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1 找 答 案 ？ 核 酸 分 离 纯 化 的 原 则 是 什 么 ？ 为 防 止核 酸 降 解 需 要 注 意 什 么 ？ 核 酸 制 备 基 本 步 骤 ？ 如 何 鉴 定 核 酸 浓 度 和 纯 度 ？ 核 酸 的 保 存 方 法 有 哪 些 ？ 2 前 言 核 酸 （ nucleic acid） 是 以 核 苷 酸 为 基 本 组 成 单 位的 生 物 信 息 大 分 子 。 是 遗 传 信 息 的 携 带 者 ， 是 基因 表 达 的 物 质 基 础 。 3 核 酸 的 分 类 ：nDNA q核 内 染 色 体 DNA。q核 外 也 有 少 量 DNA， 如 线 粒 体 DNA， 叶 绿 体DNA。q质 粒 DNA。n RNAq存 在 于 细 胞 质 中 ， 如 mRNA, rRNA, tRNA等 。n除 上 述 DNA， RNA外 ， 还 有 非 细 胞 形 式 存 在 的 病毒 和 噬 菌 体 ， 其 或 只 含 DNA， 或 只 含 有 RNA。 4 主 要 内 容2. 核 酸 制 备 的 基 本 步 骤3. 核 酸 的 鉴 定 和 保 存4. 核 酸 提 取 方 法 简 介 5 1. 核 酸 分 离 与 纯 化 的 原 则 及 要 求1.1 核 酸 分 离 与 纯 化 的 一 般 原 则(1) 保 持 核 酸 分 子 一 级 结 构 的 完 整 性 ， 是 核 酸 结构 和 功 能 研 究 的 最 基 本 要 求 。(2) 排 除 其 他 分 子 的 污 染 ， 保 证 核 酸 的 纯 度 。 6 1.2 核 酸 分 离 与 纯 化 的 要 求(1) 为 保 证 核 酸 的 完 整 性 ，（ 防 止 降 解 ） ， 在 实 验 中 应 注 意 ： 尽 量 简 化 步 骤 ， 缩 短 提 取 时 间 ， 减 少 各 种有 害 因 素 对 核 酸 的 破 坏 。 减 少 化 学 因 素 对 核 酸 的 降 解 ， pH4-10。化 学 因 素 ？生 物 因 素 ？物 理 因 素 ？ 7 防 止 核 酸 的 生 物 降 解 （ 细 胞 内 或 外 的各 种 核 酸 酶 水 解 ） 。 所 用 器 械 和 一 些 试 剂 需 高 压 灭 菌 ， 提 取 缓 冲液 中 需 加 核 酸 酶 抑 制 剂 。 操 作 温 度 为 04 。l DNA酶 需 要 金 属 离 子 Mg2+、 Ca2+的 激 活 ， 因 此使 用 金 属 离 子 螯 合 剂 ， 如 EDTA或 柠 檬 酸 盐 等 ；阴 离 子 表 面 活 性 剂 SDS。 l RNA酶 分 布 广 泛 ， 极 易 污 染 样 品 ， 而 且 耐 高 温 、耐 酸 碱 、 不 易 失 活 ， 生 物 降 解 是 RNA提 取 过 程 中的 主 要 危 害 因 素 。 0.1%DEPC浸 泡 ， 器 械 180干 烤 8h。 8 减 少 物 理 因 素 对 核 酸 的 降 解 ， 主 要是 机 械 剪 切 力 ， 其 次 是 高 温 。l 机 械 剪 切 力 包 括 强 力 高 速 的 振 荡 、 突 然 暴露 于 低 渗 液 、 样 品 反 复 冻 融 等 。l 高 温 ， 如 长 时 间 的 煮 沸 。 9 (2) 核 酸 纯 度 的 要 求 ： 非 核 酸 生 物 大 分 子 的 污 染 降 低 到 最 低 程度 ， 如 蛋 白 质 、 多 糖 和 脂 类 分 子 ； 排 除 其 它 核 酸 分 子 的 污 染 ， 如 制 备 RNA时 ， DNA分 子 是 污 染 物 ； 去 除 对 后 续 实 验 有 影 响 的 物 质 ， 如 有 机溶 剂 和 过 高 浓 度 的 金 属 离 子 。 10 2. 核 酸 制 备 的 基 本 步 骤I.材 料 准 备II.破 碎 细 胞 或 包 膜 内 容 物 释 放III.核 酸 分 离IV.沉 淀 或 吸 附 核 酸 ， 纯 化 并 去 除 杂 质V.核 酸 溶 解 在 适 量 缓 冲 液 或 水 中 11 2.1 破 碎 细 胞 (1)玻 璃 匀 浆 器 匀 浆(2)液 氮 研 磨 法富 含 DNA酶 的 胰 、 脾 、 胸 腺 、 淋 巴 ； 富 含 胶 原 蛋 白 的 皮肤 、 肌 腱 ； 坚 硬 的 组 织 如 骨 骼 。(3)高 速 组 织 捣 碎 机 捣 碎(4)超 声 波 处 理 法(5)化 学 处 理 法 (SDS、 吐 温 80等 ）(6)生 化 法 （ 溶 菌 酶 、 纤 维 素 酶 等 ） 12 2.2 核 酸 分 离 ， 去 除 蛋 白 核 酸 与 蛋 白 质 的 结 合 力 主 要 是 正 负 静 电 吸 力 (核 酸 与 碱性 蛋 白 的 结 合 )、 氢 键 和 非 极 性 的 范 德 华 力 。 分 离 核 酸 最 困 难 的 是 将 与 核 酸 紧 密 结 合 的 蛋 白 质 分 开 ，同 时 避 免 核 酸 降 解 。（ 1） 加 入 SDS SDS除 有 破 膜 和 抑 制 核 酸 酶 的 作 用 外 ， 还 具 有 使 核 酸 从 蛋 白 质 上 游离 出 来 的 功 能 ；（ 2） 加 入 浓 盐 溶 液 （ 如 NaCl） 核 酸 -蛋 白 质 加 入 NaCl后 ， 破 坏 静 电 吸 力 ， 使 氢 键 破 坏 ， 核 蛋 白 解 聚 ； 13 （ 3） 酚 /氯 仿 抽 提p 酚 氯 仿 混 合 使 用 能 增 加 去 除 蛋 白 的 效 果 ， 并 对 核 酸 酶 有 抑制 作 用 。p 氯 仿 比 重 大 ， 能 加 速 有 机 相 与 水 相 分 层 ， 减 少 残 留 在 水 相 中的 酚 ， 同 时 氯 仿 具 有 去 除 植 物 色 素 和 蔗 糖 的 作 用 。p 在 酚 /氯 仿 抽 提 核 酸 提 取 液 时 ， 需 要 振 摇 ， 为 防 止 起 泡 和 促 使水 相 与 有 机 相 的 分 离 ， 再 加 上 一 定 量 的 异 戊 醇 （ 酚 ： 氯 ： 异戊 醇 =25： 24： 1） 。 14 (1） 使 用 注 意 酚 通 常 是 透 明 无 色 的 结 晶 ， 如 果 酚 结 晶 呈现 粉 红 色 或 黄 色 ， 表 明 其 中 含 有 酚 的 氧 化 产 物 ，例 如 醌 、 二 酸 等 。 变 色 的 酚 不 能 用 于 核 酸 抽 提实 验 ， 因 为 氧 化 物 可 破 坏 核 酸 的 磷 酸 二 酯 键 。 (2） 安 全 操 作 酚 腐 蚀 性 很 强 ， 并 可 引 起 严 重 的 灼 伤 ， 操作 时 应 戴 手 套 。使 用 酚 时 应 注 意 15 2.3 沉 淀 核 酸n 重 新 调 整 核 酸 的 浓 度 ， 起 到 浓 缩 核 酸 的 作 用 ； n 去 除 溶 液 中 某 些 盐 离 子 与 杂 质 ；n 改 变 核 酸 的 溶 解 缓 冲 液 。 DNA纯 化 柱 核 酸 提 取 （ 离 心 柱 型 ）利 用 硅 胶 膜 特 异 吸 附 核 酸 16Na+ Mg2+ Li+ 2.3.1 核 酸 的 有 机 溶 液 沉 淀 法 当 核 酸 溶 液 的 pH值大 于 4时 ， 核 酸 分 子 呈多 聚 阴 离 子 状 态 。 钾 、 钠 、 镁 、 锂 及 铵根 等 阳 离 子 形 成 的 盐 ，通 过 屏 蔽 带 负 电 的 磷 酸基 团 使 DNA分 子 聚 结 在一 起 而 不 溶 于 许 多 有 机溶 剂 。 17 核 酸 沉 淀 的 盐 类 及 浓 度盐 贮 存 液 浓 度 （ mol/L) 终 浓 度 (mol/L)MgCl2 1 0.01NaAc 3 (pH5.2) 0.3KAc 3 (pH5.2) 0.3NH4Ac 10 2.5NaCl 5 0.2LiCl 8 0.8 18 乙 醇n 优 点 ： 对 盐 类 沉 淀 少 ， 沉 淀 中 所 含 迹 量 乙 醇 易 挥 发 除 去 ， 不 影 响以 后 实 验 。n 缺 点 ： 需 要 量 大 ， 一 般 要 求 低 温 操 作 。异 丙 醇n 优 点 ： 需 体 积 小 ， 速 度 快 ， 适 于 浓 度 低 、 体 积 大 的 DNA样 品 沉 淀 。一 般 不 需 低 温 长 时 间 放 置 。 n 缺 点 ： 易 使 盐 类 、 蔗 糖 与 DNA共 沉 淀 异 丙 醇 难 以 挥 发 除 去 。 所以 ， 最 后 用 70 乙 醇 漂 洗 数 次 。 常 用 的 有 机 沉 淀 剂 19 聚 乙 二 醇 （ PEG）优 点 ： 可 用 不 同 浓 度 的 PEG选 择 沉 淀 不 同 相 对 分 子 质 量的 DNA片 段 。 应 用 6000相 对 分 子 质 量 的 PEG进 行DNA沉 淀 时 ， 使 用 浓 度 与 DNA片 段 的 大 小 成 反 比 。注 意 ： PEG沉 淀 一 般 需 加 0.5mol/L的 NaCl或 10 mmol/L的 MgCl 2。 20 精 胺 精 胺 不 是 有 机 溶 剂 ， 但 可 快 速 有 效 沉 淀 DNA。 原 理 是 ： 精 胺 与 DNA结 合 后 ， 使 DNA在 溶 液 中 结 构 凝 缩而 发 生 沉 淀 ， 并 可 使 单 核 苷 酸 和 蛋 白 质 杂 质与 DNA分 开 ， 达 到 纯 化 DNA的 目 的 。 21 2.3.2 核 酸 沉 淀 的 温 度 和 时 间 一 般 强 调 ， 核 酸 沉 淀 在 低 温 长 时 间 下 进 行 。 但 时间 过 长 ， 易 导 致 盐 与 DNA共 沉 淀 ， 影 响 以 后 的 实 验 。一 般 使 用 0 冰 水 ， 10-15min， DNA样 品 足 可 达 到 实验 要 求 。3. 核 酸 的 浓 度 和 纯 度 的 测 定3.1 紫 外 分 光 光 度 法 鉴 定 核 酸 3.2 荧 光 光 度 法 鉴 定 核 酸 22 3.1 紫 外 分 光 光 度 法 鉴 定 核 酸 3.1.1 紫 外 分 光 光 度 法 测 DNA和 RNA的 含 量 前 提 ： 核 酸 样 品 要 较 纯 ， 无 显 著 蛋 白 质 、 酚 、 琼 脂糖 及 其 他 核 酸 污 染 。 测 定 浓 度 应 大 于 0.25 g/ml 。结 论 ： 在 波 长 260nm紫 外 光 下 ， 1 OD值 的 吸 光 度 相当 于 双 链 DNA浓 度 为 50 g/ml； 单 链 DNA为 37 g/ml； RNA为 40 ug/ml。 23 a 分 光 光 度 计 先 用 一 定 量 的 水 校 正 零 点 。b 吸 取 一 定 量 的 DNA样 品 或 RNA样 品 ， 加 入 到 盛有 一 定 体 积 水 的 石 英 比 色 杯 中 。c 测 定 待 测 样 品 在 230nm、 260nm和 280nm的 OD值d 计 算 浓 度 。 双 链 DNA样 品 浓 度 ( g/ l) = OD260 核 酸 稀释 倍 数 50/1000； RNA样 品 浓 度 ( g/ l) = OD260 核 酸 稀 释 倍 数 40/1000。e 分 析 纯 度 。 核 酸 定 量 仪 可 直 接 获 得 浓 度 ， 不 用 计 算 。小 分 子 杂 质 核 酸 蛋 白 质紫 外 分 光 光 度 计 测 定 核 酸 浓 度 的 操 作 步 骤 24 A： 测 DNA： 纯 的 DNA样 品 OD260/OD280=1.8 （ 1.71.9） OD260m/OD2302.01) OD260/OD2801.9, RNA污 染 。2) OD260/OD2801.6， 存 在 蛋 白 质 或 酚 污 染 ；3) OD260/OD2302.01） OD260/OD280比 值 太 小 ， 蛋 白 质 或 酚 的 污 染 ；2） OD260/OD280 2.0， 可 能 被 异 硫 氰 酸 胍 等 污 染 ；3） OD260/OD2302.0， 表 明 有 小 分 子 及 盐 存 在 。 26 3.2 荧 光 光 度 法 鉴 定 核 酸 3.2.1 测 定 核 酸 含 量 ：原 理 ： DNA、 RNA在 荧 光 染 料 溴 乙 锭 (EB)嵌 入 碱 基 平 面之 间 后 ， DNA、 RNA样 品 在 紫 外 光 激 发 下 ， 可 发 出 红色 荧 光 ， 荧 光 强 度 与 核 酸 含 量 成 正 比 。 使 用 一 系 列已 知 的 不 同 浓 度 DNA溶 液 作 标 准 对 照 ， 可 比 较 出 被 测DNA溶 液 浓 度 。 注 意 ： 此 法 的 比 较 主 要 基 于 目 测 ， 是 估 计 水 平 。 常 用 的 荧 光 染 料 还 有 :golden view, gel red, sybr green 27核 酸 鉴 定 实 际常 用 操 作 程 序核 酸 定 量 仪 测 定 浓 度 ，OD260/OD280及 OD260/OD230比 值 。琼 脂 糖 电 泳 ， UV下 观 察验 证 纯 度 及 判 断 是 否 降 解 3.2.2 荧 光 光 度 法 鉴 定 核 酸 纯 度原 理 ： 溴 化 乙 锭 (EB)等 荧 光 染 料 示 踪 的 核 酸 电 泳 结 果 。 基因组DNARNA 28 (1) 对 DNA DNA样 品 溶 于 pH8.0的 TE， 4 或 -20 保 存 ； 长 期 保 存 样 品 中 可 加 入 1滴 氯 仿 。(2) 对 RNA RNA样 品 溶 于 0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或 双 蒸 灭 菌 水 中 ，-70 保 存 ; 可 以 沉 淀 形 式 贮 于 乙 醇 ， 可 在 -20 中 长 期 保 存 ; 最 常 用 无 Rnase水 或 高 压 后 的 DEPC水 溶 解 RNA， 冻 贮 于 -70-80 。3.3 核 酸 的 保 存 TE： Tris-Cl, EDTA 29 4、 核 酸 提 取 方 法 简 单 介 绍4.1 基 因 组 DNA的 提 取 方 法4.2 质 粒 的 提 取 和 纯 化4.3 Trizol法 提 取 总 RNA 30 4.1 基 因 组 DNA的 提 取 方 法4.1.1 酚 抽 提 法以 含 EDTA、 SDS及 RNase的 裂 解 缓 冲 液 裂 解 细 胞 ，经 蛋 白 酶 K处 理 后 ， 用 pH8.0的 Tris饱 和 酚 抽 提 。（ DNA） 31 原 理 ：n 在 正 常 情 况 下 ， 核 酸 表 面 覆 盖 了 一 层 由 水 分 子 组 成 的 亲 水n 薄 膜 ， 以 维 持 其 水 溶 性 。 高 浓 度 盐 离 子 的 加 入 破 坏 了 核 酸n 表 面 亲 水 薄 膜 的 相 对 有 序 排 列 ， 形 成 了 疏 水 环 境 。 在 此 环n 境 中 ， 核 酸 与 硅 胶 膜 能 有 效 结 合 ， 而 蛋 白 质 、 代 谢 产 物 和n 其 他 污 染 物 则 不 能 结 合 。特 点 ： n 不 需 要 使 用 有 毒 的 苯 酚 等 试 剂 ， 也 不 需 要 乙 醇 沉 淀 等 步 骤 。n 快 速 ， 简 捷 。4.1.2 基 因 组 DNA提 取 试 剂 盒 （ 离 心 柱 型 ）常 用 的 试 剂 盒 ： Qiagen 32 裂 解 液 +蛋 白 酶 K裂 解 细 胞缓 冲 液 GB+乙 醇DNA柱 子 吸 附缓 冲 液 GD去 除 蛋 白漂 洗 液漂 洗 DNA两 次 洗 脱 液 TE洗 脱 DNA离 心 柱 型基 因 组 DNA提 取 步 骤 33 n 甲 酰 胺 解 聚 法 ： 细 胞 裂 解 步 骤 与 酚 抽 提 法 一 致 ，但 以 高 浓 度 甲 酰 胺 裂 解 液 裂 解 DNA与 蛋 白 质复 合 体 ， 再 以 透 析 除 去 杂 质n 玻 璃 棒 缠 绕 法 ： 将 基 因 组 DNA沉 淀 缠 绕 于 带钩 玻 璃 棒 上 带 出 ， 溶 于 pH8.0的 TEn 异 丙 醇 沉 淀 法n 玻 璃 珠 吸 附 法4.1.3 其 他 的 基 因 组 DNA提 取 方 法 34 n 透 析 ， 沉 淀 ， 电 泳 ， 选 择 性 沉 淀4.1.4 DNA样 品 的 进 一 步 纯 化4.1.5 DNA片 段 的 回 收n原 则 ： 提 高 回 收 率 ， 去 除 杂 质 污 染n从 琼 脂 糖 凝 胶 中 回 收 ： DEAE纤 维 素 膜 插 片 电 泳 法 ， 电 泳 洗 脱 法 冷 冻 挤 压 法 n从 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 回 收 ： 压 碎 与 浸 泡 35 4.2 质 粒 的 提 取 和 纯 化n 质 粒 的 结 构 ： 超 螺 旋 ， 半 开 环 ， 线 性 DNAn 理 化 性 质 ： 与 一 般 核 酸 相 似 ， 但 抗 切 割 和抗 变 性 能 力 更 强n 所 有 分 离 质 粒 DNA的 方 法 都 包 括 3个 基 本 步 骤 ： 培 养 细 菌 使 质 粒 扩 增 ； 收 集 和 裂 解 细 菌 ； 分 离质 粒 DNA(有 时 还 要 求 纯 化 质 粒 DNA， 根 据 实验 所 需 )。 选 择 哪 一 种 方 法 主 要 取 决 于 以 下 几 个 因 素 ： 质 粒 的 大 小 、大 肠 杆 菌 菌 株 、 裂 解 后 用 于 纯 化 的 技 术 和 实 验 要 求 。 36 4.2.1 质 粒 提 取 原 理4.2.2 质 粒 DNA的 纯 化 与 回 收n 纯 化q CsCL-EB法q 聚 乙 二 醇 沉 淀 法q 柱 层 析 法n 回 收 ： 与 基 因 组 DNA类 似 37 4.3 RNA的 分 离 和 纯 化n RNA易 被 RNase水 解 ， RNase除 细 胞 内 还 广 泛 存在 于 人 的 皮 肤 、 唾 液 、 汗 液 及 周 围 的 环 境 中n RNase分 子 结 构 中 的 二 硫 键 使 其 生 物 学 活 性 非常 稳 定 n 排 除 RNase的 污 染 是 RNA制 备 成 功 与 否 的 关 键 38 4.3.1 RNA制 备 的 条 件 与 环 境n 洁 净 的 实 验 室n 操 作 人 员 带 口 罩 ， 勤 换 手 套n 玻 璃 器 皿 （ 如 匀 浆 器 ） 、 镊 子 180 干 烤 8 h或 更 长 时 间n 枪 头 、 EP管 0.1%DEPC水 浸 泡 过 夜 ， 再 高压 ； 或 直 接 购 买 无 Rnase的 枪 头 和 EP管n 冰 上 匀 浆 ， 4 离 心 39 n Trizol的 主 要 成 分 是 苯 酚 。 苯 酚 的 主 要 作 用是 裂 解 细 胞 ， 使 细 胞 中 的 蛋 白 ， 核 酸 物 质 解 聚得 到 释 放 。 苯 酚 虽 可 有 效 地 变 性 蛋 白 质 ， 但 不能 完 全 抑 制 RNA酶 活 性 。n Trizol中 还 加 入 了 8 羟 基 喹 啉 、 异 硫 氰 酸 胍 、-巯 基 乙 醇 等 来 抑 制 内 源 和 外 源 RNase（ RNA酶 ） 。4.3.2 Trizol法 提 取 总 RNA 40 Trizol法 提 取 RNA步 骤1、 每 50-100mg 组 织 加 入 1ml Trizol ， 用 匀 浆 器 匀 浆 处 理 ， 室 温 放置 5min， 使 其 充 分 裂 解 。 12,000rpm 离 心 5min， 弃 沉 淀 。2、 加 入 氯 仿 200微 升 每 管 ， 剧 烈 振 荡 15s ， 室 温 放 置 2-3 min 。 12000g ,4 ， 离 心 15 min 3、 吸 取 上 层 水 相 (约 400微 升 ） ， 至 另 一 离 心 管 中 。 注 ： 千 万 不 要 吸取 中 间 界 面 ； 若 同 时 提 取 DNA和 蛋 白 质 ， 则 保 留 下 层 酚 相 存 于 4冰 箱 ,若 只 提 RNA， 则 弃 下 层 酚 相 。4、 每 使 用 1ml Trizol 加 入 0.5 ml 异 丙 醇 ， 室 温 10min 。 12000g ， 4 ， 10 min ,弃 上 清 ， RNA沉 于 管 底 。5、 加 入 1 mL75%乙 醇 ， 温 和 振 荡 离 心 管 ， 悬 浮 沉 淀 。 12000g ,4 ,5min 。 ， 尽 量 弃 上 清 。6、 室 温 晾 干 或 真 空 干 燥 5-10min。 加 入 20微 升 无 Rnase 水 溶 解 RNA 沉 淀 。 41 除 血 红 蛋 白 及 某 些 组 蛋 白 外 ， 绝 大 多 数 mRNA在其 3末 端 带 有 1个 长 短 不 一 的 多 聚 核 苷 酸 的 结 构 ， 即poly（ A） 尾 巴n olig（ dT） -纤 维 素 柱 层 析 法n olig（ dT） -纤 维 素 液 相 结 合 离 心 法n 其 他 方 法 ： 磁 珠 法 生 物 素 标 记 的 oligo（ dT） 结 合 poly（ A） 尾 ， 再 结 合 亲 和 素 标 记 的磁 珠4.3.3 mRNA的 分 离 和 纯 化 42 找 答 案 DNA recombination DNA recombination technique vector DNA重 组 技 术 中 常 用 的 工 具 酶 ？ DNA重 组 技 术 的 基 本 步 骤 ？ DNA重 组 子 的 筛 选 和 鉴 定 的 方 法 有 哪 些 ？ -互 补第 六 章 DNA重 组 技 术 43 DNA重 组 （ DNA recombination） 不 同 来 源 的 DNA， 通 过 磷 酸 二 酯 键 连 接而 重 新 组 合 成 新 的 DNA分 子 的 过 程 。 DNA DNA新 的 DNA+ 连 接 组 合 44 DNA重 组 技 术 （ DNA recombination technique）又 称 分 子 克 隆 或 基 因 工 程 ： 体 外 用 限 制 性 内 切 酶 将 不 同 来 源 的 DNA分子 进 行 特 异 地 切 割 水 解 ， 获 得 目 的 基 因 或DNA片 段 与 载 体 连 接 ， 从 而 组 成 特 异 的 一 个新 的 DNA分 子 ， 重 组 的 DNA分 子 通 过 一 定 的方 式 导 入 相 应 的 宿 主 细 胞 ， 在 宿 主 细 胞 中进 行 无 性 繁 殖 ， 获 得 大 量 目 的 基 因 或 DNA片段 的 过 程 。 分 子 水 平 操 作 ， 细 胞 水 平 表 达 。 45 切接转分筛 46 重 组 DNA技 术 的 基 本 步 骤1.载 体 的 选 择 与 制 备 、 核 酸 的 分 离 分2.目 的 基 因 的 获 得 切3.目 的 基 因 与 载 体 的 连 接 接4.重 组 DNA分 子 导 入 受 体 细 胞 转5.筛 选 出 含 重 组 DNA基 因 分 子 的 受 体 细 胞 克 隆 筛6.克 隆 基 因 的 表 达 及 表 达 产 物 的 检 测 和 分 离 纯 化 47 DNA重 组 技 术 的 开 创 人 1.第 一 个 实 现 DNA重 组 的 人 Berg 1972年 ， Berg用 E.coR 切 割 SV4 0DNA和 phageDNA， 经 过 连 接 组 成 重 组 的 DNA分 子 。 Berg是 第 一 个 实 现 DNA重 组 的 人 。 2.第 一 个 取 得 基 因 工 程 成 功 的 人 Cohen 1973年 ， Cohen Group将 E.coli的 tetr质 粒 psclol和ne rsrR6-3质 粒 体 外 限 制 酶 切 割 ， 连 接 成 一 个 新 的 质 粒 ，转 化 E.coli， 在 含 四 环 素 和 新 霉 素 的 平 板 上 筛 选 出 了terrNer,实 现 了 细 菌 遗 传 性 状 的 转 移 。 这 是 基 因 工 程 史上 的 第 一 个 克 隆 化 并 取 得 成 功 的 例 子 ， 这 一 年 被 定 为 基因 工 程 诞 生 的 元 年 。 DNA重 组 技 术 依 赖 于 3大 理 论 ， 3大 技 术 准 备 ：（ 一 ） 理 论 上 的 3大 发 现 ：1. 20世 纪 40年 代 ， Avery发 现 了 生 物 遗 传 物 质 的 化 学 本 质 是DNA。 超 越 时 代 的 科 学 成 就 往 往 不 易 被 人 们 接 受 ， Avery当 时 并 未 赢 得 阵 阵 掌 声 ， 他 的 论 文 事 隔 10年 以 后 才 公 开 发表 。2. 20世 纪 50年 代 ， Watson-crick提 出 了 DNA结 构 的 双 螺 旋结 构 模 型 ， 搞 清 楚 了 生 物 遗 传 物 质 的 分 子 机 制 。3. 20世 纪 60年 代 ， 确 定 了 遗 传 信 息 的 传 递 方 式 ：DNARNAPr,破 译 了 全 部 遗 传 密 码 ， 43。 技 术 上 的 3大 发 明 ： 1 “ 基 因 剪 刀 ” 限 制 性 内 切 酶 的 发 明 （ 1） 20世 纪 40 60年 代 ， 科 学 家 们 就 为 基 因 工 程 设 计了 美 好 的 蓝 图 ， 但 是 面 对 庞 大 的 dsDNA（ 104， 2.2*1011公里 ） 束 手 无 策 ， 无 从 下 手 把 它 切 成 单 个 基 因 片 断 。 （ 2） 当 时 的 酶 学 知 识 已 有 相 当 的 发 展 ， 但 是 没 有 一 个 已发 现 的 酶 能 完 成 这 样 的 使 命 。 （ 3） 1970年 ， Smith和 Wilcox在 流 感 嗜 血 杆 菌（ Haemophilus inffuenzae） 分 离 纯 化 了 Hind ， 取 得 了突 破 ， 打 破 了 基 因 工 程 的 禁 锢 ， 迎 来 了 改 造 生 物 的 春 天 ，为 基 因 工 程 奠 定 了 最 为 重 要 的 技 术 基 础 。 50 2 逆 转 录 酶 1970年 Baltimove和 Temin等 同 时 各 自 发 现了 逆 转 录 酶 ， 打 破 了 遗 传 学 （ 生 物 学 ） 中 心 法 则 ， 使 真 核基 因 的 制 备 成 为 可 能 。 （ 原 因 如 下 ） (1)真 核 基 因 组 庞 大 而 复 杂 ， 不 易 制 得 基 因 图 谱 。HGP2005年 完 成 ， 2.8万 个 基 因 ， 1 3kb/基 因 ， 104，2.2*1011公 里 。 （ 2） 即 使 有 了 基 因 图 谱 ， 因 为 真 核 基 因 有 内 含 子 ， 不 能在 原 核 表 达 系 统 剪 接 出 mRNA， 没 有 成 熟 的 mRNA就 不 能得 到 相 应 得 产 物 。 （ 3） 经 过 逆 转 录 mRNAcDNA (complementory DNA)文库 要 比 基 因 组 文 库 小 得 多 ， 所 以 筛 选 阳 性 克 隆 就 方 便 得 多 。 有 了 这 些 理 论 核 技 术 的 武 装 ， 基 因 工 程 的 临 盆 降 生 指日 可 待 ， Berg和 Cohen两 位 科 学 的 “ 助 产 士 ” ， 把 基 因 工 程接 到 了 人 间 。 3 载 体 (“交 通 工 具 车 子 ” ) 基 因 工 程 技 术 诞 生 的 第 二个 技 术 准 备 （ 1） 有 了 切 割 与 缝 合 （ ligase） 基 因 DNA的 工 具 ， 还得 有 一 个 车 子 （ 富 康 ） 将 重 组 DNA送 到 宿 主 细 胞 中 去 。 （ 2） 1946年 起 ， Lederberg就 研 究 细 菌 性 因 子 （ F因子 ） .50-60年 代 相 继 发 现 了 R因 子 （ 抗 药 因 子 ） ， CoE(大肠 杆 菌 因 子 )等 质 粒 。 （ 3） 然 而 ， 直 到 1973年 Cohen才 能 将 质 粒 作 为 基 因 工程 载 体 使 用 （ 至 今 一 直 是 基 因 工 程 最 重 要 最 广 泛 使 用 的 载体 ） 。 这 是 基 因 工 程 的 第 二 个 技 术 准 备 。 工 具 酶常 用 的 工 具 酶 （ tool enzymes） 有 ： 1.限 制 性 核 酸 内 切 酶 （ resriction enzymes,restriction endonadease)2.DNA连 接 酶 （ DNA ligase,ligase)3.逆 转 录 酶 (reverse transcriptase)4.DNA聚 合 酶 (DNA polymerase,DNA pol)5.核 酸 酶 (nuclease)6.末 端 转 移 酶 (terminal transferase)7.碱 性 磷 酸 酶 (BAP或 CIP)以 1. 和 2. 最 为 常 用 ， 最 为 重 要 。 工 具 酶 现 已 商 品 化 。第 一 节 常 用 工 具 酶 一 限 制 性 核 酸 内 切 酶 （ 一 ） 限 制 酶 的 概 念 （ 定 义 ， 分 类 ， 命 名 ， 限 制 与 修 饰 辨 正关 系 ） 1.定 义 限 制 性 内 切 酶 （ restriction endonuclease, restrction enzymes） ： 简 称 限 制 酶 ， 识 别 和 切 割 双 链 DNA分 子 特 异 序列 的 核 酸 水 解 酶 。 具 有 识 别 和 切 割 dsDNA的 功 能 。 所 谓 限 制 （ restriction） =切 割 （ clearage） =水 解（ hydrolysis） 该 部 位 的 核 苷 键 （ 磷 酸 二 酯 键 ） 54 2.分 类 限 制 酶 都 是 从 原 核 生 物 中 发 现 的 （ 400多种 E/350M） 。 所 有 的 限 制 酶 可 分 成 3类 。 （ 1） 、 类 兼 具 限 制 与 修 饰 活 性 ， 它 们 识 别 与 切 割 顺 序 不在 一 个 地 方 ， 不 产 生 特 异 性 的 DNA片 段 ， 与 基 因 工程 意 义 不 大 （ 有 说 型 识 别 核 切 割 的 位 点 一 致 ， 但罕 见 ） 。 （ 2） 类 基 因 工 程 说 到 的 限 制 酶 是 型 酶 ， 具 有 此 类 酶的 微 生 物 限 制 修 饰 系 统 分 别 由 限 制 酶 和 甲 基 化 酶来 完 成 。 型 酶 分 子 量 小 ， 仅 需 Mg 2 作 为 催 化 反应 的 辅 因 子 ， 识 别 与 切 割 位 点 相 同 ， 产 生 特 异 的DNA片 段 。 3. 命 名 （ 1973年 Smith 原 则 、 类 酶 ， 斜 体 字 母 表 示 ）根 据 分 离 此 酶 微 生 物 的 学 名 ， 一 般 取 3个 字 母 。第 一 个 字 母 大 写 - 该 微 生 物 属 名 前 的 第 一 个 字 母第 二 、 三 个 字 母 小 写 - 该 微 生 物 种 名 前 的 2个 字 母第 四 个 字 母 大 写 - 有 变 种 或 株 系 的 第 一 个 字 母罗 马 字 母 、 、 - 从 一 种 微 生 物 中 发 现 了 几 种 限 制 酶 ， 按 发 现 顺 序 排 列 如 EcoR 是 指 从 大 肠 杆 菌 （ Escherichia coli） R株分 离 得 到 的 第 一 种 限 制 酶 。 (二 )限 制 酶 的 识 别 位 点 它 能 识 别 dsDNA的 4 6bp的 回 文 序 列并 水 解 该 部 分 的 核 苷 键 。 一 般 来 说 是 4 6bp， 有 6个 以 上 的 ， 但 没 有 4个 以 下的 。 回 文 结 构 ： 57 Bam HGTCCAG GCCTAG GATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平 端 切 口 粘 端 切 口识 别 顺 序 呈 二 重 对 称 ， 即 1800旋 转 对 称 。 58GGATCCCCTAGG GCCTAG GATCC G Bam H GGATCCCCTAGG GCCTAG GATCC GBst 同 功 异 源 酶 ：来 源 不 同 的 限 制 酶 ， 能 识 别 和 切 割 同 一 位 点 ， 这些 酶 称 同 功 异 源 酶 。 59 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G ATCTAG GATCT A 同 尾 酶 ：有 些 限 制 性 内 切 酶 虽 然 识 别 序 列 不 完 全 相 同 ， 但切 割 DNA后 产 生 相 同 的 粘 性 末 端 ， 称 为 同 尾 酶 。 60 （ 三 ） 限 制 性 内 切 酶 的 活 力 单 位 和星 号 活 力 1. 酶 活 力 单 位 在 合 适 温 度 、 pH值 和 离 子 强 度 等 条 件 下 ， 1小 时 内 完全 消 化 1g特 异 DNA底 物 所 需 的 酶 量 ， 定 义 为 一 个 活 力单 位 。 2.星 号 活 性 限 制 性 内 切 酶 在 非 标 准 反 应 条 件 下 ， 对 识 别 序 列 的 特异 性 下 降 ， 能 切 割 一 些 与 特 异 识 别 顺 序 类 似 的 序 列 ，一 般 在 酶 的 右 上 角 加 “ *” 表 示 克 隆 过 程 中 需 同 时 进 行 双 酶 切 时 ， 应 选 用 二 种 酶 都 能 接 受 的 反 应 缓 冲 体 系 ， 否 则 可 能 影 响 酶 的 特 异 性 61 （ 四 )注 意 事 项 底 物 DNA不 能 含 有 痕 量 的 酚 、 氯 仿 和 乙 醚 溶 液 中 不 能 含 SDS和 过 量 的 盐 ， EDTA的 含 量 不能 大 于 10mmol/L 反 应 缓 冲 体 系 中 一 般 可 加 入 2-巯 基 乙 醇 或 二 硫苏 糖 醇 ， 防 止 含 巯 基 酶 的 氧 化 失 活 加 入 牛 血 清 白 蛋 白 稳 定 酶 活 性 操 作 时 应 注 意 混 匀 反 应 体 系 62 (六 ) 甲 基 化 酶1.细 菌 的 限 制 修 饰 系 统 限 制 （ 降 解 ） 外 来 DNA， 并 通 过 对 自 身 DNA的 修 饰 而起 保 护 作 用 。2.甲 基 化 酶 的 应 用 当 制 备 克 隆 用 双 链 cDNA时 ， 外 源 DNA片 段 可 用 EcoR 甲 基 化 酶 处 理 ， 使 双 链 cDNA内 部 EcoR 位 点 因 甲基 化 受 到 保 护 而 不 被 切 割 二 DNA连 接 酶 ： DNA连 接 酶 是 基 因 工 程 第 二 位 重 要 的 工 具 酶 ， 常 用 T4DNA ligase. （ 一 ） 功 能 ： 催 化 有 互 补 顺 序 的 两 个 dsDNA分 子 的 粘 性 末 端 或 平 头 末 端 3 OH、 5 P连 接 作 用 （ 只 能 作 用 于 双 链 DNA分 子 内 或 两 个 双 链DNA分 子 间 ， 不 能 将 二 个 单 链 DNA分 子 连 接 。 ) （ 二 ） 来 源 噬 菌 体 T4感 染 Ecoli分 离 的 一 种 单 链 多 肽 酶 、 MW.68K D。 （ 三 ） 催 化 反 应 ： （ 1） 需 要 ATP、 Mg 2+作 辅 助 因 子 ； （ 2） 最 适 pH值 为 7.2-7.4。 （ 3） 对 粘 性 末 端 催 化 活 性 大 于 平 头 末 端 （ 酶 量 1： 100） 64 三 、 分 子 克 隆 中 常 用 的 其 他 酶1.逆 转 录 酶2.Taq DNA聚 合 酶 （ 目 的 DNA片 段 3 端 加 A， 用 于 A T克 隆 ）3.T4多 核 苷 酸 激 酶4.末 端 转 移 酶 （ 脱 氧 核 苷 酸 末 端 转 移 酶 ）5.碱 性 磷 酸 酶6.DNA聚 合 酶 7.Klenow片 段 （ DNA聚 合 酶 大 片 段 ） 一 、 载 体 （ vector） 的 概 念 携 带 靶 DNA（ 目 的 DNA） 片 段 进 入 宿 主 细胞 进 行 扩 增 和 表 达 的 运 载 工 具 。基 因 工 程 所 用 的 vector实 际 上 是 DNA分 子 ， 可 以 被 插 入DNA片 段 。第 二 节 常 用 载 体 二 、 载 体 的 分 类分 类 依 据 类 别 克 隆 扩 增 或 表 达 举 例1.按 功 能 分 成 （ 1） 克 隆 载 体（ 2） 表 达 载 体 PBR322PCDN32.按 进 入 受 体 细 胞 类型 分 （ 1） 原 核 载 体（ 2） 真 核 载 体（ 3） 穿 梭 载 体 PUC8PBUDCE41YE3.按 载 体 来 源 分 质 粒 载 体 、 病 毒 载体 、 噬 菌 体 载 体 等4.按 克 隆 片 段 得 大 小 （ 克 隆 能 力 ） 分 (1)1kb (2)10kb (3)22kb(4)50kb (5)0.1-0.4Mb (6)0.5-2Mb ( 1 ) M 1 3 (2)plasmid(3) phage(4)casmid( 5 ) B A C (6)YAC 三 、 载 体 应 具 备 的 特 征 ：1) 载 体 必 须 具 有 自 我 复 制 和 表 达 的 能 力2) 载 体 不 能 过 大 ， 以 便 于 容 纳 较 大 的 外 源 DNA片 段3) 具 有 合 适 的 酶 切 位 点4) 具 有 两 个 以 上 的 遗 传 选 择 标 记 ， 便 于 区 别 阳 性 和 阴 性 克隆5) 配 备 有 与 宿 主 相 适 应 的 调 控 原 件 ， 如 启 动 子 等 68 1、 质 粒 载 体 质 粒 载 体 是 应 用 最 广 的 载 体 严 紧 型 质 粒 （ strigent plasmid） 和 松 弛 型 质 粒 （ relaxed plasmid） 基 因 工 程 使 用 松 弛 复 制 子 ， 以 获 得 更 多 的 基 因 产 品 。 松 弛 复 制 子 的 特 点 ： 复 制 不 受 宿 主 细 菌 复 制 系 统 的 限 制 ， 当 宿 主 蛋 白 质 合 成 受到 抑 制 （ 如 培 养 中 加 入 氯 霉 素 时 ） 其 拷 贝 数 猛 增 至 0003000之 多 ， 该 性 质 多 基 因 工 程 技 术 十 分 有 利 。 69 1、 质 粒 载 体 的 原 件 构 成1) Ori 复 制 起 始 点 （ origin， ori）2) 抗 生 素 抗 性 基 因3) MCS多 克 隆 位 点 70 载 体 本 身 必 须 是 一 个 复 制 单 位 即 复 制 子 ， 具 有 复 制 起 始 点 。（ 1） 决 定 质 粒 自 我 增 殖 和 拷 贝 数 的 主 要 元 件 。（ 2） 使 细 胞 繁 殖 后 维 持 一 定 量 的 质 粒 拷 贝 数 。（ 3） 一 般 情 况 下 ， 一 个 质 粒 只 含 一 个 ori， 构 成 一 个 独 立 的复 制 子 。（ 4） 穿 梭 质 粒 含 原 核 和 真 核 生 物 2个 复 制 子 ， 以 确 保 两 类 细胞 中 都 能 扩 增 。（ 5） 基 因 工 程 使 用 松 弛 复 制 子 ， 以 获 得 更 多 的 基 因 产 品 。复 制 子 -是 一 段 包 括 复 制 起 始 位 点 ， 反 式 因 子 作 用 在 内 的 DNA片 段 ， 其 功 能 是 通 过 复 制 使 质 粒 能 稳 定 存 在 宿 主 菌 内 。 1) Ori 复 制 起 始 点 （ origin， ori） 71 2) 抗 生 素 抗 性 基 因genotype 编 码 产 物 功 能 （ phenotype）Ampr 酶 水 解 内 酰 胺 环 ， 解 除 氨 苄 的 毒 性tetr 1个 膜 蛋 白 可 以 阻 止 四 环 素 进 入 细 胞camr 乙 酰 转 乙 酶 生 成 氯 霉 素 羟 乙 酰 基 衍 生 物 ， 使 之 失去 毒 性neo r（ kanr） 氨 基 糖 苷 磷 酸 转移 酶 使 G418、 新 霉 素 、 卡 那 霉 素 失 活hygr 潮 霉 素 磷 酸 转移 酶 使 潮 霉 素 失 活 72 是 多 个 限 制 酶 识 别 的 一 段 DNA顺 序 ， 以便 克 隆 /插 入 外 源 基 因 /DNA片 段3) MCS多 克 隆 位 点（ multiple cloining site， MCS） 克 隆 载 体 元 件 以 及 性 质 E coli表 达 载 体 哺 乳 动 物 质 粒 细 胞 表 达 载 体1. Ori 能 在 受 体 细 胞 中 复 制 ， 含 有 复 制 位 点 （ 起 点 ）2. Ampr 抗 生 素 抗 性 基 因 可 以 便 利 加 以 检 测3. MCS 多 克 隆 位 点 ， 克 隆 携 带 外 源 基 因 片 段 4. 载 体 可 导 入 宿 主 细 胞 （ 生 物 学 /非 生 物 学 方 法 ） 1. Ori2.Ampr3.Mcs4. Promoter5. SDs Rbs 6.Terms7.可 导 入 E.coli 1.orip 在 E.coli中 能 作 复 制 起始 位 点2.Ampr 细 菌 抗 生 素 抗 性 基 因3.K anr 真 核 细 胞 （ 哺 乳 类 ） 药物 抗 性 基 因4.Orie 真 核 细 胞 复 制 起 始 位 点5.Mcs 多 克 隆 位 点6. P/E 启 动 子 /增 强 子7. Terms 终 止 信 号8. 加 poly（ A） 信 号9. 可 导 入 真 核 细 胞 （ 哺 乳 类 ）（ 7 8别 为 转 录 翻 译 终 止 密 码， 真 核 细 胞 表 达 元 件 。 ）克 隆 载 体 和 表 达 载 体 的 元 件 构 成 理 想 的 克 隆 载 体 的 特 点1. 具 有 松 弛 型 复 制 子 （ ori）2. 在 复 制 子 外 存 在 数 个 单 一 的 酶 切 位 点 （ 多 克 隆 位 点 ）3. 具 有 插 入 失 活 的 筛 选 标 志 （ 抗 性 基 因 ）4. 分 子 量 较 小 和 较 高 的 拷 贝 数 75 LacZ基 因 ： 大 肠 杆 菌 -半 乳 糖 苷 酶 基 因 编 码 -肽 链 的 DNA序 列乳 糖 半 乳 糖 葡 萄 糖X-gal 5-溴 化 氯 淀 蓝半 乳 糖 深 蓝 色-半 乳 糖 苷 酶 +互 补 ： 载 体 中 的 LacZ基 因 编 码 -半 乳 糖 苷 酶 基 因 的 -肽 段 ， 突 变 型 lac-E.coli宿 主 可 表 达 该 酶 的 肽 段 （ -肽 段 缺 失 ） ， 只 有 宿 主 和 载 体 同 时 表 达 这 两个 片 段 形 成 互 补 时 ， 才 具 有 -半 乳 糖 苷 酶 活 性 。 76 2、 噬 菌 体 载 体 溶 菌 性 周 期 溶 源 性 周 期 77gt10（ 插 入 型 ） 结 构Cos： Coshesive end site 可 互 补 的 粘 性 末 端 ， 当 噬 菌 体 侵 入 宿 主 细 胞 后 ，线 状 DNA分 子 借 助 粘 性 末 端 连 结 成 环 状 分 子 。 (1)噬 菌 体 载 体 小 分 子 外 源 DNA片 段 78 (2) 黏 粒 载 体 （ 又 名 柯 斯 质 粒 ）黏 粒 质 粒 ：由 质 粒 和 噬 菌 体的 cos黏 性 末 端 构建 而 成 。 79 (3) 单 链 噬 菌 体l胞 内 为 双 链 ， 胞 外 为 单 链 。l复 制 型 为 双 链 环 状 DNA，可 按 细 菌 质 粒 使 用 。l单 链 可 用 作 测 序 、 制 备 探针 等 。 3、 穿 梭 载 体 定 义 ： 在 原 核 生 物 载 体 的 基 础 上 进 行 适当 的 改 造 ， 构 建 出 同 时 带 有 两 种 细 胞（ 原 核 生 物 细 胞 和 真 核 生 物 细 胞 ） 的 复制 起 始 点 ， 并 可 在 两 种 细 胞 中 复 制 和 存在 的 载 体 。 80（ 二 ） 逆 转 录 病 毒 载 体l病 毒 基 因 组 自 身 含 有 完 整 高 效 的 调 控 元 件l病 毒 可 通 过 主 动 感 染 方 式 进 入 宿 主 细 胞 ， 并 能 有 效 地 整合 到 宿 主 染 色 体 基 因 组 中 ， 与 染 色 体 一 起 复 制 、 长 期 存在l逆 转 录 病 毒 作 为 载 体 需 要 相 应 的 外 包 装 ， 以 形 成 完 整 的体 系 最 常 用 的 穿 梭 载 体 ：（ 一 ） SV40（ 猿 猴 病 毒 ） 载 体l 用 SV40 DNA与 外 源 DNA构 建 重 组 子 ， 转 染 细 胞 后 允 许 细 胞形 成 含 外 源 DNA的 病 毒 颗 粒l 重 组 子 不 包 装 成 病 毒 颗 粒 ， 而 在 细 胞 中 复 制 或 整 合 到 染色 体 组 中 81 4、 人 工 染 色 体 酵 母 人 工 染 色 体 （ YAC） 细 菌 人 工 染 色 体 （ BAC） 噬 菌 体 P1衍 生 的 人 工 染 色 体 （ PAC） 哺 乳 动 物 人 工 染 色 体 （ MAC） 82 YAC主 要 调 控 元 件 着 丝 粒 ： 保 证 染 色 体 细 胞 分 裂 过 程 中 正 确 分 配 到子 代 细 胞 端 粒 ： 防 止 染 色 体 被 核 酸 外 切 酶 降 解 复 制 起 始 点和 限 制 性 内 切 酶 位 点 筛 选 标 志 ： 酵 母 中 一 般 通 过 色 氨 酸 、 亮 氨 酸 、 组氨 酸 或 尿 嘧 啶 的 合 成 基 因 产 物 插 入 失 活 而 进 行 筛选 原 核 序 列 及 调 控 元 件 ： 包 括 大 肠 杆 菌 复 制 起 始 点 、Amp r基 因 等 83 YAC作 为 载 体 的 主 要 特 点 酵 母 是 单 细 胞 真 核 生 物 ， 培 养 方 便 酵 母 的 真 核 细 胞 转 录 系 统 ， 有 利 于 表 达 真 核 生 物基 因 装 载 容 量 大 ， 可 达 Mbp水 平 DNA片 段 连 接 到 YAC载 体 的 （ 两 ） 臂 上 形 成 重 组 体 ，将 重 组 体 通 过 常 规 方 法 导 入 酵 母 已 广 泛 应 用 于 各 种 生 物 基 因 组 计 划 84 基 因 工 程 前 考 虑 的 4个 问 题 ： (1)基 因 工 程 的 目 的 克 隆 扩 增 /表 达 : 生 产 产 品 基 因 治 疗 (2)克 隆 片 段 的 大 小 运 载 多 大 重 量 的 车 子 。 (3)受 体 细 胞 类 型 真 核 /原 核 /穿 梭 。 (4)载 体 本 身 及 其 元 件 的 质 量 不 能 搞 成 “ 豆 腐 渣 工 程 ” ， 要 “ 强 大 阵容 ” 。 85 第 三 节 DNA重 组 与 鉴 定DNA重 组 技 术将 不 同 来 源 的 DNA分 子 进 行 特 异 地 切 割获 得 的 目 的 基 因 或 DNA片 段 与 载 体 连 接重 组 的 DNA分 子 导 入 相 应 的 宿 主 细 胞在 宿 主 细 胞 中 进 行 无 性 增 殖 86 一 、 目 的 片 段 与 载 体 连 接二 、 转 化 或 转 染三 、 筛 选 重 组 子重 组 DNA技 术 的 基 本 过 程 DNA连 接 酶 酶 促 生 化 反 应连 接 反 应 的 最 适 合 温 度 是 1216度外 源 目