细胞因子与黏附分子检测

第 一 章 血 液 标 本 采 集 与 处 理临床免疫学检验技术 第 十 六 章 细 胞 因 子 与 黏 附 分 子 检 测郑 晓 群 目 录 第 一 节 概 述第 二 节 临 床 常 用 的 测 定 方 法第 三 节 细 胞 因 子 与 黏 附 分 子 测 定 的 临 床 应 用 第 一 节 概 述 重 点 提 示细 胞 因 子 与 黏 附 分 子 概 念细 胞 因 子 的 作 用 特 点细 胞 因 子 的 生 物 学 功 能黏 附 分 子 的 生 物 学 功 能 概 念 细 胞 因 子 （ cytokine）是 由 免 疫 细 胞 及 组 织 细 胞 表 达 并 分 泌 的 ， 在 细 胞 间发 挥 相 互 调 控 作 用 的 一 类 小 分 子 蛋 白 质 或 多 肽 ， 通 过 与细 胞 表 面 相 应 受 体 的 结 合 发 挥 生 物 学 效 应 。 概 念 黏 附 分 子 （ adhesion molecules， AM）是 由 细 胞 产 生 、 介 导 细 胞 间 或 细 胞 与 细 胞 外 基 质间 相 互 结 合 的 分 子 ， 以 受 体 -配 体 结 合 的 形 式 发 挥 作 用。 一 、 细 胞 因 子 及 其 受 体 的 特 性 与 功 能白 细 胞 介 素 （ interleukin， IL）干 扰 素 （ interferon， IFN）集 落 刺 激 因 子 （ colony stimulating factor， CSF）肿 瘤 坏 死 因 子 （ tumor necrosis factor， TNF）生 长 因 子 （ growth factor， GF) 趋 化 因 子 （ chemokine）细 胞 因 子 的 种 类 一 、 细 胞 因 子 及 其 受 体 的 特 性 与 功 能低 分 子 量 的 多 肽 或 糖 蛋 白 ， 大 部 分 为 单 体 ， 半 衰期 短 。具 有 高 效 性 、 多 效 性 、 重 叠 性 、 网 络 性 、 协 同 性和 拮 抗 性 。细 胞 因 子 的 特 性 一 、 细 胞 因 子 及 其 受 体 的 特 性 与 功 能参 与 调 控 免 疫 细 胞 的 发 育 、 分 化 和 功 能 。参 与 调 控 机 体 的 免 疫 应 答 。参 与 体 内 免 疫 调 节 网 络 等 作 用 。细 胞 因 子 生 物 学 功 能 一 、 细 胞 因 子 及 其 受 体 的 特 性 与 功 能细 胞 因 子 与 相 应 受 体 结 合 后 发 挥 效 应 。由 胞 外 区 、 跨 膜 区 和 胞 内 区 三 部 分 构 成 。组 织 反 应 性 ： 受 体 的 分 布 及 密 度 。膜 型 受 体 与 可 溶 型 受 体 。细 胞 因 子 受 体 的 共 同 特 性 二 、 黏 附 分 子 的 特 性 与 功 能选 择 素 家 族 (selectin family )钙 黏 素 家 族 (cadherin family)整 合 素 家 族 （ integrin family)免 疫 球 蛋 白 超 家 族 （ Immunogolobulin superfamily,IgSF) 分 类 二 、 黏 附 分 子 的 特 性 与 功 能缺 少 跨 膜 和 胞 内 部 分 ， 分 子 量 小 。可 直 接 分 泌 到 血 液 和 其 他 体 液 。具 有 黏 附 分 子 的 结 合 活 性 。其 水 平 的 增 高 程 度 与 疾 病 相 关 ：脓 毒 血 症 ： 可 溶 性 E-选 择 素 ， 升 高 20倍 23倍 。 HIV感 染 ： 可 溶 性 L-选 择 素 ， 升 高 2倍 3倍 。 可 溶 型 黏 附 分 子 二 、 黏 附 分 子 的 特 性 与 功 能参 与 免 疫 细 胞 的 分 化 和 发 育参 与 免 疫 应 答 和 炎 症 反 应参 与 伤 口 愈 合 、 血 栓 形 成淋 巴 细 胞 的 归 巢参 与 调 节 细 胞 凋 亡 生 物 学 功 能 第 二 节 临 床 常 用 的 测 定 方 法 重 点 提 示基 本 方 法方 法 学 评 价注 意 事 项 检 测 水 平 基 因 水 平 ： 分 子 生 物 学 法蛋 白 水 平 活 性 ： 生 物 学 方 法含 量 ： 免 疫 学 测 定 法 一 、 酶 联 免 疫 吸 附 试 验夹 心 法 ELISA： 一 步 法 和 两 步 法单 克 隆 抗 体 或 多 克 隆 抗 体用 于 细 胞 因 子 检 测可 溶 型 细 胞 因 子 受 体 或 黏 附 分 子 检 测首 选 方 法 基 本 方 法 一 、 酶 联 免 疫 吸 附 试 验特 异 、 简 便成 本 低 、 易 于 推 广可 大 批 量 同 时 检 测 且 废 弃 物 便 于 处 理敏 感 性 偏 低不 能 判 断 细 胞 因 子 的 生 物 学 活 性 优 点 缺 点 一 、 酶 联 免 疫 吸 附 试 验检 测 标 本 ： 建 议 采 用 血 浆 （ 肝 素 或 EDTA抗 凝 血 ）检 测 条 件 ： 适 时 、 适 当 刺 激 剂 、 检 测 时 点干 扰 因 素 ： 标 本 严 重 溶 血 、 污 染 、 分 泌 与 降 解 注 意 事 项 二 、 化 学 发 光 酶 免 疫 试 验CLEIA： 双 抗 体 夹 心 法自 动 化 分 析体 液 中 细 胞 因 子 或 可 溶 型 细 胞 因 子 受 体 的 定 量 基 本 方 法 二 、 化 学 发 光 酶 免 疫 试 验特 异 性 好 、 灵 敏 度 高 、 线 性 范 围 宽试 剂 稳 定 ， 可 自 动 化 检 测缺 点 是 不 能 区 分 细 胞 因 子 的 生 物 学 活 性 方 法 学 评 价 三 、 流 式 细 胞 术基 于 荧 光 抗 体 染 色 技 术 并 利 用 流 式 细 胞 仪 高 分 辨力 所 建 立 的 方 法 。单 个 细 胞 水 平 的 检 测 。用 于 细 胞 内 细 胞 因 子 、 细 胞 表 面 黏 附 分 子 和 细 胞因 子 受 体 的 检 测 。 基 本 方 法 三 、 流 式 细 胞 术 基 本 步 骤 1 分 离 和 培 养 待 检 细 胞 2 细 胞 破 膜 与 固 定 3 封 闭 非 特 异 性 结 合 位 点 4 染 色 与 分 析 三 、 流 式 细 胞 术区 分 不 同 分 泌 特 性 的 细 胞 亚 群 ： Th1细 胞 IFN-Th2细 胞 IL-4细 胞 表 面 的 黏 附 分 子 或 细 胞 因 子 受 体 ：直 接 或 间 接 荧 光 抗 体 染 色无 需 作 细 胞 固 定 和 非 特 异 性 结 合 位 点 的 封 闭 三 、 流 式 细 胞 术具 有 特 异 、 高 效 、 灵 敏 等 特 点 ， 进 行 多 参 数 相 关分 析 接 近 生 物 体 的 分 析 条 件 ， 更 准 确 反 映 体 内 状 况 。缺 点 是 流 式 细 胞 仪 较 昂 贵 ， 不 易 普 及 使 用 。方 法 学 评 价 三 、 流 式 细 胞 术标 本 处 理 ： 活 细 胞 ， 保 持 良 好 状 态对 照 选 择 ： 未 刺 激 对 照 、 激 活 对 照 、 同 型 对 照荧 光 素 选 择 ：低 表 达 -PE、 APC高 表 达 -FITC 注 意 事 项 四 、 酶 联 免 疫 斑 点 实 验 基 本 方 法ELISPOT每 个 斑 点 代 表 单 个 分 泌待 测 细 胞 因 子 的 细 胞 。斑 点 颜 色 深 浅 与 细 胞 分泌 细 胞 因 子 的 含 量 相 关 。 四 、 酶 联 免 疫 斑 点 实 验优 于 传 统 分 泌 细 胞 的 检 测类 似 于 体 内 的 实 验 环 境比 常 规 ELISA 法 的 灵 敏 度 高 200 倍引 入 生 物 素 与 亲 合 素 放 大 系 统 ， 可 大 大 提 高 灵 敏 度方 法 学 评 价 四 、 酶 联 免 疫 斑 点 实 验选 用 的 底 物 应 在 反 应 后 形 成 不 溶 性 产 物抗 体 ： 高 亲 和 力 、 高 特 异 性 、 低 内 毒 素 的 特 点同 时 检 测 两 种 细 胞 因 子 ， 如 IL-2 和 IL-4结 核 感 染 T细 胞 斑 点 试 验 注 意 事 项 五 、 免 疫 学 测 定 方 法 学 评 价影 响 因 素 较 少 ， 特 异 性 高操 作 简 便 、 快 速 ， 易 于 推 广大 部 分 细 胞 因 子 均 有 商 品 化 试 剂 盒 ， 方 便 检 测重 复 性 好 ， 实 验 结 果 稳 定 优 点 五 、 免 疫 学 测 定 方 法 学 评 价所 测 定 的 只 是 蛋 白 含 量 ， 与 其 生 物 活 性 不 一 定 呈 正比 。 结 果 与 所 用 的 抗 体 来 源 及 亲 和 力 有 很 大 的 关 系 。敏 感 性 相 对 较 低 ， 不 如 生 物 学 测 定 法 。干 扰 测 定 ： 标 本 中 可 溶 性 受 体 ， 某 些 细 胞 因 子 结 合蛋 白 或 载 体 蛋 白 。 缺 点 第 三 节细 胞 因 子 与 黏 附 分 子 测 定 的 临 床 应 用 重 点 提 示临 床 应 用 原 则特 定 疾 病 的 辅 助 诊 断 一 、 临 床 应 用 原 则全 身 免 疫 或 炎 症 状 态 ： 血 浆 或 血 清细 胞 分 泌 细 胞 因 子 特 性 ： 外 周 血 单 个 核 细 胞 或 相 应 细 胞炎 症 局 部 细 胞 因 子 的 水 平 ： 局 部 分 泌 液细 胞 内 定 位 检 测 ： 相 应 细 胞基 因 表 达 水 平 ： 相 应 细 胞疗 效 观 察 和 预 后 判 断 ： 急 性 期 和 恢 复 期 双 份 标 本 细 胞 表 面 细 胞 因 子 受 体 或 黏 附 分 子 ： 细 胞 活 性 或 状 态标 本 的 适 当 选 取 一 、 临 床 应 用 原 则不 同 的 检 测 目 的 ， 选 择 适 宜 的 检 测 方 法 。联 合 应 用 不 同 的 检 测 方 法 ， 综 合 分 析 检 验 结 果 。 生 物 活 性 ： 生 物 学 方 法 基 因 水 平 ： 实 时 RT-PCR 细 胞 内 的 细 胞 因 子 ： FCM方 法 的 联 合 应 用 一 、 临 床 应 用 原 则复 杂 的 免 疫 调 节 或 效 应 网 络 系 统单 一 检 测 ： 不 能 提 供 有 效 的 疾 病 信 息联 合 检 测 ， 综 合 分 析项 目 的 联 合 检 测 二 、 特 定 疾 病 的 辅 助 诊 断细 胞 因 子 风 暴变 态 反 应 性 疾 病自 身 免 疫 病免 疫 缺 陷 病器 官 移 植 排 斥 反 应恶 性 肿 瘤细 胞 因 子 与 疾 病 二 、 特 定 疾 病 的 辅 助 诊 断动 脉 粥 样 硬 化肾 脏 疾 病肝 脏 疾 病自 身 免 疫 病黏 附 分 子 与 疾 病 三 、 评 估 机 体 的 免 疫 状 态机 体 免 疫 应 答 的 强 弱 ， 可 通 过 细 胞 因 子 或 黏 附 分 子的 表 达 水 平 来 反 映 。当 疾 病 好 转 或 恢 复 时 ， 其 免 疫 状 态 调 整 ， 细 胞 因 子或 黏 附 分 子 也 恢 复 正 常 。 四 、 疾 病 疗 效 监 测 及 指 导 用 药人 工 重 组 细 胞 因 子 的 应 用选 择 细 胞 因 子 的 种 类 及 剂 量疾 病 疗 效 监 测细 胞 因 子 拮 抗 剂 或 抗 体 应 用 本 章 小 结细 胞 因 子 与 黏 附 分 子 是 构 成 免 疫 应 答 的 重 要 物 质 基 础 ，检 测 这 些 分 子 可 反 映 机 体 的 免 疫 状 态 。免 疫 学 测 定 法 是 细 胞 因 子 与 黏 附 分 子 常 用 的 检 测 方 法 ，包 括 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 、 化 学 发 光 酶 免 疫 试 验 、 流 式 细 胞术 和 酶 联 免 疫 斑 点 实 验 。 本 章 小 结免 疫 学 测 定 法 检 测 的 是 细 胞 因 子 或 黏 附 分 子 的 蛋 白 含量 ， 具 有 特 异 性 高 、 操 作 简 便 、 重 复 性 好 ， 实 验 结 果 稳 定 ，测 定 影 响 因 素 较 少 等 特 点 。细 胞 因 子 与 黏 附 分 子 的 测 定 应 结 合 检 测 标 本 、 检 测 方法 及 联 合 检 测 做 出 综 合 考 虑 ， 主 要 用 于 ： 特 定 疾 病 的 辅 助诊 断 ； 机 体 免 疫 状 态 的 评 估 ； 疾 病 疗 效 的 监 测 和 指 导 用 药。