分子生物学的研究方法DNA蛋白质相互作用

西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 第六节 研究 DNA与蛋白质相互作用的方法 又叫做 DNA迁移率变动试验 ， 是 80年代初出现的用于在体外研究 DNA与 蛋白质相互作用的一种 特殊的凝胶电泳技术 。 简单 、 快捷 ， 是当前被选 作分离纯化特定 DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法 。 在凝胶电泳中 ， 由于电场的作用 ， 裸露的 DNA朝正电极移动的距离是同 其分子量的对数成反比 ， 如果 DNA分子结合上一种蛋白质 ， 那么由于分 子量加大 ， 在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞 ， 朝正电极移动的距离也 就相在缩短了 。 所以当特定的 DNA片段同细胞提取物混合之后 ， 若其在 凝胶电泳中的移动距离变小了 ， 这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋 白质分子发生了结合作用 。 2.6.1 凝胶阻滞试验 原理 返回目录 返回第二章 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 凝胶阻滞试验方法 首先是用放射性同位素 标记 待检测的 DNA片段（亦称探针 DNA）， 然后同 细胞蛋白质提取物一道 温育 ，于是便有可能形成 DNA一蛋白质复合物。将 它 加样到非变性的凝胶 中，在控制使蛋白质仍与 DNA保持结合状态的条件 下进行 电泳分离 ，并应用放射自 显影 技术显现具放射性标记的 DNA条带位 置。如果细胞层白质提取物中不存在可同放射性标记的探针 DNA结合的蛋 白质，那么所有放射性标己都将集中出现在凝胶的底部；反之，将会形成 DNA一蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针 DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。所以有的文献中也称这 种试验为 条带阻滞试验 （ band retardation assay）。 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 凝胶阻滞试验用途 鉴定特殊细胞提取物中 ， 是否存在可同放射性标记的探针 DNA结合的蛋白 质分子 （ 比如特异的转录因子等 ） 研究发生此种结合作用之精确的 DNA序列的特异性 ：其办法是在 DNA一 蛋白质结合反应体系中 ， 加入超量的非标记竞争 DNA。 如果竞争同一种蛋 白 ， 由于竞争 DNA与探针 DNA相比是极大超量的 ， 绝大部分蛋白质都会 被其竞争结合掉而使探针 DNA处于自由状态 ， 自显影图片上不出现阻滞的 条带 ， 相反 ， 如果不竞争同一蛋白 ， 探针 DNA仍与特定蛋白复合 ， 呈现阻 滞的条带 。 使用竞争 DNA， 可间接阐明体内的 DNA与蛋白质的相互作用 。 如 ， 使用 一种具有与已知转录因子结合位点的竞争 DNA， 就可以判断检测到的蛋白 质是否属于此类转录因子 ， 或是与之相关的其它转录因子； 如果事先引入 突变 ， 可以检测 突变对其与转录因子结合作用的影响 。 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 2.6.2 DNasel足迹试验 尽管凝胶阻滞试验能够揭示出在体内发生的 DNA蛋白质之间 相互作用的有关信息 ， 然而它却无法确定两者结合的准确部 位 。 要解答这个问题 ， 则需要应用 DNasel 足迹试验 （ footprinting assay） 。 它是一类用于检测与特定蛋白质结合 的 DNA序列的部位及特性的专门的实验技术 。 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 DNasel足迹试验过程 首先是将待检测的双链 DNA分子用 32P作末端标记，并用限制酶去掉其 中的一个末端， 得到只一条链单末端标记的双链 DNA分子 体外同细胞蛋白质提取物混合 。待二者结合之后，再加入少量的 DNasel（ 它可沿着靶 DNA作随机单链切割） 消化 DNA分子 ，并控制酶的 用量使之达到平均每条链只发生一次磷酸二脂键的断裂。如果蛋白质提取 物中不存在与 DNA结合的特异蛋白质，经 DNasel消化之后便会产生出距 放射性标记末端 1个核苷酸、 2个核苷酸、 3个核苷酸等一系列前后长度均 仅相差一个核苷酸的、不间断的、连续的 DNA片段梯度群体。 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 从此混合物中除去蛋白质之后，将 DNA片段群体加样在 变性的 DNA 测序凝胶中进行电泳分离 ，经放射自 显影 ，便可显现出相应于 DNasel 切割产生的不同长度 DNA片段组成的序列梯度条带。但是，如果有一 种蛋白质已经结合到 DNA分子的某一特定区段上，那么它就将保护这 一区段的 DNA免受 DNasel的消化作用，因而也就不可能产生出相应长 度的切割条带。所以在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质 结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形 象地称之为“足迹” 。 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 足迹试验的优点 可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定 DNA片段 之间的结合区域。如果使用较大的 DNA片段，通过足迹试 验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间 的结合位点的分布状况。如同凝胶阻滞试验一样，也可以 加入非标记竞争 DNA， 来消除特定的足迹，据此确定其核 酸序列的特异性。 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 DNasel足迹试验发展 目前还出了若干种其它类型的足迹试验 。 例如 ， 自由羟基足迹试验及 菲咯琳铜足迹试验等 。 其中最有趣的是 硫酸二甲脂 （ DMS） 足迹试验 。 它所依据的原理是 ， DMS能够促进 DNA中裸露的 G甲基化 ， 而六氢吡啶 又会对甲基化的 G残基作特异的化学切割 。 假如有一种蛋白质同 DNA分 子中的某一区段结合 ， 在它的保护下 ， 区域内的 G免受六氢吡啶的切割 ， 于是在 DNA片段的序列梯中 ， 便不存在具这些 G残基末端的 DNA片段 ， 故出现个空白区域 ， 此即通常所说的足迹 。 与其它足迹试验不同，由于 DMS足迹试验中被切割的是 G残基，因此 可用来鉴定同转录因子蛋白质结合的 DNA区段中的特异碱基。 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 2.6.3 甲基化干扰试验 应用甲基化干扰试验 （ methvlation interference assay） 技术 ， 可以检测靶 DNA中特异 G残基的优先甲基化对尔后的蛋白质结 合作用究竟会有什么效应 ， 从而更加详细地揭示 DNA与蛋白 质之间相互作用的模式 。 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 甲基化干扰试验的具体操作 先用 硫酸二甲脂（ DMS） 处理 靶 DNA， 控制反应条件，使平均每条 DNA分 子只有一个 G甲基化 ，而后将这些局部甲基化的 DNA群体同含有 DNA结合 蛋白的适当的 细胞提取物一道温育 ，并作凝胶阻滞试验。经 电泳 分离之后， 从凝胶中切 取出具有结合蛋白质的 DNA条带和没有结合蛋白质的 DNA条带 ， 并用 六氢吡啶处理 之，于是甲基化的 G残基被切割，非甲基化的 G残基则不 被切割。显而易见，如果某个 G因甲基化而 不与蛋白质结合 ，那么六氢吡 啶对这个甲基化 G残基的 切割作用，就只能在没有同蛋白质结合的 DNA分 子上表现出来 。相反地，如果一个特殊的 G残基在 DNA与蛋白质的结合中 不起作用 ，那么六氢吡啶对这个 G残基的切割作用，则在同蛋白质结合的 DNA分子及不同蛋白质结合的 DNA分子中 均可观察到 （图 2 44） 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 甲基化干扰试验的用途 甲基化干扰试验不仅可以用来 研究蛋白质与 G残基之间的联系 ，而且同 样也可以用来 研究 DNA结合蛋白质与结合位点中的腺嘌呤 A残基之间的 联系作用 。头一个办法是使所有的嘌呤残基甲基化，以便同时研究甲基 化的 G和 A残基对蛋白质与 DNA结合的干扰效应。第二种办法是使用焦 碳酸二乙脂（ DEPC） 特异性修饰 A， 而使之易受六氢吡啶的切割作用。 对于研究诸如像具有相对少数 G残基的八聚体基序（例如 OCt 1， OCt 2等，它们可与八聚体结合蛋白质结合）这样的序列而言，这些甲基化 干扰试验技术具有特别的价值，因为只要研究 G残基的甲基化干扰，就 可获得有用的信息。 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 DMS化学干扰的主要局限性 它只能使 G和 A残基甲基化，而不能使 T和 C残基甲基化。尽管 如此，它仍不愧为足迹试验的一种有效的补充手段，可以鉴定 足迹区段中 DNA与蛋白质相互作用的精确位置。 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 2.6.4 体内足迹试验 上面所讨论的这三种方法有一个共同的 不足之处 ， 即它们都是在 体外进 行 的试验 。 因此人们自然会问 ， 这些结果能够确切地反映活细胞内发生 的 DNA一蛋白质相互作用的真实情况吗 ？ 为了解答这个问题 ， 科学工作 者又设计出了一种体内足迹试验体系 。 然而究其实质而言 ， 这种技术无 非是体外 DMS足迹试验的一个变种而已 。 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 体内足迹试验的方法 用有限数量的化学试剂 DMS处理完整的游离细胞，并使其渗透到细胞内的 浓度 恰好导致天然染色质 DNA中的 G残基发生甲多化 。而后从这些细胞中 提取 DNA， 并加入 六氢吡啶作体外消化 。结果情况就如同体外足迹试验一 样，能同某种特殊蛋白质因子结合的 DNA区段，其上的 G残基就不会被 DMS甲基化，因而也就不会被六氢吡啶所切割。因此，同对照的体外裸露 DNA所形成的序列梯比较，就会发现由完整的活细胞染色质 DNA形成的序 列梯中，缺少了 G残基没有被切割的相应条带（图 2 45）。 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 体内足迹试验优缺点 显而易见，与应用克隆 DNA片段所作的体外足迹试验的结果相比，经 体内足迹试验从染色质总 DNA中所获得的任何一种特异 DNA的数量， 都是微不足道的。因此，有必要通过 PCR扩增特异的靶 DNA， 以获得 足够数量的 DNA样品。如今体内足迹试验已发展成为研究在完整的活 细胞内， DNA一蛋白质结合位点及检测结合位点中碱基突变效应的一 种极有效的手段。 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 应用凝胶阻滞试验、 DNasel足迹试验、甲基化干扰试验，以及体内足迹 试验等多种用于研究 DNA与蛋白质相互作用的基本实验手段，将有助于 深入地探讨基因启动子元件的结构与功能，及其与蛋白质转录因子之间 相互作用的有关细节；揭示 mRNA转录超始和终止的分子本质与主要步 骤；阐明在发育过程中基因表达调节的时空特异性；以及外源基因在转 基因植株中表达的分子机理，等等。这些研究结果，将为我们提供大量 重要的信息，以最终弄清基因表达调节的真实内容。 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 -生命科学院 思考题 1、研究 DNA与蛋白质相互作用的方法有哪些？ 2、凝胶阻滞试验原理是什么？ 3、 用图示的方法说明 DNasel足迹试验的过程。 4、甲基化干扰试验有什么用途？ 5、什么是体内足迹试验？