重组体克隆的筛选和鉴定

第 七 章 重 组 体 克 隆 的 筛 选 和 鉴 定 p205 一 、 抗 药 性 标 记 及 其 插 入 失 活 选 择 法pBR322质 粒 上 有 两 个 抗 菌 素 抗 性 基 因 :Tetr和 Ampr。 Tetr上 有 插 入 位 点 BamH I; Ampr上 有 插 入 位 点 Pst I。第 一 节 载 体 表 型 选 择 法1. 原 理 ： （ 1） 四 环 素 ：（ 2） 氨 苄 青 霉 素 抗 性 基 因 ：2. pBR322抗 菌 素 标 记 选 择产 生 -内 酰 胺 酶 ， 使 氨 苄 青 霉 素 转 变 为青 霉 酮 酸 ， 使 碘 -青 霉 素 指 示 液 （ I2-KI-Aampicillin） （ 蓝 灰 色 ） 褪 色 。抑 制 细 菌 生 长 ， 但 不 杀 死 细 菌 。杀 死 生 长 的 细 菌 ， 但 不 杀 死 停 止 生 长 的 细 菌 。（ 3） 环 丝 氨 酸 ： 转 化 处理 受 体菌 Amp Amp TcBamH I在 Tc抗 性 基 因 上负 选 择 3. 选 择 过 程 ：如 果 在 Tetr上 插 入 外 源 DNA， 导 致 四环 素 抗 性 基 因 失 活 ， 可 用 四 环 素 加 环丝 氨 酸 培 养 液 选 择 重 组 克 隆 。Tetr失 活 的 菌 生 长 被 四 环 素 抑 制 ， 不 被 环丝 氨 酸 杀 死 ， 保 留 下 来 ；Tet r不 失 活 的 菌 抗 四 环 素 ， 能 分 裂 生 长 ，反 而 被 环 丝 氨 酸 杀 死 。（ 1） 四 环 素 抗 性 插 入 失 活 无 环 丝 氨 酸 培 养 基 （ 2） 氨 苄 青 霉 素 抗 性 插 入 失 活 选 择 过 程如 果 Ampr上 插 入 外 源 DNA， 导 致 氨 苄青 霉 素 抗 性 基 因 失 活 ， 可 用 碘 -青 霉 素指 示 液 选 择 。 二 、 -半 乳 糖 苷 酶 显 色 反 应 选 择 法-半 乳 糖 苷 酶乳 糖 半 乳 糖 葡 萄 糖Xgal 半 乳 糖 5-溴 -4-氯 靛 蓝+ 深 蓝 色1. 原 理 ：载 体 上 有 一 段 2. 选 择 过 程 Xgal分 解 成 兰 色 产 物 。 利 用 插 入 的 外 源 基 因 的 表 达 产 物 特 性 进 行 直接 选 择 。 （ 只 在 特 定 条 件 下 ） 。转 化 进 来 的 外 源 基 因 产 物 能 够 弥 补 受体 菌 株 的 突 变 型 缺 陷 。一 、 原 理 ：1.弥 补 缺 陷 his-his+受 体 菌 ：外 源 基 因 ： 在 不 含 组 氨 酸 的培 养 基 中 生 长 二 氢 叶 酸 还 原 酶 （ DHFR） 对 三 甲 氧 苄 二 氨嘧 啶 有 抗 性 。DHFR载 体 连 接 转 化 受体 菌 三 甲 氧 苄 二 氨 嘧啶 培 养 基 平 板含 DHFR的 克 隆 才 能 生 长例 ：使 被 转 化 的 受 体 菌 表 现 出 外 源 基 因 的 表 型 。2. 增 加 新 性 状 利 用 有 插 入 片 段 的 重 组 载 体 的 分 子 量 比野 生 型 载 体 分 子 量 大 。一 、 直 接 电 泳 检 测 法从 转 化 后 的 菌 体 克 隆中 分 离 质 粒 ， 电 泳 、比 较 其 分 子 量 。第 三 节 DNA电 泳 检 测 法 分 子 量Marker 载 体重组克隆 二 、 酶 切 电 泳 筛 选 法1. 原 理 ：根 据 已 知 的 外 源 DNA序 列 的 限 制 性 酶 切图 谱 ， 选 择 一 两 种 内 切 酶 切 割 质 粒 ， 电泳 后 比 较 电 泳 结 果 （ DNA带 数 和 长 度 ） 。或 用 合 适 的 内 切 酶 切 下 插 入 片 断 ， 再 用其 它 酶 切 这 个 片 断 ， 电 泳 后 比 较 结 果 是否 符 合 预 计 的 结 果 。 1. 原 理PCR能 在 模 板 序 列 上 扩 增 出 预 期 DNA片 断 。2. 过 程（ 1） 从 重 组 克 隆 中 提 取 质 粒 （ 或 DNA） 。（ 2） 用 外 源 DNA插 入 片 断 引 物 作 PCR。（ 3） 电 泳 PCR产 物 。（ 4） 检 查 是 否 有 PCR产 物 。（ 5） PCR产 物 的 长 度 是 否 与 外 源 基 因 一 致 。 1. 核 酸 杂 交第 四 节 核 酸 杂 交 检 测 法 一 、 原 理 ： 重 组 克 隆 与 探 针 杂 交 。3. 识 别 标 记 32P 或 125I 。（ 1） 放 射 性 同 位 素2. 检 测 用 的 探 针与 外 源 DNA插 入 片 断 互 补 的 序 列 。（ 2） 非 放 射 性 标 记 荧 光 素 二 、 核 酸 杂 交 检 测 方 法 P107用 DNA（ 或 RNA） 探 针 检 测 DNA样 品 。1. Southern blotting从 宿 主 细 胞 中 提 取 DNA（ 或 质 粒载 体 ） ， 再 用 探 针 杂 交 。只 有 带 有 插 入 片 断 的 重 组 载 体 才 能与 探 针 杂 交 ， 在 底 片 上 曝 光 显 示 。 Southern blot 筛 选结 果 特 点 ：对 应 的 菌 斑 或 噬 菌 斑 位 置 不 变 ，可 以 直 接 找 出 阳 性 菌 落 。 DNA-RNA杂 交 。1） 原 理 ：2） 选 择 过 程在 70%甲 酰 胺 中 ， 把 DNA双 链 变 性 ， 复性 的 时 候 ， DNA-RNA杂 交 分 子 比 DNA-DNA双 链 更 稳 定 。 电 镜 下 可 见 一 种 R-环形 结 构 。用 外 源 基 因 的 mRNA与 重 组 载 体 杂 交 。 缺 点 ： 需 要 电 镜 ！ 2. Northern blotting用 DNA（ 或 RNA）探 针 检 测 RNA样品 。主 要 检 测 插 入 片断 是 否 被 转 录 。从 宿 主 细 胞 中 提取 RNA， 再 用 探针 杂 交 。 利 用 抗 体 作 为 “ 探 针 ” 来 检 测 转 入 受 体菌 并 且 表 达 出 相 应 的 蛋 白 质 的 外 源 基 因 。第 五 节 免 疫 化 学 检 测 法 P206对 表 达 产 物 的 检 测 。 蛋 白 蛋 白 “ 杂 交 ”二 、 免 疫 沉 淀 检 测 法三 、 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 （ ELISA）四 、 免 疫 印 迹 （ western blotting） 法 四 、 免 疫 印 迹 （ western blotting） 法 P1091.原 理 ：在 蛋 白 质 凝 胶 电 泳 以 后 ， 用 转 膜 和 免 疫 的 方法 检 测 胶 上 的 蛋 白 质 泳 带 。（ 1） SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 是 蛋 白 质 的 变 性 剂 ， 使 煮 沸 变 性 的蛋 白 质 维 持 线 性 状 态 ， 并 与 蛋 白 质结 合 ， 使 蛋 白 质 带 上 负 电 荷 。 SDS:（ SDS-PAGE） ： 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ PAGE） ：（ Polyacrylamide gel electrophoresis）在 电 场 的 作 用 下 线 性蛋 白 质 链 在 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 介 质 中 向 正 极移 动 ， 移 动 的 速 率 主要 取 决 于 其 分 子 量 大小 （ 链 的 长 短 ） ， 从而 把 不 同 分 子 量 的 肽链 分 开 。 电 泳 buffer 电 泳 buffer 点 样 电 泳 方 向 蛋 白 质 电 泳 的 分 子量 标 准已 知 分 子 量 的 蛋 白 质混 合 液 ， 与 待 测 样 品一 起 电 泳 ， 为 样 品 蛋白 质 提 供 分 子 量 估 计 。商 品 化 供 应 Da道 尔 顿 (质 量 单 位 , 等 于一 氧 原 子 质 量 的 十 六 分之 一 。一 克 约 为 6 10 23道 尔 顿 Dalton SDS PAGE 凝 胶 中 的 蛋 白 质 染 色 ：考 马 斯 亮 蓝 ：灵 敏 度 底 、 只 能 检 出 0.3-1g/带 ， 但 可褪 色 回 收 。硝 酸 银 ：灵 敏 度 高 、 可 检 出 2-5ng/带 。2） 转 到 膜 上 进 行 染 色 。1） 直 接 染 色 直 接 染 色 电 泳 结 果 （ 2） Western blotting电 泳 胶 里 的 蛋 白 质 带 可 以 用 电 转 的 方 法 ，转 到 膜 上 （ 硝 酸 纤 维 素 膜 、 PVDF膜 、中 性 尼 龙 膜 等 ） 。 Western（ 转 膜 ）胶 里 的 蛋 白 质 带 在 电场 的 作 用 下 横 向 转 移到 正 极 一 侧 的 膜 上 。 膜胶蛋 白 Western装 置 Blotting原 理 与 ELISA相 同 。待 测 蛋 白硝 酸 纤维 素 膜 一 抗 二 抗辣 根 过 氧化 物 酶底 物 产 物PAGE胶 待 测 蛋 白 显 色辣 根 过 氧 化 物 酶 ： HRPO 1） 先 用 一 抗 （ 待 测 蛋 白 的 单 克 隆 抗 体 ） 与 膜 上 的 蛋 白 结 合 。2） 洗 去 未 结 合 的 一 抗 。3） 用 二 抗 与 一 抗 结 合 （ 二 抗 上 带 有 HRPO） 。4） 清 洗 掉 未 结 合 的 二 抗 。5） 用 HRPO的 底 物 浸 泡 膜 。6） 暗 室 里 曝 光 ， 冲 洗 胶 片 。 Blotting过 程 Immuno Blotting 结 果单 抗 blotting结 果 1 2 3 4 一 、 无 细 胞 翻 译 系 统第 六 节 转 译 筛 选 法 能 把 外 源 的 mRNA翻 译 成 蛋 白 质 的 细 胞 提取 物 。如 ： 麦 胚 提 取 物 系 统 、 网 织 红 细 胞 提 取 物系 统 。借 助 无 细 胞 翻 译 系 统 ， 通 过 表 达 或 抑 制 所 选择 的 克 隆 载 体 上 的 外 源 基 因 的 转 录 ， 来 筛 选其 产 物 是 否 符 合 预 期 。适 用 于 mRNA转 录 丰 度 高 的 外 源 基 因 。 mRNA无 细 胞 翻 译 系 统35S标 记 的甲 硫 氨 酸 翻 译 35S标 记 的 肽 链PAGE电 泳放 射 自 显 影比 较 放 射 性带 纹 的 位 置载 体 +外 源 DNA转 录与 预 期 的 产 物分 子 量 相 符 ？ mRNA一 旦 与 DNA杂 交 成 RNA-DNA双 链后 就 不 能 被 核 糖 体 翻 译 出 蛋 白 质 （ 转 译 被抑 制 ） 。单 链 mRNA核 糖 体小 亚 基核 糖 体大 亚 基 能 翻 译 mRNADNA核 糖 体小 亚 基 核 糖 体大 亚 基不 能 翻 译1. 原 理 1. 原 理 ：在 高 甲 酰 胺 溶 液 中 载 体 上 克 隆 的 cDNA与 它 的 mRNA杂 交 吸 附 ， 然 后 洗 脱 ， 释放 出 与 它 对 应 的 mRNA， 进 行 体 外 转 录 。研 究 其 转 录 产 物 的 性 质 是 否 是 预 期 的 基因 产 物 （ 如 分 子 量 、 免 疫 源 性 等 ） 。 2. 过 程硝 酸 纤维 素 滤 膜 载 体 和 插入 的 cDNA 总 mRNAcDNA基 因 的mRNA杂 交洗 脱 cDNA基 因 的mRNA 体 外 翻 译cDNA编码 的 蛋 白电 泳凝 胶 放 射 自 显 影cDNA编码 的 蛋 白硝 酸 纤维 素 滤 膜 载 体 和 插入 的 cDNA硝 酸 纤维 素 滤 膜 载 体 和 插入 的 cDNA 收 集 35S标 记 的 氨 基 酸 专 门 设 计 检 测 能 同 DNA特 异 结 合 的 蛋白 质 因 子 。待 测 蛋 白 质硝酸纤维素滤膜 能 与 蛋 白 质 结合 的 DNA序 列 放 射 性 标 记待 测 蛋 白 质硝酸纤维素滤膜 能 与 蛋 白 质 结合 的 DNA序 列 放 射 性 标 记五 、 DNA-蛋 白 质 相 互 作 用 筛 选 法 几 种 常 用 的真 核 细 胞 核 苷 酸 的 合 成 需 要 四 氢 叶 酸提 供 甲 基 。二 氢 叶 酸 四 氢 叶 酸二 氢 叶 酸 还 原 酶 （ dihydrofolate reductase， DHFR）一 、 哺 乳 动 物 基 因 转 移 的 选 择 标 记1. 胸 苷 激 酶 （ thymidine kinase, tk）（ 1） TK选 择 原 理 四 氢 叶 酸 的 必 要 性DHFR 氨 甲 喋 啉 （ Methotrexate） 的 抑 制 作 用氨 甲 喋 啉 （ 或 氨 基 喋 啉 ） 是 叶 酸 的 类 似物 。能 抑 制 二 氢 叶 酸 还 原 酶 ， 从 而 阻 断dATP、 dCTP和 dTTP的 合 成 ：dUMP dATPTTP dCTP氨 甲 喋 啉抑 制 抑 制 胸 苷 酸 激 酶 的 补 救 作 用TK+细 胞 能 产 生 胸 苷 酸 激 酶 ， 所 以 可 以 利用 培 养 基 中 的 胸 苷 （ T） 合 成 TTP， 存 活 。T tk 次 黄 嘌 呤 的 补 救 作 用细 胞 可 以 利 用 次 黄 嘌 呤 合 成 dATP和 dCTP。dUMP dATPTTP dCTP 次 黄 嘌 呤补 救氨 甲 喋 啉抑 制 抑 制 HAT培 养 基 ：Tk- 细 胞 株 。TK基 因 。 宿 主 细 胞 载 体 标 记（ 2） TK选 择 过 程含 次 黄 嘌 呤 、 氨 基 喋 啉 和 胸 苷 的 培 养 基 。(hypoxanthine， aminopterin， thiymidine）只 有 转 入 TK基 因 的 细 胞 才 能 生 存 。 20 真 核 细 胞 核 苷 酸 的 合 成 需 要 四 氢 叶 酸 提供 甲 基 。2. 二 氢 叶 酸 还 原 酶 基 因 （ DHFR）（ 1） 选 择 原 理 二 氢 叶 酸 还 原 酶 的 必 要 性dUMP dATPTTP dCTP四 氢 叶 酸 四 氢 叶 酸 DHFR+细 胞二 氢 叶 酸 四 氢 叶 酸二 氢 叶 酸 还 原 酶二 氢 叶 酸 还 原 酶 合 成 四 氢 叶 酸DHFR+细 胞 能 产 生 二 氢 叶 酸 还 原 酶 ， 所以 能 合 成 四 氢 叶 酸 。能 在 无 胸 腺 嘧 啶 和 次 黄 嘌 呤 的 培 养 基 中 生 存不 需 要 补 救 ！ DHFR- 细 胞DHFR- 细 胞 不 能 产 生 二 氢 叶 酸 还 原 酶 ， 所以 不 能 合 成 四 氢 叶 酸 。需 要 补 救 ！不 能 在 无 胸 腺 嘧 啶 和 次 黄 嘌 呤 的 培 养 基 中 生 存 。 胸 腺 嘧 啶 和 次 黄 嘌 呤 补 救dUMP dATPTTP dATP 次 黄 嘌 呤补 救胸 苷补 救无 四 氢 叶 酸 提 供 甲 基 ， dNTP合 成 受 阻 时 ，胸 腺 嘧 啶 和 次 黄 嘌 呤 分 别 补 救 : DHFR-细 胞 株 （ 不 能 在 无 核 苷 酸 的 培养 基 中 生 长 ） 。 宿 主 细 胞（ 2） 选 择 过 程透 析 除 去 血 清 中 的 内 源 性 核 苷 酸 ， 以免 补 救 。 无 核 苷 酸 的 培 养 基需 要 胸 腺 嘧 啶 和 次 黄 嘌 呤 补 救 ！ 氨 甲 喋 呤 “ 加 压 ” 添 加 少 量 氨 甲 喋 啉 抑 制 内 源 性 DHFR的补 救 作 用 ， 可 提 高 选 择 。DHFR+基 因 。 载 体 标 记只 有 转 入 DHFR+基 因 的 细 胞 才 能 生 存 。DHFR-DHFR -DHFR+ DHFR+ livedie无 核 苷 酸 的 培 养 基 是 细 菌 抗 生 素 ， 干 扰 细 菌 的 核 糖 体 ，使 细 菌 的 蛋 白 质 合 成 不 能 正 常 进 行 ，但 不 影 响 真 核 生 物 。3. 新 霉 素 抗 性 基 因 （ neor）（ 1） 选 择 原 理 新 霉 素 （ neomycin）新 霉 素 的 类 似 物 ， 是 一 种 氨 基 糖 苷 ，对 真 核 细 胞 和 原 核 细 胞 都 有 毒 性 。 G418（ geneticin） 新 霉 素 抗 性 基 因 -neor细 菌 的 新 霉 素 抗 性 基 因 （ neor） 编 码 一 种磷 酸 转 移 酶 （ APH） ， 能 使 G418失 活 。G418真 核 细 胞 死 亡G418 存 活neor 真 核 细 胞 含 致 死 剂 量 G418的 完 全 培 养 基 。 G418培 养 基真 核 细 胞 株 均 可 。neor基 因 。 宿 主 细 胞 载 体 标 记（ 2） 选 择 过 程G418： （ 100-800g/mL） CAT是 由 大 肠 杆 菌 转 座 子 Tn9编 码 的 ， 催 化 氯霉 素 发 生 乙 酰 化 失 活 。氯 霉 素 cat含 氯 霉 素 的 完 全 培 养 基 。真 核 细 胞 株 均 可 。cat基 因 。乙 酰 氯 霉 素4. 氯 霉 素 乙 酰 转 移 酶 （ CAT）（ 1） 选 择 原 理（ 2） 选 择 条 件（ 3） 宿 主 细 胞（ 4） 载 体 标 记chloramphenicol acetyl transferase 在 转 化 的 细 胞 提 取 物 中 测 定 是 否 有乙 酰 氯 霉 素 。（ 5） CAT分 析 方 法 免 疫 学 检 查 ：用 抗 CAT的 血 清 进 行 Western blot或ELISA， 检 查 CAT的 表 达 。Anti-CAT Antiserum is available from Invitrogen. Other kits to assay for CAT proteinusing ELISA assay are available from Roche Molecular Biochemicals and Molecular Probes. 分 析 乙 酰 氯 霉 素 二 、 植 物 转 化 体 报 道 基 因 筛 选 法（ 1） 大 肠 杆 菌 的 -D-葡 萄 糖 醛 酸 糖 苷 酶 （ -D-glucuronidase， GUS） ；（ 2） 细 菌 和 萤 火 虫 的 荧 光 素 酶 （ luciferase） ；（ 3） 水 母 绿 色 荧 光 蛋 白 （ GFP） 基 因 （ Green Fluorescent Protein） 。1. 报 道 基 因 （ reporter gene)（ 4） 其 它 2. 几 种 报 道 基 因 的 作 用 原 理4-甲 -D-葡 糖 醛 酸 荧 光 产 物GUSGFP 紫 外 光 照 发 绿 色 荧 光5-溴 -4-氯 -3-吲 哚 -D-葡 糖 醛 酸蓝 色 水 解 产 物GUS Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP 转 入 萤 火 虫的 luciferase的 烟 草 绿 色 荧 光 蛋 白