双重回生处理锥栗淀粉的理化特性及体外抗氧化-毕设论文

毕 业 论 文题 目： 双重回生处理锥栗淀粉的理化特性及体外抗氧化 学 院： 化学化工学院 专 业： 生物工程 班级： 0901 学号： 200906030128 学生姓名： 周子愉 导师姓名： 谢 涛 完成日期： 2013年6月10日 毕业设计（论文）任务书 题目： 双重回生处理锥栗淀粉的理化特性及体外抗氧化 姓名： 周子愉 学院： 化学化工学院 专业： 生物工程 班级： 0901班 学号：200906030128指导老师 谢 涛 职称 教 授 教研室主任 谢 涛 一、基本任务及要求： 基本任务： 1、采用双重回生的方法处理锥栗淀粉； 2、测定双重回生处理锥栗淀粉的溶解度和膨胀因数、平均聚合度、直链淀粉含量及沥滤率等理化性质； 3、测定双重回生处理锥栗淀粉的体外消化性分析其组分含量； 4、测定双重回生处理锥栗淀粉的体外抗氧化性能或自由基清除过程（包括总抗氧化性的测定、DPPH自由基清除能力、ABTS+清除能力测定、清除超氧离子自由基、脂质过氧化抑制作用的测定、亚硝酸盐清除率） 要求： 在写好开题报告的前提下，按照设计计划进行实验，对实验中遇到的困难和问题，在参考资料和书籍的情况下，仔细分析并且找到解决之道。在确定实验方案不能取得理想结果的情况下，积极调整实验方案，确定最佳试验条件。在开始实验设计之后，每天要首先作好当天的内容安排，按计划行事，认真作好相关的实验原始数据记录，仔细观察实验现象，总结每天的进展情况，在计划期内圆满地完成整个毕业课程实验。最后要按毕业设计的要求总结实验成果，撰写毕业论文，完成毕业论文答辩。 二、毕业论文的进度安排及完成时间： 2013年2月25日到3月24日，查阅文献资料，撰写文献综述和开题报告 2013年3月25日到3月31日，上交开题报告（含文献综述） 2013年3月25日到6月9日，进行毕业论文实验 2013年6月3日到6月9日，撰写毕业论文，补充实验，归还仪器，离开实验室 2013年 6月10日到6月12日，上交毕业论文等相关资料，修改毕业论文，准备答辩 2013年6月13日到6月16日，毕业答辩，修改毕业论文，评定成绩，提交成绩单 诚 信 声 明本人声明：1、本人所呈交的毕业设计（论文）是在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果；2、据查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，毕业设计（论文）中不包含其他人已经公开发表过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位而使用过的材料；3、我承诺，本人提交的毕业设计（论文）中的所有内容均真实、可信。作者签名： 日期： 年 月 日目 次摘要IAbstractII1 前言11.1 本课题研究意义及国内外研究现状分析11.2 本课题的主要目的及需解决的问题21.2.1本课题研究的目的21.2.2本课题研究的主要任务22 材料与方法22.1 原料制备22.2 实验试剂和仪器32.3 实验方法32.3.1 双重回生处理锥栗淀粉32.3.2 直链淀粉含量的测定32.3.3 沥滤率的测定42.3.4 平均聚合度的测定42.3.5 溶解度和膨胀因数的测定42.3.6 RDS、SDS与RS含量的测定52.3.7 体外抗氧化性53 结果与讨论73.1 双重回生处理锥栗淀粉中表观直链淀粉含量73.2 双重回生处理锥栗淀粉的沥滤率83.3 双重回生处理锥栗淀粉的平均聚合度93.4 双重回生处理锥栗淀粉的溶解度和膨胀因数93.5 双重回生处理锥栗淀粉中RDS、SDS、RS含量103.6 双重回生处理锥栗淀粉体外抗氧化性113.6.1 总抗氧化活性113.6.2 DPPH自由基清除能力123.6.3 ABTS自由基清除能力133.6.4 超氧阴离子自由基清除能力143.6.5 脂质过氧化的抑制作用143.6.6 亚硝酸盐的清除能力154 结论16参考文献17致 谢20化学化工学院2013届本科毕业论文 双重回生处理锥栗淀粉的理化及其体外抗氧化摘要：以自制锥栗淀粉为原料,采用双重回生处理锥栗淀粉得到了9个变性样品，测定了它们的理化特性和样品中快速消化淀粉（RDS）、缓慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）含量；并从中挑选三个代表性样品，研究其体外抗氧化性。实验结果表明： 与锥栗原淀粉相比，双重回生处理锥栗淀粉样品中直链淀粉含量有比较显著的增加；对它们的平均聚合度、溶解度和膨胀因数有显著增加。两次回生时间对锥栗淀粉表观直链淀粉含量、沥滤率和膨胀因数的影响都不显著；对它们的平均聚合度有比较显著的增加，溶解度有比较显著减少。 测定双重回生处理锥栗淀粉样品中快速消化淀粉（RDS）、缓慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）的含量，发现双重回生处理能够提高缓慢消化淀粉(SDS)含量。 测定了总抗氧化能力、对脂质过氧化的抑制作用、清除DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子、亚硝酸盐的能力这6种方法来评价双重回生处理锥栗淀粉样品中三个典型样品的体外抗氧化性，发现在2-10 mg/ml的浓度范围内，其体外抗氧化能力随浓度的升高而增大。关键词：双重回生处理；锥栗淀粉；理化性质；体外抗氧化性化学化工学院2013届本科毕业论文 Physicochemical and antioxidative properties of Castanea henryi starches treated by dual-retrogradation Abstract: With self-made Castanea henryi starch as material, nine modified samples were made by dual-retrogradation treatment, their physicochemical properties, and contents of ready digestible starch(RDS), slowly digestible starch(SDS) and resistant starch(RS) were determinated. The in vitro antioxidant activities of three typical samples selected from them were studied. The results showed that: Compared with native starch, the amylose content of dual-retrogradation of all samples have more significant increase; The average polymerization, solubility and swelling factor of all samples have greatly increase. Impacts of two retrogradation time on amylose content, amylose leaching and swelling factor were not significant, while their average polymerization have more significant increase, the solubility have more significant decrease. The contents of ready digestible starch(RDS), slowly digestible starch(SDS), resistant starch(RS) of all samples were measured. It was found the slowly digestible starch(SDS) contents of all samples can be improve by dual-retrogradation treatment. By determination of total antioxidant activity, inhibition of lipid perxidation, scavenging ability of DPPH free radical, ABTS free radical, superoxide anion and nitrite. The in vitro antioxidant of three typical samples can be evaluated. It was found that in 2-10mg/ml concentration range, the in vitro antioxidant activities increase with their increase of concentration.Keywords: dual-retrogradation; Castanea henryi starch; physicochemical properties; the in vitro antioxidant capacity.I化学化工学院2013届本科毕业论文 1 前言1.1 本课题研究意义及国内外研究现状分析淀粉是食品中最重要的产生葡萄糖的组分之一，因为它是由传统的主食材料提供的，如谷物、块根和块茎，以及各种由这些原料制成的产品。与生糖指数的分类相似，淀粉已经根据Englyst1-2 体外消化法分为快速消化淀粉(RDS)，慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)。缓慢消化淀粉（SDS）是指那些能在小肠中被完全消化吸收但速度较慢的淀粉(20120 min)，可持续缓慢地释放能量。淀粉的消化与人体的许多疾病密切相关，对于糖尿病和心血管疾病患者而言，食用低血糖指数的食物对其疾病具有一定的疗效，而人体对食物的血糖反应很大程度取决于食物的消化速度，抗性淀粉和缓慢消化淀粉含量高的食物血糖指数低。因为缓慢消化淀粉具有被酶完全缓慢水解的特性，对人体健康非常有益，越来越受到人们的关注。临床证明，这类改性淀粉可以有效改善糖负荷，将成为一类新型的功能性食品。这种产品不单针对糖尿病3 、心血管疾病4 、肥胖症5 的患者，对于作为运动员，尤其是马拉松等长跑运动员的碳水化合物补充剂，因为缓慢消化淀粉能使运动员在运动过程中有一个稳定持久的能量释放来源。当代社会，糖代谢不正常人群所占比例越来越高，因此，开发低血糖指数的食品将有利于高胰岛素人群、糖过敏患者和糖尿病人等使用。随着生活水平的提高，人们对食品的健康和营养问题越来越重视和关注，越来越多种类的功能性食品是21世纪食品工业的发展的大方向。淀粉作为仅次于纤维素的可再生资源，具有价廉易得、可降解和良好的生物相容性等功能特性，是食品工业的主要原料，于是对淀粉的研究便成为了一大热点。到目前为止，国外关于SDS颗粒的显微结构、理化特性及富SDS制备方法6-8 等方面的研究较多，Hamaker、Shi9-10 等申请的专利中提及可将SDS应用添加到不同淀粉食品中，如将SDS应用到烘焙食品、快餐、乳制品等领域，而国内相关的研究还较少，对SDS的认识还不够清楚全面，各方面方法技术还不成熟，且基本尚未投入工业化生产。对SDS的将来的研究需要把中心集中在新颖的SDS制造技术、发展评价不同SDS原料品质的体内方法，并深入理解SDS的生理作用。同时，也需要研究SDS和不同膳食纤维之间的生理联系及他们对结肠的影响来全面描绘出碳水化合物的营养作用，更好地控制食物中葡萄糖的释放和传递。1.2 本课题的主要目的及需解决的问题1.2.1本课题研究的目的本课题以锥栗淀粉为原料，通过双重回生的方法处理锥栗淀粉，分析检测用该方法处理的锥栗淀粉的理化特性，并且在体外消化条件下，测定双重回生处理锥栗淀粉样品中快速消化淀粉（RDS）、缓慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）的含量。最后挑选三个典型样品测定其体外抗氧化性能。通过本课题研究，可以探讨锥栗淀粉在双重回生处理后理化特性和体外抗氧化性，为锥栗淀粉的深加工和锥栗淀粉的食品工业应用提供重要的理论依据。1.2.2本课题研究的主要任务 锥栗淀粉的处理：以自制锥栗淀粉为原料，采用双重回生的方法处理锥栗淀粉。 双重回生处理锥栗淀粉理化性质的研究：通过对样品溶解度和膨胀因数、平均聚合度、直链淀粉含量和沥滤率的测定，分析其基本理化性质。 双重回生处理锥栗淀粉体外消化性的研究：构建淀粉体外消化模拟过程，测定并分析得到RDS、SDS及RS的含量。 双重回生处理锥栗淀粉的体外抗氧性能：评价天然物的体处抗氧化活性的方法多种多样，主要有清除自由基型、还原金属离子、抑制脂质过氧化等化学评价方法，以及体外抗氧化活性细胞的生物学方法。通过总抗氧化性的测定、脂质过氧化抑制作用的测定、总还原能力的测定、清除超氧离子自由基、DPPH清除率、ABTS清除能力测定、亚硝酸盐清除率的测定等，可反映出双重回生处理锥栗淀粉样品的体外抗氧化性能。2 材料与方法2.1 原料制备锥栗淀粉：市场购买锥栗，实验室自制锥栗淀粉2.2 实验试剂和仪器 酶制剂：猪胰-淀粉酶（3000 U/g，上海希美生物科技有限公司）、淀粉葡萄糖酶（105789 U/g，上海金穗生物科技有限公司）。化学试剂：无水乙醇、氢氧化钠、碘试剂、醋酸、醋酸钠、浓硫酸、磷酸钠、钼酸铵、PBS、硫氰化铁、ABTS、冰醋酸、卵磷脂、TCA、TBA、浓盐酸、三氯化铁、邻苯三酚、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠、DPPH、维生素C，以上试剂均为分析纯。 实验仪器：WFZUV-2100型紫外可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）、SBA-40C型生物传感分析仪（山东省科学院生物研究所）、GL-3250B型恒温磁力加热搅拌器（苏州江东精密仪器有限公司）、TDZ5-WS型自动平衡离心机（赛特湘仪离心机仪器有限公司）、V-1100D型可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）、XOSHZA水浴恒温振荡器（南京先欧仪器制造有限公司）、SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、DZKW-4电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）、DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱（上海基玮试验仪器设备有限公司）、FE20实验室pH计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。2.3 实验方法2.3.1 双重回生处理锥栗淀粉参照Tian11 等的处理方法并作适当修改：称取10 g锥栗淀粉溶于2倍蒸馏水中，并在沸水浴中加热30 min，将所得的淀粉浆密封并在4下分别保存24 h、36 h、48 h，之后将回生样品置于沸水浴中20 min，然后在4下分别保存24 h、36 h、48 h，将样品烘干后过140目筛得锥栗淀粉产品。2.3.2 直链淀粉含量的测定采用碘比色法12 测定锥栗淀粉的直链淀粉含量： 标准曲线的绘制：取50 mg支链淀粉标准样品，加入50 mL容量瓶中，加入1 mL无水乙醇润湿，再加10 mL 0.1 mol/L NaOH，沸水浴振荡加热10 min溶解淀粉，用蒸馏水定容摇匀。用同样方法配制直链淀粉标准溶液。精确吸取标准溶液于50 mL容量瓶中，配置一系列梯度标准溶液。向各容量瓶加20 mL蒸馏水，用0.1 mol/L HCl调pH值为3.0。再加入0.5 mL I2-KI（碘试剂），定容摇匀，静置10 min，在620 nm下，测吸光度（以蒸馏水作参比溶液）绘制标准曲线。所得直链淀粉含量测定标准曲线计算公式为y=0.0164x（R2=0.9979）。 样品测定：准确称取样品100 mg，加1 mL无水乙醇，润湿振荡，再加10 mL 0.5 M NaOH，沸水浴加热溶解10 min，冷却后用蒸馏水定容摇匀得样品液。吸取2.5 mL样品液于50 mL容量瓶中，加20 mL 蒸馏水后用0.1 mol/L HCl调pH值为3.0，加0.5 mL I2-KI，定容摇匀，静置10 min。在620 nm下，测吸光度。并用标准曲线计算直链淀粉含量。2.3.3 沥滤率的测定参考Chung HJ13 测沥滤率的方法。取20 mg淀粉样品加入10 mL蒸馏水中，80密封水浴加热30 min。冷却至室温，2000 r/min下离心10 min。倒出上清液，测定上清液直链淀粉含量。（沥滤率表示每100 g干淀粉浸出的直链淀粉的百分比）。2.3.4 平均聚合度的测定采用碘吸收法14，称取淀粉样品20 mg加入0.5 mL无水乙醇润湿样品，加入2 mol/L的KOH溶液1 mL，使样品充分溶解。加入10 mL去离子水，用0.1 mol/L的HCl溶液将pH值调至6.07.0，加水定容至50 mL。取10 mL于100 mL容量瓶，加入80 mL去离子水和2 mL I2-KI溶液(I2 2 mg/mL和KI 20 mg/mL)，定容至100 mL，立即混匀。用紫外分光光度计扫描，波长450800 nm。采用紫外-可见分光光度计进行扫描波长范围为450800 nm，测定最大吸收峰；淀粉是不同分子质量同系的混合物，所以表示时用平均聚合度（DP）。根据Banks15公式： 2.3.5 溶解度和膨胀因数的测定参照Koo SH16等的研究方法，准确称取M0=0.6 g淀粉样品，加入到30 mL的蒸馏水中，在85下磁力搅拌器中充分搅拌30 min，再在2026 r/min下离心15 min。小心将上清液倒入培养皿中，并将离心管中的吸胀淀粉称重得M1。将上清液烘干直到恒重，称得培养皿上淀粉重M2。用公式计算溶解度和膨胀因数。 2.3.6 RDS、SDS与RS含量的测定参照Miao17-18等的方法，略做改动。称取50 mg淀粉粉末放入15 mL离心管，用2.5 mL含0.02%叠氮钠、pH5.2的醋酸-醋酸钠缓冲液混匀，预热至37 。将8 g猪胰-淀粉酶（3000U/g，上海希美生物科技有限公司）溶于10 mL上述缓冲液中，于37 孵育10 min，1500g离心得到的上清液即为-淀粉酶溶液。使用前在-淀粉酶溶液中混入125 L（300U/mL）淀粉葡萄糖酶（105789U/g，上海金穗生物科技有限公司）即得混合酶液。3份200 L混合酶液与100 L淀粉乳液的混合液配制后，立即置于37 往复式振荡水浴（170次/min）中依次反应0、20和120 min，加入96%的乙醇溶液900 L钝化酶活性并使之沉淀。沉淀在4 贮放1 h，4 离心（5000 g）10 min。上清液中的还原糖含量采用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶（GOPOD）分析试剂（Wicklow公司，爱尔兰），用SBA-40C生物传感分析仪测定。快速消化淀粉（RDS）、缓慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉含量由0 min（G0）、20 min（G20）、120 min（G120）时的葡萄糖含量以及样品的初始干重（S）按表达式计算而得： 2.3.7 体外抗氧化性2.3.7.1 总抗氧化活性的测定磷钼络合物法 参考Prieto19等的方法，并作适当修改。配制浓度分别2、4、6、8、10 mg/mL的双重回生锥栗淀粉淀粉溶液。取4 mL磷钼试剂液（0.6 mol/L浓硫酸、28 mmol/L磷酸钠和4 mmol/L钼酸铵），加入2 mL不同浓度的锥栗淀粉样品液，95水浴中恒温90 min。以蒸馏水调零，测定其在695 nm波长下测吸光度。吸光度越高抗氧化能力越强，以Vc作阳性对照（Vc配置浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL）。2.3.7.2 DPPH自由基清除率的测定参考Thaipong等20的方法，并作适当修改。浓度对DPPH自由基清除率的影响：配制不同浓度双重回生处理锥栗淀粉样品液，精确吸取2.0 mL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL，摇匀，常温放置30 min，用无水乙醇调零，测定517 nm处吸光度Ai。然后，测定样品溶液2.0 mL与乙醇2.0 mL混合液在517 nm处吸光度Aj；测定DPPH溶液2.0 mL和乙醇2.0 mL混合液在517 nm处吸收度Ac。以Vc作阳性对照。DPPH自由基清除率按公式计算。以样品的不同浓度对清除率作图，可得清除率达到50%时所需样品的量，即IC50值。 2.3.7.3 ABTS+清除能力的测定参考Re21等的方法，并作适当修改。配制浓度分别2、4、6、8、10 mg/mL的双重回生处理锥栗淀粉样品溶液。精确吸取2 mL，加入2 mL ABTS+测定液，准确振荡30 s后，以蒸馏水调零，测定734 nm波长处的吸光度Ai；以等量蒸馏水代替ABTS+测定液，同样方法测定吸光度Aj。以Vc作阳性对照。清除率按公式进行计算。 2.3.7.4 超氧阴离子自由基清除能的测定参照李燕凌等22的方法。吸取pH 8.3的Tris-HC1缓冲液2 mL，加入不同浓度的双重回生锥栗淀粉溶液2 mL，混匀后，37水浴放置20 min，再加入37预热的10 mmol/L邻苯三酚1 mL，混匀后准确反应4 min。加入1滴浓盐酸终止反应，于420 nm波长下测定吸光值Ai；以蒸馏水代替邻苯三酚，同样方法测定吸光值Aj；以蒸馏水代替样品液，同样方法吸光值Ao。以Vc作阳性对照。清除率按公式进行计算。 2.3.7.5 脂质过氧化抑制作用的测定参考Ock-Sook等23的方法，并作了适当改进。配制浓度分别2、4、6、8、10 mg/mL的双重回生锥栗淀粉溶液。于样品管中依次加入1 mL LLS溶液、1 mL 0.4 mmol/L三氯化铁溶液、2 mL不同浓度的锥栗淀粉样品溶液，混匀。37水浴避光反应1 h，再加入2 mL TCA-TBA-HCl混合液，95水浴15 min，迅速冷却，以4000 r/min离心10 min，以蒸馏水调零，取上清液在535 nm测吸光度值Ai；以等量蒸馏水代替样品液，同样方法测得吸光度Ao。以Vc作阳性对照。抑制率按公式进行计算： 2.3.7.6 亚硝酸盐清除率的测定参考赵二劳24等的方法，取5 mg/L的NaNO2标准液2.0 mL于25 mL比色管中，加入不同浓度的双重回生处理锥栗淀粉样品溶液，常温放置30 min后，加入0.4%对氨基苯磺酸2.0 mL，摇匀静置5 min，再加入0.2%盐酸萘乙二胺1.0 mL，用蒸馏水稀释至刻度，放置15 min后，以蒸馏水调零，测定其在540 nm波长下的吸光度值Ai，平行做三次。以等量蒸馏水代替样品液，同样方法测定其吸光值Ao。以Vc作阳性对照。清除率按公式进行计算。 3 结果与讨论3.1 双重回生处理锥栗淀粉的表观直链淀粉含量双重回生处理锥栗淀粉样品中的表观直链淀粉含量见表1。由表1可知淀粉表观直链淀粉含量都在 (20.9750.425) % (23.3850.095) % 范围内。对表1中数据进行单因素方差分析可知，两次回生时间对表观直链淀粉含量的影响不显著（P0.05）。未处理锥栗原淀粉表观直链淀粉含量16.77%，与原淀粉相比，各个样品的表观直链淀粉含量都有比较显著的增加（0.01P0.05），原因是双重回生处理锥栗淀粉过程中，直链淀粉先从淀粉颗粒中脱离出来，同时因高温作用，部分支链淀粉发生降解，增加了淀粉乳液中直链淀粉的含量。表1 双重回生处理锥栗淀粉样品的直链淀粉含量(%)第一次回生时间（h）第二次回生时间(h)2436482422.041.1921.161.34 23.390.103621.070.0921.321.5522.970.134820.980.4321.402.0122.330.183.2 双重回生处理锥栗淀粉的沥滤率双重回生处理锥栗淀粉样品中的沥滤率含量见表2。沥滤率表示每100 g干淀粉浸出的直链淀粉的百分比。同种淀粉的沥滤率与处理的温度有关，随温度的升高而增大25。而在同一温度下（本实验在80下），温度循环回生处理锥栗淀粉样品的沥滤率如表4所示。由表2分析可知，虽然当第一次回生时间相同时，随第二次回生时间增加，其沥滤率增大；当第二次回生时间相同时，随第一次时间曾长，其沥滤率也增大，但通过对表中数据进行单因素方差分析可知，两次回生时间对沥滤率的影响并不显著（P0.05）。表2 双重回生处理锥栗淀粉样品的沥滤率(%)第一次回生时间(h)第二次回生时间(h)243648244.810.194.860.315.025.2365.110.095.210.465.321.02485.290.115.480.295.490.793.3 双重回生处理锥栗淀粉的平均聚合度淀粉是多分散的，它由一系列的不同分子量大小的淀粉分子组成。聚合度指聚合物分子链中连续出现的重复单元(或称链节)的次数。聚合度可作为聚合物分子质量的量度，是衡量高分子聚合物的重要指标，聚合度小，直链淀粉分子短，运动比较剧烈，扩散速度也较大，所以较难聚集；而聚合度太大，直链淀粉过长，分子间的斥力较大，也难聚集，所以只有中等长度才最有利于聚集26。表3是经双重回生处理锥栗淀粉样品的平均聚合度，原锥栗淀粉的max为451.5，平均聚合度为15.61，而处理过程取样的max有所升高，都在543565.5范围内。由表3可见，各样品的平均聚合度都随回生时间增加有所升高，可能原因是经处理后的样品中，直链淀粉的结晶度降低，结晶体减少，分子链增长了，导致淀粉的平均聚合度增大。表3 双重回生处理锥栗淀粉的平均聚合度第一次回生时间(h)第二次回生时间(h)2436482436.1441.4943.193637.7143.1948.734838.9041.4948.733.4 溶解度和膨胀因数的测定直链淀粉可溶解于热水，在热水中溶胀破裂形成胶体溶液，而支链淀粉不溶于热水，只能在热水中溶胀糊化。淀粉粒的无定形相是亲水的，浸入水中就吸水，先是有限的可逆膨胀，而后是整个颗粒膨胀，并且伴有水化热的释放。在低于糊化温度的的热水中，天然淀粉发生溶胀，直链淀粉分子从淀粉粒向水中扩散，形成胶体溶液，当形成的胶体溶液冷却后，直链淀粉即沉淀析出，不能再分散于热水中27。表4、5分别是锥栗淀粉样品的溶解度与膨胀因数。对表4中的数据进行单因素方差分析，两次回生时间对锥栗淀粉溶解度的影响比较显著（0.01P0.05）；当第一次回生时间一样时，随第二次回生时间增加，样品溶解度有所减小，在第二次回生48 h时，溶解度为最小；当第二次回生时间一样时,随第一次回生时间增加,样品溶解度依然减小,在第一次回生48 h时,溶解度为最小。锥栗原淀粉的溶解度为9.99%，与锥栗原淀粉的溶解度相比，双重回生处理锥栗淀粉样品的溶解度有显著增加（P0.01）。由表5可见，虽然当第一次（或第二次）回生时间一样时，随第二次（或第一次）回生时间增加，锥栗淀粉样品膨胀因数有所减小，但减小幅度很小，各样品膨胀因数均在（8.330.12）（8.690.30）的范围内。对表中数据进行单因素分析方差分析可知，两次回生时间对锥栗淀粉样品膨胀因数的影响都不显著（P0.05）。锥栗原淀粉的膨胀因数为23.03，与原淀粉相比，各个样品的膨胀因数都有显著的增加（P0.01）。表4 双重回生处理锥栗淀粉样品的溶解度(%)第一次回生时间(h)第二次回生时间(h)2436482414.981.6514.170.8413.331.673615.000.0014.160.8410.830.834812.502.5011.661.669.170.84表5 双重回生处理锥栗淀粉样品的膨胀因数第一次回生时间(h)第二次回生时间(h)243648248.330.128.690.388.880.91368.520.398.650.068.690.30488.670.068.680.088.640.863.5 双重回生处理锥栗淀粉中RDS、SDS、RS含量通过体外消化处理，测得每个样品的G0、G20、G120，并有葡萄糖含量计算出RDS、SDS、RS含量如表2所示。表6 双重回生处理锥栗淀粉样品的RDS、SDS、RS含量(%)第一次回生时间(h)第二次回生时间(h)243648RDSSDSRSRDSSDSRSRDSSDSRS2415454025403530353536254035405010257054850153540303070525由表6可以看出，第一次回生24 h和48 h的锥栗淀粉样品的SDS含量随第二次回生时间的增加而减小，RS含量基本不变化。而第一次回生36 h的锥栗淀粉样品随第二次回生时间的增加其SDS含量有明显的增加，RS含量减小。从这九个样品中，选取SDS和RS含量之和较高的三个典型样品即第一次回生24 h、第二次回生24 h的锥栗淀粉样品，第一次回生36 h、第二次回生48 h的锥栗淀粉样品，第一次回生48 h、第二次回生48 h的锥栗淀粉样品进行体外抗氧化实验。3.6 双重回生处理锥栗淀粉的体外抗氧化性从2.3.1中选取三个典型样品，它们分别为第一次回生24 h，第二次回生24 h锥栗淀粉（RDS、SDS、RS含量分别为15、45、40，其SDS和RS含量在9个样品中均较高）；第一次回生36h、第二次回生48 h锥栗淀粉（RDS、SDS、RS含量分别为25、70、5，其SDS含量为9个样中最高）；第一次回生48 h、第二次回生48 h锥栗淀粉（RDS、SDS、RS含量分别为70、5、25，其SDS含量最低）。3.6.1 总抗氧化活性一般情况下，物质的还原能力与抗氧化活性之间有显著的相关性，还原能力越强，其抗氧化能力也越强28。不同浓度下的双重回生处理锥栗淀粉样品的总抗氧化活性见图1。由图1可知，SDS锥栗淀粉样品液在695 nm处的吸光度随浓度的增加也逐渐升高，说明样品液的抗氧化活性跟浓度成正比关系。以线性统计分析，除第一次回生48 h、再回生48 h的锥栗淀粉样品的正相关度R2为0.97，稍差外，其它两种锥栗淀粉的正相关度R2都大于0.98。由图1可以看出在锥栗淀粉浓度为6 mg/mL时，三个锥栗淀粉样品的抗氧化活能力几乎一致。图1 双重回生处理锥栗淀粉的总抗氧化能力3.6.2 DPPH自由基清除能力图2 反映了不同浓度的双重回生处理锥栗淀粉样品以及阳性对照物维生素C对DPPH自由基的清除能力。由图2可以看出，随着锥栗淀粉样品浓度升高，其清除DPPH自由基的能力逐渐增强。当它们的浓度低于6 mg/mL时，DPPH清除率随浓度升高而增加的速率较快（0.01P0.05）；而高于6 mg/mL后，DPPH清除率随浓度升高而增加的速率则变缓（P0.05）。由图2还可知，当锥栗淀粉样品浓度为10 mg/mL时，第一次回生24 h再回生24 h锥栗淀粉样品，第一次回生36 h再回生48 h锥栗淀粉样品，第一次回生48 h再回生48 h锥栗淀粉样品对DPPH的清除率分别为82.31%、79.69%和83.37%，它们的IC50分别为4.21 mg/mL，4.6 mg/mL，4.23 mg/mL。图2 双重回生处理锥栗淀粉对DPPH的清除率3.6.3 ABTS自由基清除能力图3为不同浓度下，双重回生处理锥栗淀粉样品对ABTS自由基消除能力，由图3以看出SDS锥栗淀粉对ABTS清除能力随浓度增大而增大，当清除率达到80%后增速缓慢，逐渐趋于100%。第一次回生24 h、再回生24 h锥栗淀粉样品的IC50=1.53 mg/mL，第一次回生36 h、再回生48 h锥栗淀粉样品的IC50=1.9 mg/mL，第一次回生48 h、再回生48 h锥栗淀粉样品的IC50=2.2 mg/mL。与阳性对照物Vc相比，浓度为6 mg/mL的锥栗淀粉与浓度为0.6 mg/mL的Vc对ABTS自由基的消除能力相当。在常温下，相比对DPPH自由基的清除率，相同浓度的双重回生处理的锥栗淀粉样品对ABTS自由基的清除能力更强。图3 双重回生处理锥栗淀粉的ABTS+清除率3.6.4 超氧阴离子自由基清除能力邻苯三酚在碱性条件下自氧化形成中间产物超氧阴离子自由基，此自由基能促进邻苯三酚自氧化，因此通过测定受试物对邻苯三酚自氧化抑制作用，即可表征其对超氧阴离子自由基清除作用。不同浓度双重回生处理锥栗淀粉样品对邻苯三酚自氧化产生的O2-清除率如图4所示。由图4可知，双重回生处理锥栗淀粉样品对超氧阴离子自由基的抑制作用都随浓度的增加而增大，其中第一次回生24 h、再回生24 h锥栗淀粉样品的清除率最大，但总的来说双重回生处理锥栗淀粉样品对O2-清除能力较低，最大的仅为25.86%。与阳性对照物Vc相比，三个锥栗淀粉样品对O2-清除率较弱，Vc浓度在0.6 mg/mL时对O2-的清除率达到了51.35%，但增大浓度后增速变慢，而锥栗淀粉的IC50值大于10 mg/mL。图4 双重回生处理锥栗淀粉样品对超氧阴离子自由基清除率3.6.5 脂质过氧化的抑制作用自由基进攻的主要靶物质是细胞膜上的不饱和脂类，脂类的过氧化随老化及致癌作用而显著上升。卵磷脂通常被用作细胞膜模型进行体外的脂质过氧化的研究。不同浓度下双重回生处理锥栗淀粉样品的脂质过氧化抑制率见图5。由图5可知，由Fe2+ 引发的卵磷脂脂质体体系中，双重回生处理锥栗淀粉样品表现出抗氧化能力，且随浓度的升高抑制作用增强，在浓度为10 mg/mL时均能达到25%以上，其中抑制率最高的样品是经第一次回生24 h后再回生24 h锥栗淀粉样品，达到了33.50%。说明双重回生处理的锥栗淀粉对脂质过氧化有一定抑制作用。图5 双重回生处理锥栗淀粉的脂质过氧化抑制率 3.6.6 亚硝酸盐的清除能力亚硝酸盐是当前令人关注的一类化学致癌物，它能引起人和动物肝脏等多种器官的恶性肿瘤。清除人体内亚硝酸盐防止癌症的有效途径30。图6为不同浓度下双重回生处理锥栗淀粉样品对亚硝酸盐的清除率。由图6可知，随着浓度的增大，三个锥栗淀粉样品对亚硝酸盐的清除能力相近，且都随浓度的增大而增强，但浓度为10 mg/mL时，清除率只达到了40%左右，说明双重回生处理的锥栗淀粉对亚硝酸盐的抑制率稍差，从曲线趋势判断，它们的IC50值将大于10 mg/mL。图6 双重回生处理锥栗淀粉样品的亚硝酸盐清除率4 结论 双重回生处理锥栗淀粉样品并测定各样品表观直链淀粉含量、沥滤率、平均聚合度、溶解度和膨胀因数。结果表明：两次回生时间对锥栗淀粉样品表观直链淀粉含量、沥滤率和膨胀因数的影响都不显著；对平均聚合度和溶解度的影响比较显著。而与锥栗原淀粉相比，样品表观直链淀粉含量有比较显著的增加，平均聚合度、溶解度和膨胀因数有显著增加。 通过体外消化试验测定双重回生处理锥栗淀粉样品中各组分含量，得到各个样品RDS，SDS，RS的含量，发现第一次回生24 h和48 h的锥栗淀粉样品的SDS含量随第二次回生时间的增加而减小，RS含量基本不变化。而第一次回生36 h的锥栗淀粉样品随第二次回生时间的增加其SDS含量有明显的增加，RS含量减小。 对挑选出的三个锥栗淀粉样品采用测定总抗氧化能力、清除DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子、亚硝酸盐的能力以及和抑制脂质过氧化这6种方法来评价它们的体外抗氧化性。结果显示，三个经不同回生时间处理的锥栗淀粉样品总抗氧化活性随浓度增大而增强，并有较好的线性相关性；对ABTS+清除能力较好，2 mg/mL时清除率可达50%左右；相较之下，对DPPH清除率稍弱，在浓度为10 mg/mL时为80%左右；但是三个锥栗淀粉样品对脂质过氧化抑制率，超氧阴离子自由基清除率及亚硝酸盐的清除率效果较差，需加大浓度才能达到50%以上的清除率。参考文献1 Englyst HN, Kingman SM, Cummings JH. Classification and measurement of nutritionally important starch fractions J. Eur J Clin Nutr , 1992, 46(Suppl 2): 33- 50.2 Eerlingen RC, Crombez M, Delcour JA. Enzyme-resistant starch: I.Quantitative and qualitative influence of incubation time and temperature of autoclaved starch on resistant starch formation J. Cereal Chem, 1993, 70: 339- 344.3 Shin SI, Kim HJ, Ha HJ, et al. Effect of hydrothermal treatment on formation and structural characteristics of slowly digestible non-pasted granular sweet potato starchJ. Starch/Strke, 2005, 57: 421430.4 Ells LJ,Seal CJ, Kettlitz B, et al. Postprandial glycemic, lipaemic and haemostatic responses to ingestion of rapidly and slowly digested starches in healthy young womenJ. British Journal of Nutrition, 2005, 94; 948955.5 Wolf BW, Bauer LL, George C, et al. Effects of chemical modification on in vitro rate and extent of food starch digestion: An attempt to discover a slowly digested starchJ. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47: 41784183.6 Jenkins DJ. Glycemic Index: Overview of Implications in Health and DiseaseJ. American Journal of Clinical Nutrition, 2002, 76: 266273.7 Campfield LA, Smith FJ. Blood Glucose Dynamics and Control of Meal Initiation: a Pattern Detection and Recognition theoryJ.Physiological Reviews,2003, 83: 2558.8 Shin SI, Kim H, Moon TW. Formation and structural characteristics of slowly digestible starch in sweet potato as affected by hydrothermal treatments: 2004 IFT Annual Meeting and Food ExpoC. Las Vegas, 2004.9 Hamaker BR, Han XZ. Slowly digestible starchP. WO Patent 2004066955, 2008-08-12.10 Shi YC, Cui X, Birkett AM,et al.Starch with aslow digestion productP. US Patent 6929817,2005-08-1611 Tian YQ, Zhan JL, Zhao JW, et al. Preparation of products rich in slowly digestible starch (SDS) from rice starch by a dual-retrogradation treatmentJ. Food Hydrocolloids, 2013, 31:1-412 Sushil D, Ashok KS, Michael JG. Effect of cryo-milling on starches: functionality and digestibilityJ. Food Hydrocolloids, 2010, 24; 152-163.13 Chung HJ, Liu Q, Hoover R. Impact of annealing and heat-moisture treatment on rapidly digestive slowly digestible and resistant starch levels in native and gelatinized corn, pea and lentil starchesJ. Carbohydrate Polymers, 2009, 75: 436-447.14 Takeda C, Takeda Y, Hizuku