杂交瘤技术和单克隆抗体技术

第 四 讲 杂 交 瘤 细 胞 和 单 克 隆 抗 体 技 术第 一 节 、 免 疫 的 基 本 知 识一 、 免 疫 系 统 ： 分 非 适 应 性 免 疫 和 适 应 性 免 疫 两 类 。 1、 非 适 应 性 免 疫 是 由 非 特 异 性 反 应 的 细 胞 介 导 的 。 如 ： 巨噬 细 胞 的 吞 噬 作 用 ， 泌 细 胞 分 泌 的 溶 菌 酶 ， 以 及 中 性 细 胞 造成 的 细 胞 裂 解 机 制 。 2、 适 应 性 免 疫 ： 是 针 对 特 定 分 子 ， 而 且 可 经 反 复 暴 露 于 外源 分 子 使 之 加 强 淋 巴 细 胞 合 成 细 胞 表 面 受 体 或 分 泌 特 异 性 蛋白 结 合 外 源 分 子 。 这 些 分 泌 的 蛋 白 称 为 抗 体 ； 可 与 抗 体 结 合的 分 子 被 称 为 抗 原 。 当 一 个 分 子 被 用 于 诱 导 适 应 性 反 应 时 ，这 个 分 子 就 被 叫 做 免 疫 原 。 3、 免 疫 系 统 含 有 109以 上 淋 巴 细 胞 遍 布 全 身 ， 保 证 了 它 们 在任 何 部 位 都 能 迅 速 反 应 。 淋 巴 细 胞 由 骨 髓 中 的 原 始 干 细 胞 不断 产 生 ， 经 血 液 及 淋 巴 系 统 循 环 ， 暂 时 停 顿 并 积 聚 于 称 作 淋巴 器 官 的 特 异 化 的 结 构 中 ， 在 哺 乳 动 物 中 就 是 淋 巴 结 和 肝 脏 。在 免 疫 反 应 过 程 中 ， 免 疫 原 积 聚 于 一 个 淋 巴 器 官 中 ， 这 个 淋巴 器 官 就 变 成 了 免 疫 反 应 的 焦 点 。 B细 胞 ： 分 泌 抗 体 ， 并 在 细 胞 表 面 携 带 同 一 抗 体 的 修 饰 型 ，功 能 相 当 于 受 体 。 毒 性 T细 胞 ： 携 带 结 合 抗 原 的 细 胞 表 面 受 体 。 辅 助 T细 胞 ： 在 控 制 B细 胞 和 细 胞 毒 性 T细 胞 反 应 方 面 起 关键 的 调 节 作 用 。 体 液 介 导 的 适 应 性 免 疫 反 应 ： 体 液 反 应 引 发 产 生 可 结 合 外来 抗 原 的 循 环 抗 体 ， 由 B淋 巴 细 胞 产 生 ， 由 辅 助 T淋 巴 细 胞介 导 是 抗 体 技 术 的 基 础 。 细 胞 介 导 的 适 应 性 免 疫 反 应 ： 毒 性 T淋 巴 细 胞 结 合 于 外 来或 感 染 的 细 胞 ， 随 后 将 这 些 细 胞 裂 解 ， 辅 助 T细 胞 参 与 该 反应 。二 、 免 疫 系 统 能 特 异 性 地 对 无 数 种 分 子 反 应 。 免 疫 系 统 持 续 地 受 无 数 抗 原 刺 激 。 免 疫 系 统 的 一 个 主 要 形式 是 它 能 合 成 大 量 的 抗 体 及 细 胞 表 面 受 体 。 各 个 带 有 不 同 抗原 结 合 位 点 的 抗 体 和 T细 胞 受 体 与 外 来 分 子 的 结 合 提 供 了 免疫 反 应 特 异 性 的 基 础 。 三 、 个 别 淋 巴 细 胞 识 别 个 别 抗 原一 个 细 胞 识 别 一 个 抗 原 ， 因 为 单 一 淋 巴 细 胞 上 的 所 有 抗原 受 体 是 相 同 的 。在 成 熟 淋 巴 细 胞 表 面 的 所 有 受 体 都 是 糖 蛋 白 ， 体 细 胞 基因 重 组 、 突 变 及 基 因 转 录 后 加 工 等 使 受 体 产 生 107个 以 上 的结 合 位 点 。 抗 原 特 异 性 通 过 确 保 只 有 一 个 类 型 的 受 体 在 一个 细 胞 内 被 合 成 的 过 程 来 维 持 。虽 然 B细 胞 表 面 抗 体 和 T细 胞 表 面 受 体 都 具 有 类 似 的 结 构， 但 它 们 是 由 不 同 的 基 因 家 族 编 码 的 ， 其 表 达 具 有 细 胞 型的 特 异 性 。 B细 胞 上 的 表 面 抗 体 能 结 合 可 溶 性 抗 原 ， 而 T细胞 受 体 仅 仅 识 别 在 其 它 细 胞 表 面 展 示 的 抗 原 四 、 免 疫 系 统 能 将 外 来 微 生 物 和 分 子 与 自 身 成 分 区 别 开 来 。五 、 系 统 记 忆 每 一 次 与 外 来 抗 原 的 遭 遇 免 疫 反 应 遇 到 同 一 抗 原 时 一 次 比 一 次 强 ， 具 有 特 异 性 。 免疫 记 忆 可 以 延 续 动 物 终 生 。六 、 免 疫 反 应 的 许 多 性 质 是 通 过 克 隆 选 择 确 定 的 一 种 抗 原 活 化 一 种 淋 巴 细 胞 。 当 淋 巴 细 胞 表 面 受 体 结 合抗 原 时 ， B淋 巴 细 胞 就 被 活 化 ， 分 泌 抗 体 被 刺 激 而 增 殖 （ 急剧 分 裂 克 隆 ） 。七 、 一 个 有 效 免 疫 系 统 的 成 熟 是 由 广 泛 的 细 胞 间 信 息 交 换 来调 节 的 。 第 二 节 、 抗 体 分 子抗 体 是 具 有 共 同 结 构 和 功 能 形 式 的 一 大 类 糖 蛋 白 。 抗 体 分成 五 类 ： IgG、 IgM、 IgA、 IgE和 IgD（ 见 表 2-1） 。一 、 IgG类 抗 体 有 两 个 相 同 的 抗 原 结 合 位 点含 有 抗 原 结 合 位 点 的 两 个 区 域 被 称 作 Fab片 段 ， 涉 及 到 免疫 调 节 的 蛋 白 区 称 作 Fc片 段 ， 在 Fab和 Fc片 段 之 间 的 部 分 称作 铰 链 区 。重 链 分 子 量 为 5.5kDlt； 轻 链 分 子 量 为 2.5kDlt。二 、 不 同 类 型 抗 体 的 区 别IgG、 IgM、 IgA、 IgE和 IgD因 重 链 形 式 不 同 而 有 所 区 别 。它 们 的 重 链 分 别 称 作 、 、 、 和 。重 链 的 不 同 使 这 些 蛋 白 具 有 不 同 形 式 的 免 疫 功 能 ， 并 且 在完 成 反 应 成 熟 的 不 同 阶 段 发 挥 作 用 。 这 些 差 异 主 要 是 由 于 Fc片 段 上 的 蛋 白 序 列 不 同 所 致 。轻 链 只 有 两 种 ： 、 。 三 、 抗 体 轻 链 的 分 子 结 构比 较 轻 链 的 氨 基 酸 结 构 发 现 ， 轻 链 有 一 个 恒 定 区 和 一 个 可变 区 。 轻 链 由 220个 氨 基 酸 组 成 ， 分 为 两 个 区 ， 每 个 区 由 大约 110个 氨 基 酸 组 成 。 -NH2末 端 那 半 部 分 是 异 源 性 的 ， 称 为可 变 区 （ V） ； 羧 基 末 端 那 部 分 称 为 恒 定 区 （ C） 。恒 定 区 有 两 种 类 型 ： 一 种 是 决 定 轻 链 的 ， 另 一 种 是 决 定 轻 链 的 。 轻 链 基 因 位 于 第 6染 色 体 上 ， 而 轻 链 的 基 因 则 位于 第 16染 色 体 上 。四 、 抗 体 重 链 的 分 子 结 构重 链 的 序 列 也 存 在 可 变 区 和 恒 定 区 （ 图 2-1） 。 IgG重 链 含有 一 个 可 变 区 和 三 个 恒 定 区 ， 每 区 含 110个 氨 基 酸 ， 其 它 重链 含 有 附 加 的 恒 定 区 。IgG重 链 序 列 也 显 示 链 有 四 种 亚 类 ， 即 ： IgG1、 IgG2a、IgG2b和 IgG3。 鼠 重 链 多 肽 编 码 区 在 第 12染 色 体 上 。 五 、 重 链 和 轻 链 的 可 变 区 形 成 抗 原 结 合 位 点一 个 重 链 的 可 变 区 和 一 个 轻 链 的 可 变 区 结 合 形 成 一 个 抗 原结 合 位 点 。 可 变 区 的 异 质 性 提 供 了 动 物 有 效 进 行 免 疫 反 应 所需 的 无 数 结 合 位 点 的 基 础 。 序 列 异 质 性 并 不 是 由 整 个 可 变 区的 每 一 部 分 决 定 的 ， 而 是 集 中 在 与 抗 原 接 触 的 位 点 上 。 多 数可 变 性 决 定 于 每 一 个 链 的 三 个 短 区 ， 它 们 形 成 轻 链 的 三 个 超变 区 和 重 链 的 三 个 超 变 区 。 这 些 超 变 区 形 成 抗 原 抗 体 结 合 的接 触 残 基 的 主 体 ， 同 时 这 些 超 变 区 位 于 扩 展 进 入 抗 原 反 应 区的 短 环 上 。 由 于 它 们 是 实 际 的 抗 原 结 合 位 点 ， 故 被 认 为 是 互补 决 定 区 。六 、 功 能 性 、 轻 链 和 重 链 基 因 的 一 个 明 显 特 征 是 在 所 有细 胞 中 这 些 基 因 转 录 后 的 选 择 性 剪 接 是 不 同 的 （ 见 图 2） 。200个 V区 ， 4个 功 能 性 J区 。七 、 形 成 轻 链 pre-mRNA外 显 子 也 要 重 排 （ 图 3） 。 V-J-C-J-C。八 、 形 成 功 能 性 重 链 基 因 需 要 pre-mRNA外 显 子 的 重 排 （ 图 4） 。 50100种 可 变 区 ， 12个 D区 ， 4个 J区 。 九 、 这 些 重 组 及 其 它 机 制 产 生 了 无 数 的 抗 原 结 合 位 点 。十 、 等 位 基 因 排 斥 确 保 在 任 一 B细 胞 中 只 有 重 新 排 列 的 一个 轻 链 和 一 个 重 链 被 表 达 。 产 生 不 同 重 链 和 轻 链 的 基 因 重 组不 总 是 产 生 一 个 功 能 基 因 ， 在 B细 胞 分 化 过 程 中 ， 轻 链 重 排开 始 于 区 内 。 然 后 ， 若 二 倍 体 基 因 中 的 一 个 首 先 重 排 ， 产生 一 个 功 能 性 等 位 基 因 ， 另 一 个 拷 贝 则 进 行 重 组 。 若 二 个 重组 都 产 生 非 功 能 性 等 位 基 因 ， 那 么 重 组 就 要 位 点 开 始 ， 以 同样 的 机 制 产 生 功 能 性 重 链 。 一 旦 重 组 产 生 一 个 功 能 性 抗 体 ，一 个 未 知 的 机 制 就 制 止 进 一 步 重 组 。 将 抗 原 性 结 合 位 点 固 定， 直 到 细 胞 死 亡 。 这 个 机 制 叫 等 位 基 因 排 斥 。 它 可 以 解 释 为什 么 B淋 巴 细 胞 分 泌 的 只 有 一 种 抗 原 结 合 位 点 的 抗 体 和 抗 体只 有 一 种 类 型 的 轻 链 。十 一 、 其 它 ： 重 组 被 用 于 生 产 各 种 类 和 亚 类 的 抗 体 。 淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体技术 1960年 ， 法 国 的 Barski等 首 先 发 现 ， 两 种 不 同 类 型 的 细胞 在 混 合 培 养 的 过 程 中 会 自 发 融 合 形 成 融 合 细 胞 。 与 此 同时 ， 日 本 的 Okada也 发 现 紫 外 线 灭 活 的 仙 台 病 毒 (Sandai virus)可 以 诱 发 艾 氏 腹 水 瘤 细 胞 相 互 融 合 ， 在 此 基 础 上 用 灭活 的 仙 台 病 毒 诱 导 产 生 了 第 一 个 种 间 的 杂 交 细 胞 。 1976年 Kohler和 Milstein创 建 了 一 个 方 法 ， 他 们 将 分 泌 一种 特 异 性 抗 体 的 B细 胞 和 体 外 持 续 生 长 的 浆 细 胞 瘤 融 合 ， 产生 的 杂 交 细 胞 克 隆 表 达 了 抗 体 生 成 的 正 常 B细 胞 和 浆 细 胞 瘤细 胞 的 免 疫 球 蛋 白 基 因 ， 同 时 也 具 有 在 体 外 无 限 增 殖 的 能力 。 为 此 创 造 了 杂 交 瘤 (hybridoma)这 个 名 词 ， 以 描 述 一 个正 常 抗 体 生 成 细 胞 和 一 个 浆 细 胞 瘤 细 胞 的 融 合 产 物 。 由 于他 们 的 重 要 科 学 贡 献 ， Kohler和 Milstein在 1984年 荣 获 了 诺贝 尔 医 学 生 理 奖 。 一、免疫原性 许 多 外 源 分 子 、 病 毒 或 细 胞 单 纯 注 射 在 实 验 动 物 体 内 能引 起 强 的 抗 体 反 应 ， 而 一 些 物 质 却 不 能 ， 对 于 这 些 情 况 ，常 可 通 过 修 饰 抗 原 或 改 变 宿 主 而 使 免 疫 系 统 反 应 增 加 。 好 的 免 疫 原 分 子 必 须 具 备 以 下 条 件 ： 1、 抗 原 结 合 于 原 始 B细 胞 表 面 抗 体 分 子 对 于 抗 体 反 应 是绝 对 必 要 的 。 这 个 结 合 决 定 了 产 生 抗 体 的 特 异 性 。 因 为 表面 抗 体 分 子 上 的 抗 原 决 定 位 点 与 分 泌 抗 体 的 结 合 位 点 是 一致 的 。 2、 它 必 须 能 促 进 B细 胞 与 辅 助 T细 胞 间 的 信 息 交 换 。 这要 求 在 两 个 细 胞 间 有 物 理 连 接 。 即 有 一 个 位 点 被 II级 蛋 白及 T细 胞 受 体 所 识 别 。 3、 通 常 它 必 须 可 被 降 解 。 二 、 抗 原 来 源 开 始 一 个 免 疫 程 序 之 前 ， 对 制 备 抗 原 的 考 虑 主 要 于 抗 原所 需 的 剂 量 和 纯 度 。 这 应 基 于 预 计 产 生 抗 体 的 用 途 。 如 果仅 仅 需 要 识 别 相 应 抗 原 的 高 特 异 性 抗 体 ， 那 么 抗 原 必 须 要相 当 纯 ， 或 抗 原 制 备 物 用 于 制 备 单 克 隆 抗 体 。 1、 纯 抗 原 2、 从 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 纯 化 抗 原 。 3、 半 抗 原 ： 半 抗 原 若 被 偶 联 于 大 的 蛋 白 分 子 上 就 能 被用 于 诱 发 抗 体 。 半 抗 原 起 抗 原 决 定 簇 作 用 ， 与 B细 胞 表 面抗 体 结 合 ， 载 体 提 供 II级 T细 胞 受 体 结 合 位 点 。 总 之 ， 半抗 原 应 被 偶 联 于 可 溶 性 载 体 上 ， 如 BSA。 4、 合 成 多 肽 也 要 连 接 到 载 体 上 。 三 、 动 物 免 疫1、 动 物 选 择 Balb/c小 鼠 ， 68周 龄 ； 兔 子 生 后 约 12周 。 动 物 数 ： 小 鼠 46只 ； 兔 子 24只 。2、 佐 剂 免 疫 反 应 的 非 特 异 性 刺 激 物 叫 做 佐 剂 ， 诱 导 对 可 溶 性 抗 原的 抗 体 反 应 必 须 使 用 佐 剂 。 但 对 颗 粒 性 抗 原 或 全 细 胞 抗 原 则不 是 必 须 的 。 佐 剂 包 含 两 种 因 素 ： 一 是 佐 剂 是 储 备 性 物 质 以 防 止 抗 原 迅速 代 谢 ； 二 是 佐 剂 必 须 是 可 以 非 特 异 性 地 刺 激 免 疫 反 应 的 物质 。 实 验 时 一 般 是 将 水 溶 液 注 入 到 佐 剂 中 。3、 抗 原 剂 量 对 于 兔 ， 若 有 大 量 可 溶 的 纯 抗 原 可 用 ， 一 般 认 为 每 次 免 疫于 佐 剂 中 有 0.51.0mg剂 量 是 可 取 的 ； 对 于 小 鼠 来 讲 ， 剂 量则 降 10倍 ， 为 50100g。 4、 抗 原 的 形 式5、 注 射 途 径 ： 需 考 虑 三 个 问 题 。 1） 要 注 射 多 大 剂 量 ； 2） 与 免 疫 原 同 注 的 是 什 么 缓 冲 液 ， 还 有 其 它 什 么 成 分 ； 3） 免 疫 原 释 放 入 淋 巴 系 统 及 循 环 系 统 的 速 度 如 何 ？ 对 于 兔 ， 大 体 积 注 射 常 采 用 皮 下 多 点 注 射 。 对 于 鼠 ， 大 体 积 注 射 常 采 用 腹 腔 注 射 ， 若 需 缓 慢 释 放 则采 用 肌 注 或 皮 下 注 射 ， 若 需 立 即 释 放 宜 采 用 静 脉 注 射 。 对 于 鼠 来 说 ， 第 二 次 和 第 三 次 免 疫 应 间 隔 至 少 3周 。 对 于 兔 来 说 ， 每 36周 注 射 一 次 。 超 免 疫 化 动 物 血 清 主 要 含 IgG抗 体 。 其 实 质 部 分 为 特 异 性抗 体 。 抗 原 特 异 的 IgG水 平 可 达 1mg/ml， 这 几 乎 等 于 血 清 中总 IgG水 平 的 10%。 DNA合 成 氨 基 酸 、核 苷 酸 库 dGTP、dTTP 次 黄 嘌 呤 H 肌 苷 酸 胸 腺 嘧啶 核 苷 T脱 氧 核 苷 酸 次 黄 嘌 呤 磷 酸 核 糖转 移 酶 (HGPRT) 胸 腺 嘧 啶 核 苷激 酶 （ TK）氨 基蝶 呤 A 杂 种 细 胞 的 筛 选 ： 细 胞 融 合 带 有 一 定 的 随 机 性 ，除 不 同 亲 本 细 胞 间 的 融 合 外 ， 还 伴 有 各 亲 本 细 胞 的自 身 融 合 。 因 此 ， 在 紧 随 细 胞 融 合 之 后 ， 必 须 设 法把 含 有 两 亲 本 细 胞 染 色 体 的 杂 种 细 胞 分 离 或 筛 选 出来 。 最 简 便 的 办 法 无 疑 是 应 用 选 择 培 养 基 ， 使 亲 本细 胞 死 亡 ， 而 仅 让 杂 种 细 胞 存 活 下 来 。 为 此 ， 已 先后 利 用 亲 本 细 胞 的 药 物 抗 性 、 营 养 缺 陷 型 和 温 度 敏感 性 等 遗 传 标 记 ， 建 立 了 多 种 选 择 系 统 ， 并 已 成 功地 用 于 杂 种 细 胞 的 筛 选 。 由 抗 药 性 细 胞 组 成 的 杂 种 的 筛 选 ： Szybslski等 （ 1962） 在 研 究 抗 药 性 时 发 现 ， 抗 嘌呤 类 似 物 8-氮 鸟 嘌 呤 或 6-巯 基 鸟 嘌 呤 突 变 型 细 胞 缺 乏次 黄 嘌 呤 磷 酸 核 糖 转 移 酶 （ HGPRT） ， 而 抗 嘧 啶 类似 物 5-溴 脱 氧 尿 嘧 啶 突 变 型 细 胞 缺 乏 胸 腺 嘧 啶 核 苷激 酶 TK） ， 它 们 均 可 为 HAT培 养 基 所 杀 死 。 在 此基 础 上 ， Littlefield（ 1964） 进 一 步 应 用 HAT培 养 基来 筛 选 HGPRT 细 胞 与 TK 细 胞 的 余 种 细 胞 ， 获 得成 功 。 从 此 ， 根 据 抗 药 性 这 一 遗 传 标 记 设 计 选 择 系统 即 日 益 增 多 ， 而 发 展 成 为 迄 今 使 用 最 为 普 遍 的 一种 筛 选 方 法 。 其 代 表 性 的 选 择 系 统 有 下 列 几 种 。 HAT选 择 培 养 基 ： HAT培 养 基 是 指 在 细 胞 培 养 基 中 加 有 次 黄嘌 呤 （ H） 、 氨 基 喋 呤 （ A） 或 氮 丝 氨 酸 （ A） 和 胸 腺 嘧 啶 核苷 （ T） 的 培 养 基 。 细 胞 为 合 成 DNA所 需 要 的 嘌 呤 和 嘧 啶 ， 可由 两 条 途 径 获 得 。 一 条 为 主 要 途 径 ， 即 从 磷 酸 核 糖 焦 磷 酸（ PRPP） 和 谷 氨 酰 胺 合 成 肌 苷 酸 （ IMP） ， 进 而 转 变 为 脱 氧鸟 苷 三 磷 酸 （ dGTP） ， 及 从 脱 氧 尿 苷 酸 （ dUMP） 合 成 脱 氧胸 苷 酸 （ dTMP） ， 再 转 变 为 脱 氧 胸 苷 三 磷 酸 （ dTTP） 。 这一 合 成 途 径 ， 可 为 加 入 的 会 抑 制 为 嘌 呤 或 嘧 啶 合 成 提 供 甲 基 的二 氢 叶 酸 还 原 酶 的 叶 酸 类 似 物 A所 阻 断 。 此 时 ， 只 有 HGPRT+和 TK +细 胞 才 能 通 过 另 一 条 应 急 途 径 ， 利 用 外 加 的 核 苷 酸 的“ 前 体 ” H来 合 成 IMP和 利 用 T来 合 成 dTMP， 而 得 以 有 活 下来 。 相 反 ， HGPRT 和 TK 细 胞 则 将 因 无 法 利 用 H和 T来 合 成DNA而 死 亡 。 因 此 ， 在 HGPRT 和 TK 细 胞 融 合 后 ， 应 用HAT培 养 基 即 可 将 通 过 基 因 互 补 而 同 时 获 得 HGPRT和 TK酶 的杂 种 细 胞 筛 选 出 来 。