综合化学实验配位化学和生物无机化学部分

综合化学实验配位化学和生物无机化学部分氨 基 酸 铜 配 合 物 的 模 板 合 成及 其 对 质 粒 DNA的 切 割 指 导 教 师 ： 毛 宗 万 刘 文 婷 黄 华 珍 中 山 大 学 化 学 与 化 学 工 程 学 院2013年 09月 实 验 1 氨 酸 铜 配 合 物 的 合 成 和 表 征 模 板 合 成 IR光 谱 表 征 自 由 基 的 UV光 谱 检 测实 验 4 DNA提 取 及 其 与 氨 酸 铜 配 合 物 的 作 用 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 凝 胶 成 像总 学 时 ： 15 学 时地 点 ： 丰 盛 堂 212室 实 验 内 容 超 螺 旋 DNA 缺 刻 型 DNA 线 型 DNA 自 由 基 机 理自 由 基 进 攻 糖 环 或 碱 基 ，导 致 氧 化 破 坏酯 水 解 机 理亲 核 试 剂 进 攻 磷 原 子 ， 发生 亲 核 取 代 反 应酯 水 解 机 理 优 于 自 由 基 机 理 DNA结 构 及 其 断 裂 方 式 l配 合 物 与 未 受 损 的 DNA表 面 结 合 并 诱 导 其 断 裂l进 一 步 在 新 的 断 裂 处 结 合l断 裂 反 应l互 补 链 的 断 裂 DNA的 自 由 基 断 裂 实 验 背 景 模 拟 博 莱 霉 素 在 天 然 物 质 中 ， 由 5 个 氨 基 酸 、 2 个 六 碳 糖 和 1 个 氨 基侧 链 构 成 的 博 来 霉 素 （ bleomycin） 可 导 致 DNA链 的 断 裂 ,从而 作 为 一 族 广 谱 抗 菌 抗 肿 瘤 药 物 。 导 致 DNA链 的断 裂 原 因 是 由 于 博来 霉 素 分 子 的 一 部分 是 铁 或 铜 的 配 合物 ， 这 类 配 合 物 能够 产 生 导 致 DNA链断 裂 的 自 由 基 。 CuP-3A的 配 位 结 构 示 意 图博 莱 霉 素 的 活 性 中 心 Pamatong, F. V.; Detmer. C. A., III; Bocarsly, J. R.; J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 5339. Detmer. C. A., III; Pamatong, F. V.; Bocarsly, J. R.; Inorg. Chem., 1996, 21, 6292. HN NHO Cu(II)NH3+O OOHN NHO Cu(II)NH3+O OO博 莱 霉 素 的 模 型 化 合 物Cu2+ + e- = Cu+ Cu+ + H2O2 = Cu2+ + OH- + OH OHH2N OA OHH2N OAO2N 2CH2O ONH OA ONH OAO2N CuCu2+NEt3 ONH OA ONH OA-Cl+H3N Cu + + 1 Zn/HCl2 Cu(NO3)2 A = H, phen, . 1 2 氨 基 酸 铜 化 合 物 的 合 成 路 线 OHH2N OA OHH 2N OA OH2N OA OH 2N OA Cu Cu2+NEt 3 HCHO OH2N OA ON OA CuHHO2N - OH2N OA ONH OAO2N CuON OA ONH OAO2N Cu H2C-ONH OA ONH OAO2N Cu HCHO 模 板 反 应 的 化 学 机 理 化 合 物 1的 红 外 光 谱 ONH OONH OO2N Cu (COO-)(COO-) (NO2)(NO2) 化 合 物 2的 红 外 光 谱 ONH OONH O-Cl+H3N Cu (COO-) (COO-) (NH2) 氢 氧 自 由 基 的 形 成 和 UV光 谱 检 测由 于 罗 丹 明 B可 与 H O迅 速 反 应 ， 并 在 553nm有 强吸 收 ， 因 此 我 们 可 以 利 用 此 反 应 采 用 分 光 光 度 法 检验 H O的 生 成 。 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 是 一 种 非 常 简 便 、 快 速 、 最 常 用 的 分 离纯 化 和 鉴 定 核 酸 的 方 法 琼 脂 糖 是 从 海 藻 中 提 取 的 一 种 线 状 高 聚 物 根 据 琼 溶 解 温 度 ， 把 琼 脂 糖 分 为 一 般 琼 脂 糖 和 低 熔 点 琼脂 糖 低 熔 点 琼 脂 糖 熔 点 为 62 65 ， 溶 解 后 在 37 下 维 持 液体 状 态 约 数 小 时 ， 主 要 用 于 DNA片 段 的 回 收 ， 质 粒 与 外源 性 DNA的 快 速 连 接 等 凝 胶 浓 度 选 择 琼 脂 糖 凝 胶 的 浓 度 与 DNA分 离 范 围琼 脂 糖 浓 度 (%) 线 型 DNA分 子 的 分 离 范 围 (Kb)0.3 5 600.6 1 200.7 0.8 100.9 0.5 71.2 0.9 61.5 0.2 312.0 0.1 2 电 泳 缓 冲 液 常 用 三 种 缓 冲 液 Tris-硼 酸 (TBE)、 Tris-乙 酸 (TAE)、 Tris-磷 酸 (TPE) TBE与 TPE： 缓 冲 容 量 高 ， DNA分 离 效 果 好 ， 但 TPE在DNA片 段 回 收 时 含 磷 酸 盐 浓 度 高 ， 容 易 使 DNA沉 淀 TAE： 缓 冲 容 量 低 ， 但 价 格 较 便 宜 ， 因 而 推 荐 选 用 TAE。缓 冲 液 中 的 EDTA 可 螯 合 二 价 阳 离 子 ， 从 而 抑 制 DNA酶的 活 性 ， 防 止 PCR扩 增 产 物 降 解 核 酸 电 泳 的 指 示 剂 指 示 剂 ： 溴 酚 兰 、 二 甲 苯 青 溴 酚 兰 ： 在 碱 性 液 体 中 呈 紫 兰 色 ， 电 泳 中 ， 溴 酚 兰 的 迁 移率 与 双 链 线 性 DNA片 段 二 甲 苯 青 ： 水 溶 液 呈 兰 色 ， 电 泳 时 ， 其 迁 移 速 率 与 双 链 线性 DNA大 致 相 当琼 脂 糖 凝 胶 浓 度 0.6% 1% 1.4% 2%迁 移 率 1Kb 0.6Kb 0.2Kb 0.15Kb 琼 脂 糖 凝 胶 浓 度 1% 1.4%迁 移 率 2Kb 1.6Kb 核 酸 电 泳 的 染 色 剂 溴 化 乙 锭 一 种 荧 光 染 料 ， EB分 子 可 嵌 入 核酸 双 链 的 碱 基 对 之 间 ， 在 紫 外 线激 发 下 ， 发 出 红 色 荧 光 可 在 凝 胶 电 泳 液 中 加 入 终 浓 度 为0.5ug/ml的 EB， 有 时 亦 可 在 电 泳后 ， 将 凝 胶 浸 入 该 浓 度 的 溶 液 中染 色 10 15min 琼 脂 糖 凝 胶 EB染 色 ， 肉 眼 可 见 核酸 电 泳 带 ， 其 DNA量 一 般 5ng 溴 化 乙 锭 太 多 ， 凝 胶 染 色 过 深 ，核 酸 电 泳 带 看 不 清 时 ， 可 将 凝 胶放 入 蒸 馏 水 浸 泡 30min后 再 观 察 ethidium bromide， EBN+H2N NH2C2H5Br- DNA断 裂 的 凝 胶 电 泳 图 超 螺 旋 DNA 缺 刻 型 DNA 线 型 DNA 电 泳 实 验 装 置 电 泳 仪 （ 普 通 ） 电 泳 槽 （ 水 平 平 板 ） 灌 胶 模 具 等 电 泳 实 验 方 法 洗 净 电 泳 槽 ， 架 好 梳 子配制琼脂糖凝胶及倒胶上样与通电结果观察 配 制 琼 脂 糖 凝 胶 及 倒 胶 0.5 TBE电 泳 缓 冲 液 100ml于 三 角 烧 瓶 中 ， 称 取一 定 量 的 琼 脂 糖 粉 放 入 后 沸 水 锅 或 微 波 炉 内 加 热熔 化 ， 冷 却 至 60 (需 要 时 可 加 入 EB)， 倒 入 电 泳槽 中 ， 待 凝 固 。 向 电 泳 槽 中 倒 入 0.5 TBE， 其 量 以 没 过 胶 面2mm为 宜 ， 小 心 移 去 梳 子 （ 如 样 品 孔 内 有 气 泡 ，应 除 去 ） 上 样 与 通 电 在 DNA样 品 中 加 入 0.2体 积 的 载 样 缓 冲 液 ， 混 匀 后 ， 加 入样 品 孔 内 接 通 电 源 ， 一 般 红 色 为 正 极 黑 色 为 负 极 ， 切 记 DNA样 品 由负 极 往 正 极 泳 动 （ 靠 近 加 样 孔 的 一 端 为 负 ） ， 电 压 为 1 5V/cm（ 长 度 以 两 个 电 极 之 间 的 距 离 计 算 ） 根 据 指 示 剂 泳 动 的 位 置 ， 判 断 是 否 终 止 电 泳 。 一 般 电 泳条 件 为 ： 电 压 90V， 时 间 40min。 结 果 观 察 和 记 录 紫 外 仪 上 观 察 电 泳 带 及 其 位 置 拍 照 进 一 步 使 用 软 件 对 光 密 度 进 行 分 析 合 成 实 验 要 点 检 查 回 流 装 置 是 否 保 持 干 燥 硝 酸 铜 在 称 量 前 用 滤 纸 吸 干 固 体 表 面 潮 解 的 溶 液 合 成 实 验 中 前 半 个 小 时 注 意 观 察 反 应 混 合 物 的 颜 色 变 化 ，亮 蓝 色 或 紫 蓝 色 为 反 应 正 常 实 验 中 化 合 物 合 成 与 DNA断 裂 实 验 需 交 叉 进 行 ， DNA断裂 所 需 的 配 合 物 由 准 备 室 提 供 若 硝 基 还 原 使 用 了 较 多 溶 剂 ， 需 使 用 旋 转 蒸 发 器 除 去 多 余溶 剂 凝 胶 电 泳 照 相 需 戴 手 套 l 模 板 合 成 大 环 化 合 物 的 合 成 方 法 （ 212室 ）l 旋 转 蒸 发 器 除 去 多 余 溶 剂 （ 212室 ）l 红 外 光 谱 化 合 物 结 构 表 征 （ 210室 ）l 紫 外 可 见 光 谱 跟 踪 罗 丹 明 B与 氢 氧 自 由 基 的反 应l 凝 胶 电 泳 切 割 DNA （ 317室 ）l 凝 胶 成 像 分 析 检 测 DNA断 裂 状 况 （ 317室 ）实 验 技 术 和 方 法 实 验 要 求 做 好 预 习 （ 查 阅 药 品 及 溶 剂 的 性 质 、 羧 基 和 硝 基 的 IR特 征峰 值 、 光 谱 技 术 原 理 及 思 考 题 预 习 等 ） 实 验 中 做 好 实 验 记 录 及 相 关 计 算 （ 包 括 实 验 现 象 、 产 品 重量 、 产 率 等 ） 做 好 每 一 次 测 试 ， 并 打 印 结 果 实 验 结 束 时 提 交 最 终 产 品 和 测 试 图 谱 供 检 查 对 实 验 结 果 作 简 要 讨 论 下 一 次 实 验 提 交 本 次 实 验 报 告 遵 守 实 验 规 则 ， 严 禁 违 规 操 作 ， 做 好 清 洁 值 日 （ 配 位 化 学 、 生 物 无 机 化 学 、 生 物 技 术 ）l V. V. Gerbeleu, V. B. Arion, J. Burgess, “Template synthesis of macrocyclic compounds”, WILEY-VCH verlag GmbH, 1999.l 计 亮 年 ， 黄 锦 汪 、 莫 庭 焕 等 编 著 ， 生 物 无 机 化 学 （ 第 二 版 ） ， 中山 大 学 出 版 社 ， 2001。l 杨 频 ， 高 飞 编 著 ， 生 物 无 机 化 学 ， 科 学 出 版 社 ， 2002。l F.奥 斯 伯 ， R.布 伦 特 ， R.E.金 斯 顿 等 ， 精 编 分 子 生 物 学 实 验 指南 ， 1998年 6月 第 1版 。 参 考 书