微生物的无菌操作及接种技术

o 微 生 物 无 菌 操 作 技 术o 接 种 技 术o 工 业 生 产 中 的 微 生 物 接 种微 生 物 无 菌 操 作 及 接 种 技 术 一 、 微 生 物 无 菌 操 作 技 术无 菌 操 作 技 术 ： 指 在 微 生 物 实 验 工 作 中 ， 控 制 或 防 止 各 类 微 生物 的 污 染 及 其 干 扰 的 一 系 列 操 作 方 法 和 有 关 措 施 。 1 接 种 针 2.接 种 环 3.接 种 钩 4.5.玻 璃 涂 棒 6.接 种 圈 7.接 种 锄 8.小 解 剖 刀一 、 微 生 物 无 菌 操 作 技 术 一 、 微 生 物 无 菌 操 作 技 术 二 、 原 理 ：o 无 菌 技 术 ： 指 在 微 生 物 实 验 工 作 中 ，控 制 或 防 止 各 类 微 生 物 的 污 染 及 其干 扰 的 一 系 列 操 作 方 法 和 有 关 措 施 。o 接 种 ： 将 微 生 物 接 到 适 于 它 生 长 繁殖 的 人 工 培 养 基 上 或 活 的 生 物 体 内的 过 程 。微 生 物 无 菌 操 作 技 术 与 接 种 技 术 o 接 种 的 准 备 工 作n 无 菌 环 境 的 要 求 与 保 持n 进 入 无 菌 室 前 的 准 备n 无 菌 操 作 的 要 求o 接 种 的 操 作 方 法二 、 微 生 物 接 种 技 术 无 菌 环 境 无 菌 室超 净 工 作 台无 菌 环 境 的 要 求 与 保 持（ 一 ） 接 种 的 准 备 工 作 （ 1） 无 菌 室 的 结 构 ：o 应 有 更 衣 间 、 缓 冲 间 、操 作 间o 应 有 良 好 的 通 风 条 件 ，安 装 空 调 设 备 及 过 滤 设备无 菌 环 境 的 要 求 与 保 持1、 无 菌 室 无 菌 室 的 结 构 （ 2） 无 菌 室 的 消 毒 和 防 污 染o 无 菌 室 内 空 气 测 试 应 基 本 达 到 无 菌 。o 每 日 （ 使 用 前 ） 紫 外 线 照 射 （ 12小 时 ） .o 每 周 用 甲 醛 、 乳 酸 、 过 氧 乙 酸 熏 蒸 （ 2小 时 ） .o 每 月 用 新 洁 尔 灭 擦 拭 地 面 和 墙 壁 一 次 的 方 式 进 行 消 毒 。o 定 期 作 实 验 室 沉 降 菌 计 数 ， 以 检 查 无 菌 室 微 生 物 生 长 繁 殖动 态 。无 菌 环 境 的 要 求 与 保 持 2、 超 净 工 作 台 超 净 工 作 台 是 为 实 验 室 工 作 提 供 无 菌 操 作 环 境 的 设 施 ， 以保 护 实 验 免 受 外 部 环 境 的 影 响 ， 同 时 为 外 部 环 境 提 供 某 些 程度 的 保 护 以 防 污 染 并 保 护 操 作 者 。 原 理 ： 超 净 工 作 台 的 洁 净 环 境 是 在 特 定 的 空 间 内 ， 洁 净 空气 (进 滤 空 气 )按 设 定 的 方 向 流 动 而 形 成 的 。 以 气 流 方 向 来 分 ，现 有 的 超 净 工 作 台 可 分 为 垂 直 式 ， 由 内 向 外 式 以 及 侧 向 式 。 无 菌 环 境 的 要 求 与 保 持 垂 直 流 超 净 工 作 台 水 平 流 超 净 工 作 台 垂 直 流 超 净 工 作 台 超 净 台 的 使 用 与 维 护o 风 速 保 持 在 0.32-0.48米 /秒o 使 用 前 打 开 紫 外 灯 照 射 4060mino 开 启 超 净 工 作 台 工 作 电 源 ， 关 闭 紫 外 灯 ， 并 用 75%的 酒 精 或 0.5%过 氧 乙酸 喷 洒 擦 拭 消 毒 工 作 台 面 。o 使 用 中 ， 有 机 玻 璃 罩 受 到 污 染 ， 严 禁 用 酒 精 棉 球 擦 拭 ， 请 用 含 水 棉 布 檫 拭 ；o 请 保 持 超 净 台 整 洁 、 干 燥 ， 不 要 堆 积 杂 物 ；o 使 用 完 毕 ， 关 闭 煤 气 开 关 或 酒 精 灯 ；o 使 用 完 毕 后 ， 用 消 毒 液 擦 拭 工 作 台 面 ， 关 闭 工 作 电 源 ， 重 新 开 启 紫 外 灯 照射 15min.o 定 期 做 无 菌 试 验 ， 以 测 定 净 化 台 是 否 符 合 无 菌 要 求 。无 菌 环 境 的 要 求 与 保 持 3、 无 菌 器 材 准 备o 灭 菌 器 材 ： 玻 璃 器 皿 、 培 养 基 、 无 菌 衣 等 . o 消 毒 器 材 ： 接 种 试 管 、 无 菌 室 内 的 凳 子 、 试 管 架 、 天 平 、工 作 台 等无 菌 环 境 的 要 求 与 保 持 （ 1） 定 期 检 查 无 菌 环 境 的 空 气 是 否 符 合 规 定 ；（ 2） 用 紫 外 线 灭 菌 处 理 3060min；（ 3） 检 查 无 菌 器 材 是 否 完 备 ；（ 4） 实 验 人 员 进 入 无 菌 室 前 先 用 肥 皂 洗 手 ， 然 后 用 75 酒精 棉 球 将 手 擦 干 净 。（ 5） 缓 冲 室 内 换 上 洗 净 并 经 紫 外 线 灯 照 射 过 的 工 作 衣 、 帽 、鞋 。进 入 无 菌 室 前 的 准 备 （ 1） 在 操 作 中 不 应 有 大 幅 度 或 快 速 的 动 作 ；（ 2） 使 用 玻 璃 器 皿 应 轻 取 轻 放 。（ 3） 在 火 焰 上 方 操 作 ；（ 4） 接 种 用 具 在 使 用 前 、 后 都 必 须 灼 烧 灭 菌 ；（ 5） 在 接 种 培 养 物 时 ， 协 作 应 轻 、 准 。（ 6） 不 能 用 嘴 直 接 吸 吹 吸 管 。（ 7） 带 有 菌 液 的 吸 管 、 玻 片 等 器 材 应 及 时 置 于 盛 有 5%来 苏 尔 溶 液 的消 毒 桶 内 消 毒 。 无 菌 操 作 要 求 无 菌 操 作 要 求 无 菌 操 作 要 求 n 接 种 的 基 本 程 序n 常 用 接 种 方 法o 斜 面 接 种o 划 线 接 种o 液 体 接 种o 穿 刺 接 种 （ 二 ） 接 种 的 操 作 方 法 1、 接 种 的 基 本 程 序灭 菌 接 种 环沾 取 标 本接 种灭 菌 接 种 环 杀 灭 接 种 环 沾 染 的 微 生 物 ， 以 免 污 染 标 本杀 灭 接 种 环 沾 染 的 微 生 物 ， 以 免 污 染 环 境操 作 需 在 无 菌 室 或 超 净 工 作 台 内 进 行无 菌 室 、 超 净 工 作 台 使 用 前 后 需 进 行消 毒 。实 验 使 用 的 物 品 使 用 前 后 需 严 格 灭 菌（ 二 ） 接 种 的 操 作 方 法 2、 常 用 的 接 种 方 法斜 面 接 种划 线 接 种液 体 接 种穿 刺 接 种 （ 二 ） 接 种 的 操 作 方 法 斜 面 接 种 ： 从 已 生 长 好 的 菌 种 斜 面 上 挑 取 少 量 菌 种 移 植 至 另 一 新 鲜斜 面 培 养 基 上 的 接 种 方 法 。 用 于 好 气 性 微 生 物 的 接 种 。2、 常 用 的 接 种 方 法 1) 标 记 ： 接 种 前 在 试 管 上 注 明 菌 名 、 接 种 日 期 、 接 种 人 姓 名2) 点 燃 酒 精 灯 。3) 接 种 ：（ 1） 手 持 试 管 将 菌 种 管 和 待 接 斜 面 管 用 大 姆 指 和 其 他 四 指 握在 左 手 中 ， 中 指 位 于 两 管 之 间 。 斜 面 向 上 ， 尽 量 放 平 。（ 2） 旋 松 管 塞（ 3） 接 种 环 灼 烧 灭 菌 斜 面 接 种 斜 面 接 种（ 4） 拔 管 塞 ： 用 右 手 的 无名 指 、 小 指 和 手 掌 边 先 后取 下 菌 种 管 和 待 接 试 管 的管 塞 ， 让 试 管 口 缓 缓 过 火灭 菌 (切 勿 烧 得 过 烫 ) 斜 面 接 种（ 5） 取 菌 : 接 种 环 冷 却 ， 轻沾 取 少 量 菌 体 或 胞 子 ，然 后 将 接 种 环 移 出 菌 种管 ， 注 意 不 要 使 接 种 环碰 到 管 壁 ， 取 出 后 带 菌接 种 环 不 可 通 过 火 焰 。 斜 面 接 种 （ 6） 接 种 : n 在 火 焰 旁 迅 速 将 沾 有 菌 种 的 接 种 环 伸 入 待 接 斜 面 管 。 从斜 面 培 养 基 底 部 向 上 作 “ Z”形 来 回 密 集 划 线 ， 勿 划 破 培养 基 。n 有 时 也 可 用 接 种 针 仅 在 斜 面 培 养 基 的 中 央 拉 一 条 直 线 作斜 面 接 种 ， 直 线 接 种 可 观 察 不 同 菌 种 的 生 长 特 点 。 斜 面 接 种 (7) 塞 管 塞 ： 取 出 接 种 环 ， 灼 烧 试 管 口 ， 并 在 火 焰 旁 将 管 塞旋 上 。 不 要 用 试 管 去 迎 棉 塞 ， 以 免 试 管 在 移 动 时 纳 入 不 洁空 气 。 (8) 将 接 种 环 灼 烧 灭 菌 。 放 下 接 种 环 ， 再 将 棉 花 塞 旋 紧 。 斜 面 接 种 示 意 图 由 斜 面 菌 接 种 到 液 体 培 养 基 （ 如 试 管 或 三 角 瓶 等 ） 中 的 方 法 。操 作 方 法 ： 与 斜 面 法 基 本 一 致 ， 只 是 在 将 接 种 环 送 入 液 体 培 养 基 时 使环 在 液 体 与 管 壁 接 触 的 地 方 轻 轻 磨 擦 ， 使 菌 体 分 散 ， 塞 上 棉塞 再 轻 轻 摇 匀 。 如 果 菌 种 是 培 养 在 液 体 培 养 基 中 时 ， 一 般 用 移 液 管 或 滴 管接 种2、 常 用 的 接 种 方 法 液 体 接 种 2、 常 用 的 接 种 方 法 划 线 接 种目 的 ： 使 混 合 的 细 菌 呈 单 个 分 散 生 长 ， 形 成 单 个 菌 落 ， 以 便 获 得纯 菌 、 活 菌 计 数 。方 法 ： 分 区 划 线 法 ： 适 用 于 含 菌 量 较 多 的 标 本 连 续 划 线 法 ： 适 用 于 含 菌 量 较 少 的 标 本 2、 常 用 的 接 种 方 法 划 线 接 种 分 区 划 线 法 第 一 区 划 线灭 菌 接 种 环第 二 区 划 线灭 菌 接 种 环第 三 区 划 线灭 菌 接 种 环2、 常 用 的 接 种 方 法 划 线 接 种 连 续 划 线 法2、 常 用 的 接 种 方 法 划 线 接 种 用 接 种 针 从 菌 种 斜 面 上 挑 取 少 量 菌 体 并 把 它 穿 刺 到 固 体 或 半 固 体 的深 层 培 养 基 中 的 接 种 方 法 。 用 于 厌 气 性 细 菌 培 养 、 检 查 细 菌 的 运 动 能 力 、 保 藏 菌 种 。 只 适 宜 于 细 菌 和 酵 母 的 接 种 培 养2、 常 用 的 接 种 方 法 穿 刺 接 种 穿 刺 接 种 方 法 ： 1) 标 记 2) 点 燃 酒 精 灯 3） 接 种 （ 1） 手 持 试 管 （ 2） 旋 松 棉 塞 （ 3） 接 种 针 灼 烧 灭 菌 ， 把 在 穿 刺 中 可 能 伸 入 试 管 的 其 他 部 位 也灼 烧 灭 菌 2、 常 用 的 接 种 方 法 穿 刺 接 种 （ 4） 拔 出 棉 塞（ 5） 取 菌 ： 用 冷 却 接 种 针 的 针 尖 沾 取 少 量 菌 种（ 6） 穿 刺 ： 将 接 种 针 自 培 养 基 中 心 平 稳 、 快 速 垂 直 刺 入 培 养基 ， 至 接 近 试 管 底 部 ， 然 后 沿 接 种 线 拔 出（ 7） 塞 上 棉 塞（ 8） 接 种 针 灼 烧 灭 菌2、 常 用 的 接 种 方 法 穿 刺 接 种 1、 什 么 是 无 菌 技 术 ？2、 如 何 做 好 无 菌 室 的 消 毒 和 防 污 染 工 作 ？3、 如 何 做 好 超 净 台 的 使 用 与 保 养 ？4、 无 菌 操 作 的 目 的 是 什 么 ？5、 进 入 无 菌 室 前 要 做 好 哪 些 准 备 工 作 ？6、 验 操 作 过 程 的 无 菌 操 作 要 求 包 括 哪 些 内 容 ？7、 接 种 时 ， 为 何 要 尽 量 使 试 管 平 放 ？8、 穿 刺 接 种 时 能 否 将 接 种 针 直 接 穿 透 培 养 基 ？ 问 题 和 讨 论 工 业 生 产 中 培 养 的 菌 种 接 入 种 子 罐 时 ， 一 般 先 制 成 菌 悬 液 。常 用 的 方 法 有 压 差 法 、 火 焰 封 口 法 等 。 1 、 火 焰 封 口 法 种 子 罐 的 接 种 口 周 围 设 有 沟 槽 ， 接 种 时 先 在 沟 槽 里 注 入 少量 酒 精 ， 然 后 用 火 焰 点 燃 酒 精 ， 使 接 种 口 被 包 围 在 一 堆 火焰 之 中 ， 接 着 将 菌 悬 液 倒 入 种 子 罐 中 即 可 。 工 业 生 产 中 的 微 生 物 接 种 2 、 压 差 法 先 用 棉 花 球 蘸 消 毒 剂 覆 盖 在 种 子 罐 接 种 口 的 橡 皮 塞 上 ， 消 毒5 10min ， 将 连 接 在 盛 有 菌 悬 液 的 容 器 上 的 接 种 针 头 迅 速插 入 接 种 口 的 橡 皮 小 孔 中 ， 然 后 平 衡 种 子 罐 与 盛 菌 悬 液 的 容器 之 间 的 压 力 ， 接 着 降 低 种 子 罐 的 压 力 ， 菌 悬 液 就 会 注 入 到种 子 罐 里 。 接 种 完 后 ， 再 用 消 毒 剂 拭 净 接 种 口 的 小 孔 。 工 业 生 产 中 的 微 生 物 接 种