谱。泳中呈现的特异性区带图谱。操作步骤是，先分别得到供者操作步骤是，先分别得到供者/受者的受者的DNADNA指指纹图；然后将得到供者和受者的混合纹图；然后将得到供者和受者的混合DNADNA指纹指纹图，并作一致性比较分析图，并作一致性比较分析（三）交叉配型试验l l目的：检测受者体内是否存在抗供者的特目的：检测受者体内是否存在抗供者的特异性抗体以及受者对供者异性抗体以及受者对供者HLA抗原的相容抗原的相容程度。程度。l l技术要点：供者淋巴细胞技术要点：供者淋巴细胞+受者血清受者血清 （混合）供者淋巴细胞（混合）供者淋巴细胞+受者淋巴细胞受者淋巴细胞 等等等等 方法：方法：1、微量细胞毒试验，、微量细胞毒试验，2、流式细胞、流式细胞 术，术，3、混合培养，、混合培养，4、CML 四、移植排斥的免疫学防治l l移植排斥反应是根据临床表现、移植物移植排斥反应是根据临床表现、移植物功能状态、实验室多种相关检测结果的功能状态、实验室多种相关检测结果的综合性判断的。综合性判断的。l l移植排斥反应是移植失败的主因；是移移植排斥反应是移植失败的主因；是移植免疫致力克服的关键难题。植免疫致力克服的关键难题。l l关注点（一）排斥反应的监测关注点（一）排斥反应的监测 （二）排斥反应的防治（二）排斥反应的防治（一）排斥反应的监测1、细胞免疫学监测、细胞免疫学监测T T淋巴细胞数量、功能淋巴细胞数量、功能以及亚群比例等，以及亚群比例等，杀细胞活性（杀细胞活性（CTLCTL和和NKNK）。）。2 2、细胞因子监测：、细胞因子监测：Th1Th1型型/Th2/Th2型型 Th1Th1型包括型包括IL-2IL-2、TNF-aTNF-a、IFN-rIFN-r等等 Th2Th2型包括型包括IL-4IL-4、IL-10IL-10等等3 3、抗、抗HLAHLA抗体检测抗体检测4 4、蛋白、酶类、补体检测、蛋白、酶类、补体检测3、抗HLA抗体检测：l l原理：与异体排斥反应有关的体液、细胞原理：与异体排斥反应有关的体液、细胞免疫效应主要是针对免疫效应主要是针对HLA抗原的，移植抗原的，移植前所检测的包括面不够（其他抗体前所检测的包括面不够（其他抗体/群体反群体反应性抗体应性抗体(PRA)？l l群体反应性抗体群体反应性抗体(PRA)：是指器官移植受者体内的抗是指器官移植受者体内的抗HLA（特异（特异+其他），因为测得血清中其他），因为测得血清中PRA的水平更有的水平更有助于移植时受者对移植物的敏感程度。助于移植时受者对移植物的敏感程度。移植术前后的移植术前后的PRA高低与术后急性排斥反高低与术后急性排斥反应明显有关。应明显有关。（二）排斥反应的防治1、HLA配型（组织配型）配型（组织配型）2、免疫抑制剂、免疫抑制剂3、移植耐受的诱导、移植耐受的诱导4、移植物等的预处理、移植物等的预处理1、HLA配型配型 越接近，成功率越高。越接近，成功率越高。HLA配型应包括对配型应包括对HLA-类分子和其类分子和其类分子的配型。尤其类分子的配型。尤其类分子的匹配与类分子的匹配与否，更关系到移植物能否长期存活问题。否，更关系到移植物能否长期存活问题。HLA的配型包括的配型包括HLA交叉配型、预存抗交叉配型、预存抗体的检测。体的检测。交叉配型包括淋巴细胞间、交叉配型包括淋巴细胞间、T细胞淋巴细细胞淋巴细胞毒性间、胞毒性间、B细胞淋巴细胞毒性间、流式细细胞淋巴细胞毒性间、流式细胞法、自身等。胞法、自身等。2、免疫抑制剂、免疫抑制剂 1）药物）药物:皮质类固醇皮质类固醇 细胞增殖抑制剂（霉酚酸酯；细胞增殖抑制剂（霉酚酸酯；MMF）抑制抑制T细胞活化（环孢素；细胞活化（环孢素；CsA）（普乐可复；（普乐可复；FK605）2）抗体：）抗体：抗淋巴细胞、抗胸腺细胞、抗抗淋巴细胞、抗胸腺细胞、抗CD3等等 3）输血：）输血：与活化与活化Ts细胞、产生封闭抗体等细胞、产生封闭抗体等3 3、移植耐受的诱导：、移植耐受的诱导：、移植耐受的诱导：、移植耐受的诱导：1 1）照射：）照射：）照射：）照射：X X线照射（全淋巴照射线照射（全淋巴照射线照射（全淋巴照射线照射（全淋巴照射-细胞破坏）细胞破坏）细胞破坏）细胞破坏）紫外线照射（灭活传递细胞功能，活化紫外线照射（灭活传递细胞功能，活化紫外线照射（灭活传递细胞功能，活化紫外线照射（灭活传递细胞功能，活化 TsTs）2 2）药物：）药物：）药物：）药物：环磷酰胺、环孢霉素环磷酰胺、环孢霉素环磷酰胺、环孢霉素环磷酰胺、环孢霉素A A等，诱导免疫耐等，诱导免疫耐等，诱导免疫耐等，诱导免疫耐 受可能与诱导受可能与诱导受可能与诱导受可能与诱导TsTs细胞增生有关。细胞增生有关。细胞增生有关。细胞增生有关。3 3）抗体：）抗体：）抗体：）抗体：抗淋巴细胞血清、抗抗淋巴细胞血清、抗抗淋巴细胞血清、抗抗淋巴细胞血清、抗T T细胞表面分子抗细胞表面分子抗细胞表面分子抗细胞表面分子抗 体，使得体，使得体，使得体，使得T T细胞等无能细胞等无能细胞等无能细胞等无能4、移植物等的预处理、移植物等的预处理 1 1）移植物的预处理：）移植物的预处理：不同组织器官的移植，其移植物的处不同组织器官的移植，其移植物的处理不尽相同（外科修整、动脉灌洗）。理不尽相同（外科修整、动脉灌洗）。动脉灌洗，清除残留于待移植器官内动脉灌洗，清除残留于待移植器官内的血液及细胞成分，尤其是免疫细胞（过的血液及细胞成分，尤其是免疫细胞（过客细胞），以防止过客细胞导致的客细胞），以防止过客细胞导致的GVHRGVHR。用灌洗液前例腺素用灌洗液前例腺素E1E1、硫酸镁、硫酸镁、CollinsCollins液；或添加抗体液；或添加抗体 2 2）受体的准备（略）受体的准备（略）五、干细胞移植l l干细胞指人体中尚未发育的原始细胞，干细胞指人体中尚未发育的原始细胞，干细胞指人体中尚未发育的原始细胞，干细胞指人体中尚未发育的原始细胞，具有具有具有具有“树干树干树干树干”和和和和“根源根源根源根源”的双重意义。的双重意义。的双重意义。的双重意义。干细胞的定向分化干细胞的定向分化l l干细胞的发育受多种内在机制和微环境因干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。体外经一定条件可使其定向分素的影响。体外经一定条件可使其定向分化化细胞、组织、器官等。细胞、组织、器官等。l l干细胞种类：胚胎指受精卵分裂发育成干细胞种类：胚胎指受精卵分裂发育成 囊胚时的内层细胞团（全能囊胚时的内层细胞团（全能 性）。性）。成体指成年动物中某些具成体指成年动物中某些具 再生、修复能力的干细胞。再生、修复能力的干细胞。l l干细胞移植的临床应用：干细胞移植的临床应用：1、作为种子细胞，用于细胞治疗或组织细、作为种子细胞，用于细胞治疗或组织细胞替代治疗。胞替代治疗。2、研究胚胎发育的调控机制、研究胚胎发育的调控机制3、作为疾病基因治疗的理想载体、作为疾病基因治疗的理想载体4、用于药物筛选和新药开发、用于药物筛选和新药开发5、催生了细胞性心肌成形术、催生了细胞性心肌成形术六、移植排斥的特殊免疫学问题l l指跨物种间的移植（异种移植），解决指跨物种间的移植（异种移植），解决供体器官的同时，强烈的排斥反应供体器官的同时，强烈的排斥反应（一）异种间移植的排斥反应（一）异种间移植的排斥反应 1、特性：、特性：、2、类型（附图）、类型（附图）3、预防：、预防：脾切除，脾切除，阻断补体活阻断补体活 性，性，吸附除去天然抗体吸附除去天然抗体 （二）骨髓移植的排斥反应（二）骨髓移植的排斥反应（一）异种间移植的排斥反应 1、特性：、特性：、细胞表面、细胞表面“异物异物”更多更多 、急性血管性排斥反应、急性血管性排斥反应 、加速性细胞排斥反应、加速性细胞排斥反应 、受者体内本存抗体，可促进、受者体内本存抗体，可促进 ADCCADCC的发生与发展的发生与发展 、异种间的免疫障碍大于同种、异种间的免疫障碍大于同种 2、类型（附图）、类型（附图）l l协调性协调性(concordant):指属异种，但种属比指属异种，但种属比较近的异种移植排斥；非协调性较近的异种移植排斥；非协调性(discordant):指异种移植排斥发生在种系指异种移植排斥发生在种系间较远的。间较远的。l l根据参与反应发生的的机制不同，根据参与反应发生的的机制不同，协调性协调性容易型容易型/困难型困难型 非协调性非协调性抗体介导型抗体介导型/补体介导型补体介导型协调性与非协调性区别：前者为诱导型抗体协调性与非协调性区别：前者为诱导型抗体 后者为天然型抗体后者为天然型抗体l l3、预防：、预防：脾切除，脾切除，阻断补体活性，阻断补体活性，吸附除去天然抗体吸附除去天然抗体（二）骨髓移植的排斥反应l l同种异基因（异体）骨髓移植用于治疗白血病、同种异基因（异体）骨髓移植用于治疗白血病、同种异基因（异体）骨髓移植用于治疗白血病、同种异基因（异体）骨髓移植用于治疗白血病、再障等，目前面临两大主要问题：再障等，目前面临两大主要问题：再障等，目前面临两大主要问题：再障等，目前面临两大主要问题：1 1 1 1、白血病的复发、白血病的复发、白血病的复发、白血病的复发2 2 2 2、移植物抗宿主反应（、移植物抗宿主反应（、移植物抗宿主反应（、移植物抗宿主反应（GVHRGVHRGVHRGVHR）GVHRGVHRGVHRGVHR定义（略）定义（略）定义（略）定义（略）GVHRGVHRGVHRGVHR发生原因（略）发生原因（略）发生原因（略）发生原因（略）GVHRGVHRGVHRGVHR发生机制（初）：发生机制（初）：发生机制（初）：发生机制（初）：CD4CD4CD4CD4+Th1/Th2Th1/Th2Th1/Th2Th1/Th2 CD8 CD8 CD8 CD8+Tc1/Tc2Tc1/Tc2Tc1/Tc2Tc1/Tc2 NK NK NK NK、单核、粒细胞等、单核、粒细胞等、单核、粒细胞等、单核、粒细胞等慢性慢性慢性慢性GVHRGVHRGVHRGVHR被视为一种自身免疫病。被视为一种自身免疫病。被视为一种自身免疫病。被视为一种自身免疫病。七、排斥反应的免疫学检验（一）体液免疫水平的检测（一）体液免疫水平的检测 检测指标检测指标ABOABO血型、其他血型、抗血型、其他血型、抗HLAHLA抗抗体及供者组织细胞抗体、血管内皮、细胞体及供者组织细胞抗体、血管内皮、细胞抗体、冷凝集素抗体等。抗体、冷凝集素抗体等。测定方法（略）测定方法（略）（二）细胞免疫水平检测（二）细胞免疫水平检测 检测指标检测指标参与细胞免疫有关的细胞数量、参与细胞免疫有关的细胞数量、功能和产生细胞因子水平。功能和产生细胞因子水平。检测手段检测手段外周血外周血T T细胞及其亚类的计数细胞及其亚类的计数 T T细胞转化试验（细胞转化试验（4h4h）NKNK细胞活性测定细胞活性测定 血清细胞因子的测定血清细胞因子的测定 黏附分子及其配体的检测黏附分子及其配体的检测（三）补体水平的检测（三）补体水平的检测 检测指标检测指标补体成分（补体成分（C1qC1q）、其裂解产物）、其裂解产物 （C3aC3a）及总补体活性（）及总补体活性（CH50CH50）检测方法（略）检测方法（略）（四）急性时相反应物质的检测（四）急性时相反应物质的检测 检测指标检测指标C C反应蛋白、反应蛋白、TNF-aTNF-a、IL-1IL-1、-6-6 检测方法（略）检测方法（略）八、移植后药物浓度的检测l l为什么要进行药物浓度监测为什么要进行药物浓度监测l l如何进行药物浓度监测如何进行药物浓度监测 1）药物浓度监测的临床指征）药物浓度监测的临床指征 2）药物浓度监测的目的）药物浓度监测的目的 3）药物监测的种类与方法）药物监测的种类与方法 4）药物浓度监测的要点）药物浓度监测的要点治疗药物监测的临床意义一治疗药物检测的概念一治疗药物检测的概念 治疗药物监测是指临床生化实验室通治疗药物监测是指临床生化实验室通过理化方法测定病人体液中药物浓度，过理化方法测定病人体液中药物浓度，对病人施行个体化的治疗方案以保证较对病人施行个体化的治疗方案以保证较好的治疗效果和较高的安全性的一种措好的治疗效果和较高的安全性的一种措施。施。药物浓度监测的缺点药物浓度监测的缺点l l费用昂贵l l影响因素复杂需进行监测的常见药物呋塞米（速尿）呋塞米（速尿）利尿药利尿药环孢素、环孢素、FK506FK506、MPAMPA、雷帕霉素雷帕霉素免疫抑制剂免疫抑制剂甲氯蝶呤甲氯蝶呤等等抗恶性肿瘤药抗恶性肿瘤药庆大霉素庆大霉素、链霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉、链霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素等素、氯霉素等抗生素抗生素阿司匹林、对乙酰氨基酚阿司匹林、对乙酰氨基酚解热镇痛药解热镇痛药碳酸锂碳酸锂抗躁狂症药抗躁狂症药丙咪嗪、阿米替林、去甲替林等丙咪嗪、阿米替林、去甲替林等抗抑郁药抗抑郁药氨茶碱氨茶碱平喘药平喘药普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔受体阻断剂受体阻断剂苯妥因铵、苯巴比妥苯妥因铵、苯巴比妥、乙琥胺、乙琥胺、卡马西平卡马西平、丙戊酸钠丙戊酸钠抗癫痫药抗癫痫药利多卡因利多卡因、普鲁卡因胺、奎尼丁、乙胺碘呋、普鲁卡因胺、奎尼丁、乙胺碘呋酮、因卡胺、异丙吡胺等酮、因卡胺、异丙吡胺等抗心律失常药抗心律失常药地高辛、地高辛、洋地黄毒苷洋地黄毒苷强心甙强心甙药品药品分分 类类移植和免疫抑制剂的应用移植和免疫抑制剂的应用l l1596159615961596年年年年，意意意意大大大大利利利利外外外外科科科科医医医医生生生生成成成成功功功功进进进进行行行行最最最最早早早早一一一一次次次次成成成成功功功功的的的的自体组织移植自体组织移植自体组织移植自体组织移植.l l19191919世纪初，尝试异体皮肤移植世纪初，尝试异体皮肤移植世纪初，尝试异体皮肤移植世纪初，尝试异体皮肤移植,但因排斥而失败。但因排斥而失败。但因排斥而失败。但因排斥而失败。l l1940194019401940年，年，年，年，MedewarMedewarMedewarMedewar证实了证实了证实了证实了同种异体移植排斥同种异体移植排斥同种异体移植排斥同种异体移植排斥是一种是一种是一种是一种免疫现象免疫现象免疫现象免疫现象.l l1954195419541954年，美国医生年，美国医生年，美国医生年，美国医生MurrayMurrayMurrayMurray在单卵双生姐妹间进行肾在单卵双生姐妹间进行肾在单卵双生姐妹间进行肾在单卵双生姐妹间进行肾移植获得成功。移植获得成功。移植获得成功。移植获得成功。l l 1962196219621962年，应用年，应用年，应用年，应用HLAHLAHLAHLA分型技术选择合适的供体，第一分型技术选择合适的供体，第一分型技术选择合适的供体，第一分型技术选择合适的供体，第一次用无亲缘关系的供体肾进行异体移植，获得成功。次用无亲缘关系的供体肾进行异体移植，获得成功。次用无亲缘关系的供体肾进行异体移植，获得成功。次用无亲缘关系的供体肾进行异体移植，获得成功。l l80808080年年年年代代代代初初初初，由由由由于于于于环环环环孢孢孢孢素素素素A A A A等等等等应应应应用用用用，明明明明显显显显提提提提高高高高了了了了器器器器官官官官移植的成功率，器官移植已广泛应用于临床。移植的成功率，器官移植已广泛应用于临床。移植的成功率，器官移植已广泛应用于临床。移植的成功率，器官移植已广泛应用于临床。免疫抑制剂的发展免疫抑制剂的发展l l19601960年前，硫唑嘌呤年前，硫唑嘌呤l l19631963年，去氢氢化可的松年，去氢氢化可的松l l19681968年，抗胸腺细胞球蛋白年，抗胸腺细胞球蛋白l l19781978年，年，CSACSAl l19921992年，年，FK506FK506l l19991999年，重组抗年，重组抗CD3CD3阳性细胞单抗阳性细胞单抗l l20022002年，雷帕霉素年，雷帕霉素l l20042004年，依罗莫司年，依罗莫司免疫抑制剂的发展免疫抑制剂的发展l l其它有发展前景的药物 康乐霉素C 布列奎钠（BQR）来氟米特和同类物（MNA）CTLA41g药物监测的种类与方法l l方法（常见）：方法（常见）：l l荧光偏振免疫分析（荧光偏振免疫分析（FPIA）l l微粒子荧光免疫分析（微粒子荧光免疫分析（MEIA）l l1 1、竞争法原理、竞争法原理,检测抗原检测抗原.2 2、与荧光标记、与荧光标记抗原竞争结合抗抗原竞争结合抗体体.3 3、大小分子的、大小分子的不同旋转速度改不同旋转速度改变偏振光方向变偏振光方向.4 4、偏振光的改、偏振光的改变与被检测药物变与被检测药物浓度有关浓度有关.微粒子荧光免疫分析法(MEIA)原理ELISA原理：MPA 全球质控全球质控l l环孢霉素环孢霉素环孢霉素环孢霉素 作用机制作用机制作用机制作用机制抑制抑制T T细胞活化细胞活化 由肝内由肝内 CytCyt P-450 P-450进行代谢进行代谢.25 25 已知的代谢产物已知的代谢产物.代谢产物大部分无活性代谢产物大部分无活性.CsACsA的检测的检测:l l测量钙调蛋白（测量钙调蛋白（测量钙调蛋白（测量钙调蛋白（CalcineurinCalcineurinCalcineurinCalcineurin）的活动）的活动）的活动）的活动在临床中不太可能在临床中不太可能在临床中不太可能在临床中不太可能l l测量曲线下面积（测量曲线下面积（测量曲线下面积（测量曲线下面积（AUCAUCAUCAUC）必须要必须要必须要必须要12 12 12 12 血液样本血液样本血液样本血液样本 不太实际不太实际不太实际不太实际l l测量测量测量测量C2(or C3 or C4)C2(or C3 or C4)C2(or C3 or C4)C2(or C3 or C4)作为作为作为作为AUCAUCAUCAUC的指标的指标的指标的指标只对诺华的新山地明有效只对诺华的新山地明有效只对诺华的新山地明有效只对诺华的新山地明有效(吸收图吸收图吸收图吸收图!)!)!)!)需要注意有吸收慢的病人需要注意有吸收慢的病人需要注意有吸收慢的病人需要注意有吸收慢的病人需要保证时间准确需要保证时间准确需要保证时间准确需要保证时间准确 (2h+/-10 min)(2h+/-10 min)(2h+/-10 min)(2h+/-10 min)l l测量测量测量测量C0 C0 C0 C0 值值值值 (谷值谷值谷值谷值)最常用最常用最常用最常用对于所有环孢霉素都容易操作对于所有环孢霉素都容易操作对于所有环孢霉素都容易操作对于所有环孢霉素都容易操作患者对新山地明的吸收情况l峰值基本上在服药后峰值基本上在服药后1-21-2小时之间，但也有少部分在小时之间，但也有少部分在3434小时小时他克莫司(FK506)l l1994 1994 获获获获FDAFDA批准批准批准批准l l 从从从从土壤真菌提取的一种大环土壤真菌提取的一种大环土壤真菌提取的一种大环土壤真菌提取的一种大环内酯类抗生素内酯类抗生素内酯类抗生素内酯类抗生素 l l 商品名商品名商品名商品名:普乐可复普乐可复普乐可复普乐可复(藤泽藤泽藤泽藤泽)l l 全球销售额全球销售额全球销售额全球销售额$4$4亿亿亿亿 /年年年年l l 对对对对T T细胞有选择性的抑制作用细胞有选择性的抑制作用细胞有选择性的抑制作用细胞有选择性的抑制作用 l l 主要由肝内主要由肝内主要由肝内主要由肝内 CytCyt P-450 P-450进行代进行代进行代进行代谢谢谢谢l l 8 8 种特异的代谢产物种特异的代谢产物种特异的代谢产物种特异的代谢产物l l 只有只有只有只有 MIIMII代谢物有代谢物有代谢物有代谢物有100%100%的活的活的活的活性性性性l l 代谢物可以在循环系统中快代谢物可以在循环系统中快代谢物可以在循环系统中快代谢物可以在循环系统中快速速速速除去除去除去除去霉酚酸（）l l19951995年获美国年获美国年获美国年获美国FDAFDA批准批准批准批准l l 是从青霉素菌中获得是从青霉素菌中获得是从青霉素菌中获得是从青霉素菌中获得 l l 商品名商品名商品名商品名:骁悉骁悉骁悉骁悉(Roche),(Roche),MyforticMyfortic(NovartisNovartis)l l 全球销售全球销售全球销售全球销售$1 billion annually$1 billion annuallyl l 可以检测血浆浓度可以检测血浆浓度可以检测血浆浓度可以检测血浆浓度-谷值谷值谷值谷值-简单简单简单简单 AUC(3AUC(3点法点法点法点法)-游离游离游离游离 MPAMPAl l 只有一种商业的免疫检测方法只有一种商业的免疫检测方法只有一种商业的免疫检测方法只有一种商业的免疫检测方法 小小 结结 按照按照按照按照“免疫抑制剂使用指导意见免疫抑制剂使用指导意见免疫抑制剂使用指导意见免疫抑制剂使用指导意见”推荐推荐推荐推荐检测采用全血（检测采用全血（检测采用全血（检测采用全血（CSACSA、FK506FK506、RAPARAPA）选择更特异的方法选择更特异的方法选择更特异的方法选择更特异的方法对某一检测方法的理解和掌握比方法的对某一检测方法的理解和掌握比方法的对某一检测方法的理解和掌握比方法的对某一检测方法的理解和掌握比方法的 选择更重要选择更重要选择更重要选择更重要 方法更替时应有完备的方法学考评方法更替时应有完备的方法学考评方法更替时应有完备的方法学考评方法更替时应有完备的方法学考评总是在同一条件下采血（谷值、峰值、空腹）总是在同一条件下采血（谷值、峰值、空腹）总是在同一条件下采血（谷值、峰值、空腹）总是在同一条件下采血（谷值、峰值、空腹）应参加室间质评应参加室间质评应参加室间质评应参加室间质评小小 结结 TAT时间的控制时间的控制 发展新方法的必要性发展新方法的必要性 大型实验室应加强HPLC-MS/MS的研究和应用，以切实解决监测费用昂贵问题Thank You!