《紫杉醇的发酵培养》PPT课件

肿 瘤 是 一 类 严 重 威 胁 人 们 生 命 和 生 活质 量 的 重 大 和 主 要 疾 病 。 我 国 国 内 每 年 新发 生 癌 症 患 者 160 万 人 , 并 有 130 万 人 死于 癌 症 。 发 达 国 家 美 、 欧 、 日 等 每 年 新 增的 癌 症 患 者 达 400 万 人 左 右 , 全 世 界 癌 症死 亡 人 数 每 年 达 630 万 人 。 长 期 以 来 , 寻找 抗 癌 生 物 资 源 与 天 然 药 物 成 为 各 国 医 药 、化 学 及 生 物 学 家 的 一 个 共 同 愿 望 。 美 国 西 部 山 区 有 一 片 红 豆 杉 林 ， 山 林 中 有 一 个 小 村 镇 ， 住着 2000多 居 民 。 这 个 小 村 镇 虽 然 不 大 ， 却 以 长 寿 而 闻 名 美 国 。小 村 镇 里 ， 寿 命 最 短 的 人 都 活 到 95岁 以 上 ， 绝 大 多 数 人 的 寿 命都 在 100岁 以 上 ， 百 岁 寿 星 处 处 可 见 ！ 这 则 新 闻 吸 引 了 不 少科 学 家 的 目 光 ， 纷 纷 到 这来 考 察 ， 然 而 他 们 并 没 有发 现 这 里 人 的 奇 异 之 处 ，饮 食 生 活 与 其 他 地 区 人 群并 无 太 大 差 别 。 仔 细 观 察以 后 ， 发 现 这 里 的 居 民 有两 个 与 红 豆 杉 有 关 的 生 活习 惯 ， 一 是 他 们 好 采 摘 红豆 杉 树 叶 泡 茶 喝 ;二 是 经常 到 红 豆 杉 树 林 中 散 步 或者 运 动 。 这 种 现 象 引 起 了 科 学 家 的 极 大 兴 趣 。经 过 不 懈 努 力 ， 美 国 施 宝 贵 公 司 于 1992年从 红 豆 杉 中 提 取 出 天 然 抗 癌 物 质 紫 杉 醇 。接 着 ， 英 国 、 俄 罗 斯 、 韩 国 和 中 国 的 科 研人 员 也 都 从 中 提 取 出 这 种 珍 贵 的 药 物 。 但 是 ， 人 们 发 现 紫 杉 醇 具 有 独 特 的抗 肿 瘤 作 用 ， 能 够 显 著 地 抑 制 肿 瘤 生 长 ，对 晚 期 卵 巢 癌 、 乳 腺 癌 、 非 小 细 胞 肺 癌 、卡 波 济 肉 瘤 等 疗 效 确 切 ， 而 且 副 作 用 很小 。 当 世 界 各 国 都 为 无 法 攻 克 癌 症 而 焦灼 的 时 候 ， 红 豆 杉 中 紫 杉 醇 的 发 现 像 一棵 救 命 的 灵 芝 草 ， 给 癌 症 患 者 带 来 了 生的 希 望 。 副 作 用 紫 杉 醇 的 抗 癌 机 理 紫 杉 醇 能 选 择 性 地 与 微 管 蛋 白 结 合 , 促 进微 管 蛋 白 双 聚 体 聚 合 为 多 聚 体 。 对 迅 速 分 裂的 肿 瘤 细 胞 ,紫 杉 醇 冻 结 有 丝 分 裂 纺 锤 体 , 从而 使 有 丝 分 裂 停 止 在 G2 期 和 M 期 , 阻 止 了癌 细 胞 的 快 速 繁 殖 直 至 死 亡 。 作 用 于 巨 噬 细胞 上 的 肿 瘤 坏 死 因 子 ( TNF) 受 体 , 促 使 释放 白 细 胞 介 质 IL21 、 TNF22 、 IL26 、 干扰 素 ( IFN) 21 、 IFN22 , 对 肿 瘤 细 胞 杀伤 或 抑 制 作 用 ; 诱 导 肿 瘤 细 胞 凋 亡 。 除 此 以 外 ， 随 着 科 学 技 术 的 不 断 发展 ， 紫 杉 醇 的 新 用 途 也 被 不 断 发 现 。 据 欧 洲 医 生 杂 志 报 道 ， 紫 杉 醇 对 多 种 慢性 顽 症 有 较 好 的 治 疗 作 用 ， 比 如 进 行 性 硬化 症 、 风 湿 性 关 节 炎 、 牛 皮 癣 、 湿 疹 等 ，治 疗 效 果 都 不 错 。 随 着 时 间 的 推 移 ， 紫 杉醇 的 用 途 进 一 步 被 人 们 所 认 识 ， 其 治 疗 适用 范 围 还 会 扩 大 。 紫 杉 醇 具 有 如 此 神 奇 的 作 用 ， 本 应 该 进 行 大 面积 、 大 量 开 发 红 豆 杉 。 然 而 ， 不 容 乐 观 的 是 ，全 世 界 每 年 紫 杉 醇 的 产 量 都 在 300千 克 以 下 ，因 为 红 豆 杉 是 濒 临 灭 绝 的 珍 稀 植 物 ， 是 第 三 纪冰 川 期 遗 留 下 来 的 。 加 之 紫 杉 醇 在 树 皮 中 的 含 量 极 低 ,仅 为 干 重 的0.101 % 0.106 % ,且 生 长 缓 慢 ,植 株 成 熟 约需 100 年 。 约 3 6棵 100 年 左 右 的 红 豆 杉 树 皮才 能 提 取 出 用 于 治 疗 一 个 癌 症 病 人 所 需 求 的 紫杉 醇 。 因 此 ,紫 杉 醇 来 源 仍 将 成 为 该 药 长 期 供应 的 关 键 制 约 因 素 . 人们想到了一些方法 人 们 从 T.Media“ Hicksii” 和T.Media“ Hill ” 这 两 种 植 物 的 根 中提 取 到 紫 杉 醇 ， 含 量 红 豆 杉 属 植 物 的4 倍 ， 但 是 大 田 种 植 ,3 年 才 能 收 割一 次 ， 不 太 理 想 。打 破 休 眠 扦 插 植 物 中 提 取 快 速 繁 殖 方 法 全 合 成 Wender 的 逆 合 成 分 析 巨 大 的 社 会 效 益 、 经 济 效 益 和 极 为 重 要 的 学 术 价值 吸 引 了 全 球 范 围 内 的 40 多 个 一 流 的 研 究 小 组从 事 紫 杉 醇 的 全 合 成 工 作 . Mukaiyama 的 逆 合 成 分 析 1994 年 初 ,Holto和 Nicolaou 几 乎 同 时 宣 告紫 杉 醇 的 全 合 成 获 得 成 功 . 二 者 的 全 合 成 工 作完 成 的 十 分 出 色 ,但 合 成 路 线 均 太 长 ,且 中 间 步骤 的 收 率 又 相 差 很 大 ,导 致 紫 杉 醇 的 最 终 收 率均 很 低 . 最 高 只 能 达 到 2. 7 % ， 目 前 来 看 ,紫 杉 醇 的 化 学 全 合 成 还 仅 具 有 研 究 意 义 ,缺 少商 业 价 值 . 部 分 合 成 法 （ 半 合 成 法 ） 10 - 去 乙 酰 巴 卡 亭 ， 可 从 天 然 红 豆 杉 针 叶 中 以 0. 1 %的 含 量分 离 得 到 ,为 化 学 半 合 成 提 供 了 较 丰 富 的 原 料 。 紫 杉 醇 的 半 合 成 方 法已 比 较 成 熟 ,国 外 已 用 半 合 成 法 生 产 紫 杉 醇 。离 体 细 胞 培 养 法细 胞 系 诱 导 子 农 杆 菌 Ti 和 Ri 质 粒 介 导 愈 伤 组 织 褐 化发 酵 培 养 法 首 先 ， 看 看 微 生 物 发 酵 工 程 与 医 药 及 我们 生 活 的 关 系1、 抗 生 素 自 1929年 英 国 人 发 现 青 霉 菌 分 泌 青 霉 素 能 抑 制 葡萄 球 菌 生 长 以 后 ， 相 继 发 现 了 链 霉 素 、 氯 霉 素 、 金 霉素 、 土 霉 素 、 四 环 素 、 新 霉 素 和 红 霉 素 等 抗 菌 素 .在近 几 十 年 内 ， 抗 生 素 的 研 究 又 有 了 飞 速 的 发 展 ， 已 找到 的 抗 生 素 有 数 千 种 ， 其 中 具 有 临 床 效 果 并 已 利 用 发酵 法 大 量 生 产 和 广 泛 应 用 的 多 达 百 余 种 . 2、 维 生 素 类 药 物 维 生 素 作 为 六 大 生 命 要 素 之 一 ， 为 整 个 生 命 活 动 所 必需 .VA的 前 体 -胡 萝 卜 素 及 VC和 VE均 为 抗 氧 化 剂 ， 能保 护 人 体 组 织 的 过 氧 化 损 伤 并 提 高 机 体 免 疫 力 ， 有 抗癌 、 抗 心 血 管 疾 病 和 白 内 障 等 功 能 . 就 拿 Vc为 例 ， Vc的 微 生 物 发 酵 法 早 已 取 得 重 要 突 破 ，利 用 “ 大 小 菌 落 ” 菌 株 混 合 培 养 生 产 VC的 工 艺 已 经 成熟 ， 进 入 产 业 化 .目 前 利 用 氧 化 葡 萄 糖 杆 菌 与 一 种 蜡状 芽 孢 杆 菌 混 合 菌 共 固 定 化 发 酵 技 术 ， 可 将 Vc的 收 率提 高 到 80%以 上 ， 生 产 周 期 比 传 统 工 艺 缩 短 1/3. 3、 医 用 酶 制 剂 目 前 ， 我 国 每 年 约 有 60万 人 死 于 冠 心 病 ， 约120万 人 死 于 脑 梗 塞 、 脑 溢 血 ， 而 美 国 每 年 约有 15万 人 死 于 中 风 ， 约 80%的 病 例 是 由 于 阻 止血 液 流 向 大 脑 的 血 凝 块 引 起 而 导 致 突 发 性 死 亡 ，而 通 过 微 生 物 可 以 大 量 生 产 出 高 浓 度 和 活 力 的溶 栓 酶 ， 并 且 成 本 很 低 。 4、 多 烯 脂 肪 酸多 烯 脂 肪 酸 ， 如 -亚 麻 酸 (GLA)和 二 十 二 碳 六 烯酸 （ DHA） ， 是 人 体 不 能 合 成 而 又 必 需 的 多 烯 脂 肪 酸缺 乏 时 会 导 致 机 体 代 谢 的 紊 乱 而 引 起 多 种 疾 病 ， 如 高血 压 、 糖 尿 病 、 癌 症 、 病 毒 感 染 以 及 皮 肤 老 化 等 . 海 洋 中 有 一 种 繁 殖 力 很 强 的 网 粘 菌 SR21， 其 干 菌体 DHA含 量 为 30% 40%， 可 通 过 发 酵 生 产 DHA， 每 升 培养 液 产 量 为 4.5g。 一 、 原 理 ：人 们 发 现 红 豆 杉 内 生 真 菌 也 能 产 紫 杉醇 ， 这 无 疑 为 解 决 紫 杉 醇 药 源 危 机 提供 了 一 种 新 的 途 径 。 二 、 方 法 将 树 皮 洗 净 ,用 75 %酒 精 浸 泡 5 10 min 进行 表 面 消 毒 ,再 用 无 菌 水 冲 洗 ,然 后 剪 切 成 长 宽 为 1 cm 1 cm 的 小 块 , 接 种 于 琼 脂 培 养基 上 , 于 (24 1) 培 养 。 待 树 皮 表 面 长 出菌 丝 后 ,挑 取 其 菌 丝 尖 端 ,进 行 稀 释 ,接 种 到PDA 培 养 基 上 ,使 每 个 培 养 皿 长 出 1 3 个 菌落 ,连 续 继 代 纯 化 8 次 以 上 ,得 到 纯 化 菌 株 。1) 内 生 真 菌 的 分离 多 样 性 图 1 分 离 到 的 内 生 真 菌 菌 落 IBPC Z3S 菌 株 IBPC Z3S 在 PDA 培 养 基 上 菌 落 轮 纹 明 显 ,内 层黑 褐 色 ,边 缘 白 色 ,铺 展 、 致 密 、 圆 形 ,边 缘 整 齐 ,7 d 后出 现 辐 射 状 沟 纹 。 图 2 IBPC Z3S 菌 株 菌 丝 形 态 特 征菌 丝 无 色 ,分 枝 ,具 有 横 隔 膜 。 菌 丝 生 长 较 快 ,5 d后 直 径 达62m。 孢 子 丰 富 ,分 生 孢 子 穗 炭 黑 色 ,圆 形 呈 放 射 状 。 分 生孢 子 梗 无 色 或 呈 现 黄 褐 色 ,光 滑 ,分 生 孢 子 小 ,球 形 ,壁 上 有 刺纹 。 2) 内 生 真 菌 的 培 养: 液 体 培 养 基 ， 将 纯化 菌 株 接 种 到 液 体 培 养 基 中 培 养种 子 菌 ,3 d 后 ,取 5 mL 液 体 种子 菌 转 入 发 酵 罐 中 发 酵 。 ： 2.8L 和 10L 小 罐 发 酵 方 法 ：以 3%接 种 量 将 种 子 培 养 液 接 入 已 灭 菌(2.8L 小 罐 进 行 实 罐 灭 菌 ,10L 罐 先 空 消 ,再 用 无 菌 压 缩 空 气 吹 干 后 加 入 灭 过 菌 的 培养 基 )、 冷 却 的 发 酵 培 养 基 中 ， 200 r/ min ， 28 通 风 培 养 1618d， 定 期 测 定发 酵 液 中 紫 杉 醇 含 量 、 生 物 量 、 总 糖 和pH 值 。 3) 紫 杉 醇 提 取 方 法 发 酵 液 过 滤 ， 滤 渣 烘 干 （ 低 于 50 ） ，滤 液 称 量 体 积 。 滤 渣 用 适 量 乙 酸 乙 酯 萃 取 ， 滤液 用 1/2 滤 液 体 积 的 乙 酸 乙 酯 萃 取 ， 下 层 水层 再 用 乙 酸 乙 酯 萃 取 一 次 ， 合 并 乙 酸 乙 酯 ， 减压 蒸 干 。 用 适 量 甲 醇 洗 涤 减 压 蒸 干 的 固 体 ， 加入 乙 酸 乙 酯 和 水 1 1 (V/V)再 进 行 萃 取 ， 将收 集 的 乙 酸 乙 酯 进 行 减 压 蒸 干 ， 用 一 定 量 的 乙腈 溶 解 固 体 ， 0 密 封 保 存 。 超 临 界 CO2提 取 法（ SFT法 ） 超 临 界 流 体 萃 取 技 术 是 近 代 化 工 分 离 中 的 一 种 新 型 分 离 技 术 ， 超 临 界CO2萃 取 是 采 用 CO2作 溶 剂 ， 超 临 界 状 态 下 的 CO2流 体 密 度 和 介 电 常 数较 大 ， 对 物 质 溶 解 度 很 大 ， 并 随 压 力 和 温 度 的 变 化 而 急 剧 变 化 ， 因 此 ，不 仅 对 某 些 物 质 的 溶 解 度 有 选 择 性 ， 且 溶 剂 和 萃 取 物 非 常 容 易 分 离 。 超临 界 CO2萃 取 特 别 适 用 于 脂 溶 性 ， 高 沸 点 ， 热 敏 性 物 质 的 提 取 ， 同 时 也适 用 于 不 同 组 分 的 精 细 分 离 ， 即 超 临 界 精 镏 。 用 超 临 界 CO2作 溶 剂 对 生物 、 食 品 、 药 物 等 许 多 产 物 的 提 取 和 纯 化 。 4) 紫 杉 醇 的 鉴 定 薄 膜 层 析 ， 取 标 准 品 紫 杉 醇 溶 液 2L ,样 品 溶 液 10L ,分 别 点 样 于 硅 胶 板 上 ,置于 层 析 缸 中 展 开 ,晾 干 ,喷 雾 显 色 。 观 察斑 点 的 大 小 、 位 置 和 颜 色 ,目 测 估 计 紫 杉醇 及 紫 杉 烷 类 化 合 物 的 含 量 。 同 样 ， 还可 以 用 紫 外 吸 收 法 或 HPLC测 定 紫 杉 醇 的含 量 菌 株 的 最 高 产 率 约 为 1 mg/ L 5) 优 化 研 究 培 养 基 组 成 和 培 养 条 件 对 紫 杉 醇 产量 的 影 响 。l碳 源 的 影 响选 用 葡 萄 糖 、 蔗 糖 、 麦 芽 糖 和 乳 糖 为 碳 源 , 观 察 其 对 菌 体生 长 和 紫 杉 醇 产 量 的 影 响 。 结 果 表 明 : 蔗 糖 和 麦 芽 糖 为 碳 源 时 紫 杉 醇 含 量 相 对 较 高 , 在 以 葡 萄 糖和 乳 糖 为 碳 源 时 含 量 较 低 。 l氮 源 的 影 响 分 别 考 查 氯 化 铵 、 硝 酸 铵 、 硫 酸 铵 和 蛋 白 胨 等氮 源 对 菌 株 产 紫 杉 醇 产 量 影 响 。 结 果 表 明 :不同 氮 源 对 紫 杉 醇 的 产 量 影 响 较 大 。 以 氯 化 铵 和硫 酸 铵 为 氮 源 时 ,菌 丝 生 长 较 好 , 紫 杉 醇 产 量明 显 比 以 硝 酸 铵 为 氮 源 时 高 , 而 以 蛋 白 胨 为 氮源 时 , 紫 杉 醇 产 量 急 剧 下 降 , 可 能 是 蛋 白 胨 的某 些 成 分 抑 制 了 紫 杉 醇 的 产 生 。 l补 加 蔗 糖 的 影 响总 糖 随 时 间 的 变 化 关 系 补 加 蔗 糖 量 对 菌 体 干 重 和 紫 杉 醇 产 量 的 影 响发 酵 过 程 中 24 h时 补 加 蔗 糖 量 对 菌 体 生 长 和 紫 杉 醇 产 量 的 影 响 。 结 果 表 明 : 在 一 定 范 围 内 , 随 补 加 蔗 糖 量 的 增 加 , 可 以 促 进 菌 体 的 新 一 轮 生 长 和 繁 殖 , 且 紫 杉 醇 含 量 也 增 加 , 而 当 每 升 补 加 蔗 糖 量 为 30 g 时 , 菌 体 干 重 和 紫 杉 醇 产量 都 开 始 下 降 。 这 可 能 因 为 糖 浓 度 提 高 而 对 应 的 提 高 了 渗 透 压 , 导 致 膜 蛋 白部 分 降 解 , 使 菌 体 通 透 性 增 加 , 而 使 代 谢 物 更 多 地 向 胞 外 释 放 , 促 进 了 产 物的 合 成 速 率 , 提 高 了 产 量 , 但 过 高 的 糖 浓 度 导 致 发 酵 液 粘 度 增 加 , 菌 体 呼 吸困 难 , 进 而 抑 制 了 紫 杉 醇 的 生 产 。 l前 体 饲 喂 的 影 响 在 内 生 真 菌 的 发 酵 过 程 中 , 前 体 对 紫 杉 醇 有 一 定 影 响 。 结 果 表 明 , 与 对 照 组 相 比 较 , 苯 丙 氨 酸 的 浓 度 对 紫 杉 醇 的 产 量 影 响 显 著 ,其原 因 可 认 为 苯 丙 氨 酸 为 紫 杉 醇 合 成 的 底 物 。 三 、 总 结 真 菌 发 酵 法 制 备 紫 杉 醇 是 一 个 很 有 前 景 的 技术 ， 它 有 自 己 的 优 点 ： u可 以 很 轻 易 地 改 变 培 养 基 组 成 和 发 酵条 件 ， 如 碳 源 、 氮 源 、 糖 含 量 和 前 体 ，从 而 获 得 最 佳 产 量u与 天 然 红 豆 杉 相 比 ， 它 具 有 周 期 短 ，产 量 高 等 优 势 u此 外 真 菌 的 基 因 操 作 比 植 物 容 易 得多 ,因 而 ,有 可 能 通 过 基 因 工 程 的 方法 来 增 加 紫 杉 醇 在 真 菌 中 的 产 量 . 发酵培养有着巨大潜在价值 由 于 发 酵 工 程 具 有 显 著 的 经 济 效 益 、社 会 效 益 和 生 态 效 益 , 它 将 对 各 领 域 生产 发 展 作 出 越 来 越 大 的 贡 献 。