遗传的制作和基因定位

4.5 细 菌 的 遗 传 分 析 与 基 因 定 位4.5.1 细 菌 的 转 化 和 基 因 定 位转 化 ： 指 某 些 细 菌 能 通 过 其 细 胞 膜 摄 取 周 围 供 体 的 染 色体 片 段 ， 将 此 外 源 DNA片 段 通 过 重 组 加 入 自 己 染 色 体 组的 过 程 。1928年 ， 格 里 费 斯 (Griffith F.)在 肺 炎 双 球 菌 中 发 现转 化 现 象 。1944年 ， 阿 委 瑞 (Avery O. T.)成 功 地 进 行 了 肺 炎 双 球 菌转 化 试 验 ； 证 实 遗 传 物 质 是 DNA； 转 化 是 细 菌 交 换 基 因 的方 法 之 一 。 细 菌 中 的 大 部 分 的 转 化 工 作 是 用 下 面 三 种 细 菌 完 成的 ： 肺 炎 双 球 菌 ， 枯 草 杆 菌 和 流 感 嗜 血 杆 菌 。转 化 主 要 分 为 二 个 步 骤 进 行 :(一 )供 体 DNA与 受 体 细 胞 间 的 接 触 与 互 作 肺 炎 双 球 菌 转 化 ： DNA片 断 至 少 有 800个 碱 基 对 ；枯 草 杆 菌 的 转 化 ： DNA片 断 至 少 有 16000个 碱 基 对 。 转 化 的 第 一 步 是 使 转 化 DNA与 受 体 细 菌 间 的 成 功 地相 互 作 用 ， 这 包 括 ： 转 化 片 段 的 大 小 、 形 态 、 浓 度 和受 体 细 胞 的 生 理 状 态 。 .转 化 片 断 的 大 小 ： .供 体 DNA分 子 存 在 的 数 目 ：对 特 定 基 因 来 说 ， 供 体 DNA分 子 数 目 与 成 功 转 化 有 关 。链 霉 素 抗 性 基 因 转 化 ： 在 每 个 细 胞 含 有 10个 DNA分 子 之 前 ，抗 性 转 化 体 数 目 一 直 与 DNA分 子 存 在 数 目 成 正 比 。原 因 ： 在 细 菌 的 细 胞 壁 或 细 胞 膜 上 有 固 定 数 量 的 DNA接 受座 位 ， 故 一 般 细 菌 摄 取 的 DNA分 子 数 小 于 10个 。 受 体 的 生 理 状 态 ：受 体 细 胞 必 须 在 生 理 上 处 于 感 受 态 。 这 种 感 受 态 只 能 发 生 在 细 菌 生 长 周 期 的 某 一 时 间范 围 内 ， 在 感 受 态 内 ， 活 跃 合 成 的 蛋 白 质 的 细 菌 细 胞壁 多 少 发 生 改 变 而 易 于 接 受 转 化 DNA。 、 转 化 DNA的 摄 取 和 整 合 过 程 ：细 菌 中 的 转 化 ， 包 括 供 体 DNA的 结 合 与 穿 入 ， 联 会 和 整 合 。 当 细 菌 处 于 感 受 态 时 ， 外 源 双 链 DNA分 子 可 结 合 在受 体 细 胞 表 面 的 接 受 座 位 上 。 细 菌 在 摄 取 外 源 DNA时 ，由 DNA移 位 酶 降 解 其 中 一 条 链 ， 并 利 用 降 解 这 条 链 产 生的 能 量 ， 将 另 一 条 链 拉 进 细 胞 中 。 .结 合 与 穿 入 ： 供 体 单 链 DNA片 段 一 旦 进 入 细 胞 ， 按 各 个 不 同 的位 点 与 其 相 应 的 受 体 DNA片 段 联 会 。 .联 会 ：单 链 的 转 化 DNA通 过 与 受 体 DNA对 应 位 点 的 置 换 从 而 稳 定 地 参 入 到 受 体 DNA中 。 整 合 (重 组 )： (三 )转 化 和 基 因 重 组 作 图 例 如 ： 黎 德 伯 格 等 用 枯 草 杆 菌 进 行 转 化 和 重 组 试 验 DNA 片 段 进 入 受 体 细 胞 之 后 ， 可 与 受 体 染 色 体 发生 重 组 。 紧 密 连 锁 的 两 个 基 因 有 较 多 的 机 会 包 括 在 同一 个 DNA片 段 中 ， 并 同 时 整 合 到 受 体 染 色 体 中 。 Trp2 his2 tyr1 三 者 并 发 转 化 的 频 率 最 高 ， 故 这 3个 基 因 是 连 锁 的 ，其 中 his2和 tyr1连 锁 紧 密 ：单 交 换 时 ， 染 色 体 开 环 易 降 解 ， 故 不 存 在 单 交 换 类 型 ；只 有 双 交 换 和 偶 数 的 多 交 换 才 有 效 的 。 4.5.2 细 菌 的 接 合 和 基 因 定 位1.接 合 ： 是 指 原 核 生 物 的 遗 传 物 质 从 供 体 (donor)转 移 到 受 体 (receptor)内 的 过 程 。特 点 ： 需 通 过 细 胞 的 直 接 接 触 。 B菌 株 ： Met+ bio+ thr- leu-，需 加 苏 氨 酸 和 亮 氨 酸 。不 同 营 养 缺 陷 型 的 大 肠 杆 菌 ： A菌 株 ： Met- bio- thr+ leu+，需 加 甲 硫 氨 酸 和 生 物 素 。4.5.2.1 黎 德 伯 格 和 塔 特 姆 （ 1946年 ） ：A菌 株 和 B菌 株 营 养 缺 陷 型 ， 不 能 在 基 本 培 养 上 生 长 。A+B菌 株 混 合 培 养 ， 在 完 全 培 养 基 上 ， 几 小 时 后 离 心 ， 涂布 基 本 培 养 ,长 出 原 养 型 (Met+bio+ thr+ leu+)菌 落 。 这 种 原 养 型 细 胞 如 何 出 现 ？转 化 ？ 细 胞 间 直 接 接 触 而 发 生 遗 传 物 质 交 换 和 重 组 ?A、 B菌 株 分 别 培 养 在 基 本 培 养 基 上 一 边 加 压 和 吸 引使 培 养 液 充 分 混 合 结 果 任 何 一 臂 的 培 养 基 上 均 未 长 出原 养 型 细 菌 。 直 接 接 触 (接 合 )是原 养 型 细 胞 出 现 的 必 要条 件 。 大 分 子 可 通 过 ， 细 菌 不 能 通 过Hayes(1952)试 验 证 明 ：接 合 过 程 是 一 种 单 向 转 移 ，A菌 株 遗 传 物 质 B菌 株 ，从 供 体 “ donor” 到 受 体“ receptor” 。 F 因 子 ： 致 育 因 子 (性 因 子 )， 是 一 种 附 加 体 。携 带 F因 子 的 菌 株 称 为 供 体 菌 或 雄 性 ， 用 F 表 示 。未 携 带 F因 子 的 菌 株 为 受 体 菌 或 雌 性 ， 用 F 表 示 。5.4.2.2 细 菌 遗 传 物 质 的 转 移 是 单 向 的 F 因 子 的 组 成 ：染 色 体 外 遗 传 物 质 ，环 状 DNA； 40-60个 蛋 白 质 基 因 ；2-4个 /细 胞 (雄 性 内 )。 4.5.2.3 F 因 子 的 三 种 状 态 ：以 大 肠 杆 菌 为 例 ： 一 个 自 主 状 态 F因 子 ， 即 F ； 带 有 一 个 整 合 的 F因 子 的 细 胞 叫 高 频 重 组 细 胞 ， Hfr细 胞 。 没 有 F因 子 ， 即 F ； 自 主 状 态 时F 因 子 独 立 进 行 分 裂 。F F ： 先 形 成 接合 管 ， F因 子 的 DNA边转 移 边 复 制 ， F 细 胞 F 细 胞 。 F因 子 整 合 到 细 菌 染 色 体 上(F Hfr细 胞 )， 其 繁 殖与 细 菌 染 色 体 同 步 进 行 。此 时 ， 细 菌 基 因 的 重 组 频率 增 加 4倍 以 上 ， 因 此 染 色体 上 整 合 有 F因 子 的 菌 株 ，称 为 Hfr菌 株 。 、 Hfr细 胞 的 形 成 及 染 色 体 的 转 移 ： 细 菌 染 色 体 由 一 小 段 单链 的 F因 子 为 前 导 而 转 移到 F-受 体 边 进 入 边合 成 。 一 般 情 况 下 仅 小部 分 细 菌 染 色 体 能 够 转入 ， 接 合 中 断 受 体细 胞 仍 为 F ， F因 子 仍 留在 供 体 内 。 部 分 二 倍 体 中 发 生 交 换 :单 数 交 换 ： 打 开 环 状 染 色 体 ， 产生 一 个 线 性 染 色 体 ， 这 种 细 胞 是不 能 成 活 的 。偶 数 交 换 ： 产 生 可 遗 传 的 重 组体 和 片 段 。部 分 二 倍 体 ： 当 F 或 Hfr的 细 菌 染 色 体 进 入 F 后 ， 在一 个 短 时 期 内 ， F 细 胞 内 的 某 些 位 点 就 会 成 为 二 倍 体的 DNA。 4.5.2.5 中 断 杂 交 作 图n 一 、 中 断 杂 交 实 验 原 理 基 因 从 Hfr 细 胞 按 次 序 转 入 F-细 胞 ， 可 根 据 基 因 进 入 F-细胞 的 时 间 和 次 序 制 作 基 因 图 谱 。 Wollman和 Jacob于1954年 在 大 肠 杆 菌 中 曾 进 行 了 以 下 杂 交 实 验 ： Hfr： thr+leu+azsTislac+gal+strs F-:thr-leu-azrTirlac-gal-strr把 接 合 中 的 细 菌 在 不 同 时 间 取 样 ， 并 把 样 品 猛烈 搅 拌 以 中 断 接 合 中 的 细 菌 ， 然 后 分 析 受 体 菌 的基 因 型 ， 这 是 在 大 肠 杆 菌 等 细 菌 中 用 来 测 定 基 因位 置 的 一 种 方 法 。 n 二 、 中 断 杂 交 作 图中 断 杂 交 实 验 结 果基 因 转 入 时 间 （ min） 频 率 thr+ 8 100 leu+ 8.5 100 azs 9 90 Tis 11 70 lac + 18 40 gal+ 25 25不 同 基 因 在 F-中 出 现 的 时 间 和 达 到 的 稳 定 转 移频 率 不 同 ， 表 明 它 们 同 转 移 起 始 点 之 间 ， 以 及它 们 之 间 的 顺 序 和 距 离 不 同 。 0 5 10 15 20 25 min O az Ti lac gal E.coli中 断 杂 交 作 图 基 因 距 离 以 分 钟 为 单 位n 同 一 个 Hfr菌 株 的 转 移 的 起 始 点 在 以 及 转 移 顺序 在 不 同 实 验 中 都 是 相 同 的 。 但 一 个 F+品 系可 产 生 许 多 Hfr品 系 ， 这 是 因 为 F因 子 在 细 菌染 色 体 上 有 许 多 插 入 位 点 而 且 其 插 入 取 向 不同 而 形 成 的 。 用 这 些 不 同 Hfr菌 株 进 行 中 断 杂交 实 验 ， 则 它 们 的 转 移 起 点 、 基 因 转 移 顺 序以 及 转 移 方 向 都 不 相 同 。 4.5.2.6 细 菌 的 重 组 作 图n 如 果 2个 基 因 间 的 转 移 时 间 2min则 用 中 断 杂 交 作 图 不 可靠 ， 应 采 用 传 统 的 重 组 作 图 法 。 杂 交 Hfr lac+ade + F-lac- ade- lac +乳 糖 不 发 酵 ade-胸 嘌 呤 缺 陷 型 用 完 全 培 养 基 但 不 加 腺 嘌 呤 ， 可 选 出 F-ade+的 菌 落 由 于 lac+ ade-近 ， 两 者 相 继 进 入 时 间 相 距 很 短 ， 难 以 准确 界 定 ， 所 以 只 能 根 据 产 物 确 定 。 如 果 选 出 ade +同 时 也 选 出 lac+ ， 说 明 lac- ade 间 没 有 发生 过 交 换 ； 如 果 是 lac-ade+说 明 发 生 交 换 。 Hfr lac+ ade+ F- lac- ade- F- lac- ade- Hfr lac+ ade+ F- lac+ ade+ F- lac- ade- Hfr lac+ ade+ F- lac- ade+ F- lac- ade- A： 外 基 因 子 与 内 基 因 子 之 间 未 发 生 重 组 ； B： lac- ade 两 基 因 之 外发 生 双 交 换 ； C： lac- ade 两 基 因 间 发 生 交 换 产 生 重 组 子 。 重 组 率 =lac -ade+/(lac+ ade+)+(lac- ade+) 100% =22% n 两 个 位 点 之 间 的 时 间 单 位 约 为 1min， 可 见 1个 时 间 单 位 （ 分 钟 ） 大约 相 当 于 20%的 重 组 值 。 n 用 重 组 率 与 中 断 杂 交 法 测 的 基 因 距 离 大 致 符 合 的 ， 根 据 接 合 的 实 验 ，用 中 断 杂 交 法 基 因 重 组 等 方 法 已 绘 制 出 大 肠 杆 菌 K12环 状 遗 传 图 （ 图4-42） 。 A:B:C: 4.5.3 细 菌 的 转 导 和 作 画n 1. 定 义 ： 以 噬 菌 体 为 媒 介 所 进 行 的 细 菌 遗 传 物质 重 组 的 过 程 ， 称 转 导 。 n 2. 发 现 Lederbery及 其 研 究 生 Zinder（ 1951） 首先 在 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 （ Salmenella typhimurium） 中 发 现 转 导 现 象 。 发 现 过 程 他 们 用 苯 丙 氨 酸 、 色 氨 酸 、 酪 氨 酸 营 养 缺 陷型 的 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 和 甲 硫 氨 酸 、 组 氨 酸 营 养缺 陷 型 的 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 共 同 培 养 ， 相 当 让 两种 不 同 缺 陷 型 的 菌 杂 交 。 杂 交 过 程 和 结 果 如 下 ： LT22 phe- try- tyr- LT2 met- his- （ 苯 丙 氨 酸 、 色 氨 酸 、 酪 氨 酸 ） （ 甲 硫 氨 酸 、 组 氨 酸 ） 营 养 缺 陷 型 营 养 缺 陷 型 原 养 型 的 菌 落 （ 即 出 现 个 别 正常 型 的 细 菌 ） n 那 么 这 些 原 养 型 菌 落 的 出 现 是 由 接 合 引 起 的 ？ 还 是 由 转 化 引 起 的 ？ 他 们 先 进 行 U形 管 实 验（ P159） ， 结 果 在 LT22一 臂 获 得 原 养 型 的 菌 株 ，由 此 推 测 可 能 有 一 种 可 通 过 滤 膜 的 过 滤 性 因 子（ FA） 在 起 作 用 。 进 一 步 利 用 DNA酶 处 理 ， 结 果FA不 受 DNA酶 影 响 ， 从 而 消 除 了 转 化 作 用 的 可 能性 。 最 后 认 为 FA是 一 种 噬 菌 体 ， 发 现 了 转 导 。 n3. 转 导 的 机 制 转 导 是 在 噬 菌 体 包 装 中 因 为 错 误 将 细 菌 染 色体 片 段 包 装 进 去 成 为 内 含 细 菌 染 色 体 片 段 “ 假噬 菌 体 ” 而 发 生 的 。 具 体 过 程 如 下 ： （ 1） 噬 菌 体 侵 染 细 菌 。 （ 2） 噬 菌 体 DNA使 细 菌 染 色 体 形 成 片 段 ， 合成 噬 菌 体 DNA和 外 壳 。 （ 3） 新 噬 菌 体 包 装 ， 偶 尔 将 细 菌 染 色 体 片 段也 包 装 进 去 成 为 内 含 细 菌 染 色 体 片 段 “ 假 噬 菌体 ” 。 “ 假 噬 菌 体 ” 和 真 噬 菌 体 一 起 释 放 出 来 。 （ 4） “ 假 噬 菌 体 ” 和 真 噬 菌 体 一 样 可 再 侵 染细 菌 ， 其 中 “ 假 噬 菌 体 ” 侵 染 时 ， 就 将 外来 的 细 菌 基 因 注 入 ， 经 过 基 因 重 组 改 变 遗传 性 状 ， 完 成 转 导 的 过 程 。 目 前 根 据 转 导 的 机 制 ， 已 广 泛 应 用 在 体外 包 装 “ 假 噬 菌 体 ” ， 即 将 外 源 基 因 导 入“ 假 噬 菌 体 ” 中 ， 再 侵 染 细 菌 ， 进 行 基 因表 达 的 研 究 。 n1.普 遍 性 转 导 普 遍 性 转 导 ： 指 P1、 P22等 可 以 转 导 沙门 氏 菌 染 色 体 组 的 任 何 不 同 的 部 分 。 如 果 两 个 基 因 始 终 是 一 起 转 导 或 同 时 转导 （ 共 转 导 或 并 发 转 导 ） 频 率 较 高 ， 那么 证 明 两 基 因 连 锁 ， 而 且 频 率 越 高 ， 则两 基 因 距 离 越 近 。n 如 ： a基 因 和 b基 因 共 转 导 频 率 高 ， a和 c共 转 导 频 率 也 高 ， b和 c共 转 导 频 率 低 ，则 3个 基 因 顺 序 为 b a c n 若 同 时 观 察 3因 子 转 导 分 析 ， 则 只 做 一 次 实 验 就可 推 出 其 次 序 。 举 例 ： 利 用 普 遍 性 转 导 测 知 leu， thr， azi三 个 基因 顺 序 。 方 法 ： （ 1） 用 噬 菌 体 P1侵 染 带 leu+， thr+和 azi+的 大肠 杆 菌 。 （ 2） 用 从 该 大 肠 杆 菌 释 放 出 来 的 噬 菌 体 ， 再 侵染 leu -、 thr-和 azi-的 大 肠 杆 菌 。 (3)把 受 体 菌 接 种 到 不 含 thr的 选 择 培 养 基 上对 thr+进 行 选 择 ， 凡 具 thr+的 细 菌 都 可 生 长 ，把 此 菌 接 种 到 其 他 培 养 基 上 ， 结 果 在 选 出的 thr+重 组 子 只 有 3% leu+， 但 无 一 个 同 时也 是 azi+ 。 若 选 择 leu+重 组 子 ， 则 约 有 50%同 时 也 是 azi+， 因 此 3基 因 次 序 应 为 thr+ leu+ azi+。 P165 2.特 异 性 （ 局 限 性 ） 转 导 概 念 ： 只 能 转 移 细 菌 染 色 体 特 定 部 分 基 因 的 转 导 . 2 局 限 性 转 导 的 过 程 3 转 导 的 机 制 :是 因 为 噬 菌 体 在 细 菌 染 色 体 的 特 定 位 点 上 整 合 。 4 低 频 转 导 与 高 频 转 导 噬 菌 体 感 染供 体 菌 裂 解 液 (转 导 噬 菌 体 ) 非 溶 源 (溶 源 菌 ) (10-6) 性 细 菌 溶 源 性 转 导 子重 组 性 转 导 子低 频 转 导 ： 指 溶 源 性 细 菌 经 诱 导 所 释 放 的 噬 菌 体 所 进 行 的 转 导 . 4.6 噬 菌 体 的 重 组 作 图n 4.6.1 噬 菌 体 的 结 构 和 形 态 表 8-6 几 种 病 毒 染 色 体 的 特 点病 毒 宿 主 核 酸 结 构 染 色 体 类 型 T-偶 数 噬 菌 体 E.coli 双 链 DNA 线 状 ； 环 状 排 列 末 端 有 RST7 E.coli 双 链 DNA 线 状 ； 单 一 顺 序 E.coli 双 链 DNA 线 状 ； 单 股 粘 性 末 端P22 沙 门 氏 菌 双 链 DNA 线 状 ； 单 一 顺 序 174 E.coli 单 链 DNA 环 状Q E.coli 单 链 RNA 线 状 （ 呼 肠 病 毒 ） 哺 乳 动 物 双 链 RNA 几 个 片 段SV40 人 类 双 链 DNA 超 螺 旋 环 鼠 白 血 病 病 毒 鼠 单 链 RNA 几 个 片 段烟 草 花 叶 病 毒 烟 草 单 链 RNA 线 状 二 噬 菌 体n 1951年 Esther Lederberg 发 现 K12中 有 原噬 菌 体 ， 并 命 名 为 。 n 附 加 体 (episome)n 合 子 诱 导 （ zygotic induction） Hfr（ ） F 无 重 组 子Hfr F （ ） 有 重 组 子 4.6.2 噬 菌 体 的 重 组 作 画n 菌 苔 （ lawn）n 噬 菌 斑 （ plaque） 表 8-7 hr+ h+r混 合 感 染 E.coliB和 B2的 结 果 表 型 推 导 的 基 因 型透 明 小 hr+ 半 透 明 大 h+r半 透 明 小 h+r+ 透 明 大 hr h r h r重组值 总噬菌斑数 100 四 、 T2的 环 形 遗 传 图 表 8-8 T2 hr T2 h r 杂 交 的 重 组 率各 种 基 因 型 的 百 分 比 （ %） 重 组 率 （ %）杂 交 h r hr h r hrhr+ h+r 1 12 42 34 12 24hr+ h+r 7 5.9 56 32 6.4 13hr+ h+r 13 0.74 59 39 0.94 1.7 24 r 1 h 13 a) r 7 h 1.7 r13 h r1 r7 r13 h r1 r13 h r7 b) r1 r7 h r13 r1 h r13 r7 图 8-24 r-h 的 图 距 和 r1,r7,r13 的 不 同 排 列 噬 菌 体 的 DNA环 状 排 列 与 末 端 重 复n 一 、 线 性 DNA具 有 环 状 遗 传 图 末 端 重 复 也 称 末 端 冗 余 ： 是 指 T4或 T2双 链DNA分 子 两 端 带 有 相 同 的 碱 基 序 列 。 环 状 排 列 又 称 致 环 交 换 。 1） 感 染 初 期 2） 感 染 后 期环 状 排 列 与 末 端 重 复 的 形 成