总结淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术

总结淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细 胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可 无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不 仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、 治提供了新的工具。制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗 体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过 几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐 一介绍其实验方法。一、细胞融合前准备（一）免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫， 免疫方案应根据抗原的特性不同而定。1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下 面以细胞性抗原为例的免疫方案：初次免疫lX107/0.5ml ip （腹腔内注射）I 23周后第二次免疫 1X107 /0.5ml ipI 3周后加强免疫（融合前三天）1X107/0.5ml ip或iv（静脉内注射）取脾融合可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐 剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油 包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油 包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆 菌充分混匀。初次免疫Ag 150p g加福氏完全佐剂皮下多点注射I （一般 0.81ml 0.2ml/ 点）I3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ipI （ip剂量不宜超过0.5ml）I3周后第三次免疫 剂量同上，不加佐剂，ipI （57天后采血测其效价，检测免疫效果）I23周后加强免疫，剂量50500p g为宜，ip或ivI3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有 所更新，如将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免 疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基 础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的 免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。（二）饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂 交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要 的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细 胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后 作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用 随复苏。小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb / c小鼠610周龄I拉颈处死 浸泡于75%酒精，消毒35分钟用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜I用无菌注射器注入68ml培养液I反复冲洗，吸出冲洗液放入10ml离心管，1200转/分离心56分钟I用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1 X10 5 / ml加入96孔板，100p l /孔I放入37C CO2孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得58X106腹 腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5X10 6/ml，小鼠脾细胞为1 X106/ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1X105 /ml，均为 100p l/孔。(三) 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高, 也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640, DMEM培 养基。小牛血清的浓度一般在1020%，细胞的最大密度不得超10 6/ ml， 一般扩大培养以1 ： 10稀释传代，每35天传代一次。细 胞的倍增时间为1620小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻 微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细 胞对HAT的敏感性，每36月应用8AG(8氮杂鸟嘌吟)筛选一次， 以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于 95%，也是决定细胞融合的关键。(四) 免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细 胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由 于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液 洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计 数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2X 10 8左右。二、细胞融合，选择杂交瘤(一)细胞融合流程(1) 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2 / 0,1000rpm离心5分钟，弃上清， 用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液 洗涤2次。(2) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。(3) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1 ： 10或1 ： 5的比例混合在一起，在 50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。(4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。(5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。(6) 在室温下融合： 30秒内加入预热的lml45%PEG(Merek,分子量4000)含5%DMS0, 边加边搅拌。 作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。 加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1m l, 2ml, 3ml, 4ml, 5ml 和 10ml。(7) 离心，800rpm, 6 分钟。(8) 弃上清，先用6ml左右20%小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记 不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。(9) 根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml 块96 孔板。(10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100p l/孔， 37C、5%C02孵箱培养。一般一块96孔板含有1X107脾细胞。(二) HAT选择杂交瘤应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲 座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品 化试剂50X贮存，用时1ml加入50ml20%小牛血清完全培养液中。因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200p l/孔。 所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补 加的量可用全量的2 / 3进行选择，可得到满意的筛选结果。50XHATH: 5X10-3MA: 2X10-5MT: 8X10-4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再 维持培养两周，改用一般培养液。三、抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能 分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面 积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同 的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有：1. ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。2. RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。3. FACS（荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表面抗原的McAb检测。4. IFA用于细胞和病毒McAb的检测。上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验 过程。可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整 个筛选时机。四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选 后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可 能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细 胞；所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。 要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检 测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被 抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分 泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即 使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的 突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。（一）克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。1. 有限稀释法的程序 制备饲养细胞悬液（同融合前准备） 阳性孔细胞的计数，并调细胞数在15X103/ml 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ ml，100p 1/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬 液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100p l /孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2. 2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100p l /孔，加G、 H两排，为每孔0.5个细胞。 培养45天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全 培养液200p l/孔。 第89天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。2. 软琼脂法 软琼脂的配制含20%FCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI16401 %琼脂水溶液：高压灭菌，42C预热。0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩 的RPMI1640配制而成。置42C保温。 用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平 皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。 按100 / ml, 500 / ml或5000 / ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。 1ml 0.5%琼脂液（42C预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细 胞悬液相混合。 混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固， 孵育于37C，5%CO2孵箱中。 45天后即可见针尖大小白色克隆，710天后，直接移种至含 饲养细胞的24孔板中进行培养。 检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。（二）杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是 十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细 胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细 胞应在每支安瓿含1 X106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养 环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可 以冻一支安瓿。细胞冻存液：50%小牛血清40%不完全培养液10% DMSO（二甲亚砜）冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降 到0C,再降温时一般按每分钟降温23C,待降至-70C可放入液 氮中。或细胞管降至0C后放-70C超低温冰箱，次日转入液氮中。 也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的 活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。五、单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：1. 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆 抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为1060“g/ml，如果大 量生产，费用较高。2. 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。 实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按13X107/ml接种于小 鼠背部皮下，每处注射0.2 ml,共24点。待肿瘤达到一定大小后 （一般1020天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1- 10mg / ml。但采血量有限。 腹水的制备常规是先腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或液体石 腊于BaLb/c鼠，12周后腹腔注射1X106个杂交瘤细胞，接种细 胞710天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待 腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入 试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。也可用注射器抽取腹水， 可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml，这是目 前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔 则产生腹水快、量多。六、单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方 面的鉴定：1. 抗体特异性的鉴定：除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应用 与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA 法。例如制备抗黑色素瘤细胞的McAb,除用黑色素瘤细胞反应外， 还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤 特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。制备抗重组的细胞因子的 单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是 与其它细胞因子间有无交叉。2. McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二 抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶 标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，贝U检测出来的抗体一般是IgG 类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时,如加入适量的PEG(3%), 将有利于沉淀线的形成。3. McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb 的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体 和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否 得到抗体的保护。4. McAb识别抗原表位的鉴定:用竞争结合试验、测相加指数的方法， 测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。5. McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb 与相应抗原结合的亲和力。七、影响因素、失败原因分析由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多， 稍不注意就会造成失败。其主要失败原因和影响因素有：1. 污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣 手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整 个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、 实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室， 要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查 出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物 学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB/c小鼠的腹腔，待 长出腹水或实体瘤时，犖八菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原 体污染。2. 融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考 虑下列因素PEG有毒性或作用时间过长。牛血清的质量太差，用 前没有进行严格的筛选。骨髓瘤细胞污染了支原体。HAT有问题， 主要是A含量过高或HT含量不足。3. 杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体 融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。 对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染， 或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。 也可能发生染色体丢失。Goding91982）曾提出“三要” “三不要”， 可能是防止抗体停止分泌的有效措施。三要：要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。要定期进行再克隆。三不要：不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好 几代。4. 杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞 有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在 培养液加HT。