优《血红蛋白的提取和分离》

本课题学习目标 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并 了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。 1、主要概念： 凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液 它们在 血红蛋白的提取中分别起到什么作用。 2. 主要原理： 凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理 3、课题重点： 凝胶色谱法的原理和方法 4、 课题难点： 样品的处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 1.分离生物大分子的基本思路： 选用一定的 物理或化学 的方法分离具有不同物 理或化学性质的 生物大分子 。 2.蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质 各种特性 的差异，如 分子的形状和 大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质 和对其他分子的亲和力 等等，可以用来分离 不同种 类的蛋白质。 一、血红蛋白的提取和分离 3、提取分离方法 凝胶色谱法 凝胶电泳法 （一） 凝胶色谱法（ 分配色谱法 ） 2.凝胶： 大多数凝胶是由 多糖类化合物 （如葡聚糖或琼 脂糖）构成的多孔小球体 ， 内部有许多贯穿的 通道。 根据被分离物质的 蛋白质相对分子质量 的大小， 利用具有网状结构的凝胶，来进行 分离。 1.概念： 3.凝胶色谱法的原理 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时， 相对 分子量较小的蛋白质 容易 进入凝胶内部的通道， 路程较长，移动速度较慢 ; 相对分子量 较大 的蛋白质 无法进入凝胶内部的 通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速 度较快。 依据的特性是： 蛋白质分子量的大小。 4.凝胶色谱法 分离蛋白质 的原理和 具体过程 凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 （二）缓冲溶液 1.概念 : 在一定的范围内，凡是能够抵制 外加少量强 酸或强碱 的影响使原来溶液 PH值基本保持 不变的混 合溶液。 能够抵制外界的酸和碱对溶液 PH值的影响， 维持 PH基本不变。 2.作用 : 思考：说出人体血液中缓冲对。 NaH2PO4/Na2HPO4 H2CO3/NaHCO3 通常由 1 2 种缓冲剂 溶解于水中配制而成。调节 缓冲剂的 使用比例 就可以制得在 不同 PH范围内使用的 缓冲液。 4.提问：在本课题中使用的缓冲液是 :_ , 利用缓冲液 模拟细胞内的 PH环境 ，保证 血红蛋白的正常结构和功能 ，便于观察 (红色 )和科 学研究 (活性 ) 磷酸缓冲液 3.缓冲溶液的配制 : 其目的是 : （三） 电泳： 1.概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.原理： 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 可解离的基团，在 一定的 PH下，这些基团会带上正 电或负电。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带 电荷 相反 的电极移动。 分离样品中各种分子 带电性质的差异以及分子本 身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁 移速度， 从而实现样品中各种分子的分离。 影响蛋白质分子运动速度的因素 决定 运动方向 形成 库仑力 形成 阻力 决定 运动速率 电荷性质 电荷量 分子形状 分子大小 3.类型 : 琼脂糖 凝胶电泳、 聚丙稀酰胺 凝胶电泳。 在 电场 的作用下， 这 些 带电 分子 会 向着 与 其所 带电 荷相 反的 电极 移 动 琼脂糖凝胶电泳示意图 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、测定蛋白质分子量 :常用 十二烷基硫酸钠 （ SDS） 聚丙烯酰胺 凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由 单体丙烯酰胺 和 交联剂 N,N - 亚甲基双丙烯酰胺 在 引发剂 和 催化剂 的作用下聚合交联 成的具有三维网状结构的凝胶。 N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联） 丙烯酰胺和交联剂 N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的 迁移率 取决 于它所带 净电荷的多少 以及 分子的大小 等因素。 2.原理： SDS能使 蛋白质发生完全变性。解聚成单条 肽链 ，因此测定的结果只是 单条肽链的分子量 。 SDS能与各种蛋白质形成 蛋白质 SDS复合物 ， SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子 原有 的电荷量 。因而 掩盖了不同种蛋白质间的电荷差 别， 使 电泳迁移率完全取决于分子的大小 。 3. SDS作用机理 : 用 SDS测定蛋白质分子量的方法 使用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋 白质的分子量时，可选用一组 已知分子量 的标准蛋白 同时进行电泳，根据已知分子 量的标准蛋白的 电泳区带位置 ，可以测定 未知蛋白质 的分子量。 市场上有高分子量、 次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出 售。 二、实验操作 样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 1.样品处理： （一）蛋白质提取和分离步骤 （二）操作过程 可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来 分离血红蛋白。 血 液 血浆 水 分 固体物质： 血浆蛋白、 无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （ 90） 两个 肽链 两个 一肽链 四个亚铁血红素基团 2.提问： 血液有哪些成分？ 1.提问： 用鸡的红细胞提取 DNA，用猪、牛、羊的 红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有 DNA，便于进行 DNA 的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋 白含量丰富，便于提取血红蛋白。 血红蛋白 两个 肽链 两个 一肽链 四个亚铁 血 红素基团 每个肽链环绕一个 亚铁血红素基团， 此基团可携带 一分子 O2或一分子 CO2， 血红蛋白因含有 血红素 而 呈 红色 。 血红蛋白的特点： (1)红细胞的洗涤 : 去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化 . 1、采集血样 2、低速短时间离心 （速度越高和时间越长，会使白细 胞等一同沉淀，达不到分离的效果） 3、吸取血浆： 上层透明的黄色血浆。 4、盐水洗涤： 下层暗红色的红细胞 +五倍体积的 0.9 的 NaCl溶液洗涤，搅拌 10min 5、低速 短时间 离心： 6、重复 3、 4、 5步骤三次 上清液中已没有黄色：红细胞洗涤干净。 目的 : 操作： 洗涤次数过少 ,无法除去血浆蛋白。 (2)血红蛋白的释放： 加蒸馏水到 原血液体积 ， 加 40体积的甲苯 （溶解细胞膜） 置于 磁力搅拌器 搅拌 10min（加速细胞破裂） 红细胞破裂，释放出血红蛋白 (3)分离血红蛋白溶液： 过程 ： 将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min的速 度 离心 10 min。 试管中溶液层次： 第 1层（最上层）： 甲苯层 （无色透明）； 第 2层（中上层）： 脂溶性物质沉淀层 （白色薄层固体）； 第 3层（中下层）： 血红蛋白的水溶液层 （红色透明液体）； 第 4层（最下层）： 杂质沉淀层 （暗红色）。 分离 ： 滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层， 分液漏斗中静置：分出下层的 红色透明液 体 。 甲苯层 （ 无色透明） 白色薄层固体 红色透明液体 杂质沉淀层 （ 暗红色 ） 试管中溶液层次 (4)透 析： 过程： 取 1ml的血红蛋白溶液 装入透 析袋中，将透析袋放入盛有 300ml的 20mmol/l的磷酸缓冲 液 中（ pH为 7.0），透析 12h 目的： 除去样品中分子量较小的杂质和离子。 或用于更换样品的缓冲液。 20mmol/L磷酸缓冲液 1mL 透析过程动画演示 2.凝胶色谱操作 : （ 1）凝胶色谱柱的制作： 取长 40厘米，内径 1.6厘米的玻璃管， 两端磨平。 底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用 100目尼龙纱包好，插到玻璃管的 一 端 。 注意事项：玻璃管的 上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还 会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 顶塞的制作： 打孔 安装玻璃管 。 组装： 将上述三者按相应位置组装成一个整体 。 安装其他附属结构。 （ 2）凝胶色谱柱的装填 凝胶的选择： A、材料： 交联葡聚糖凝胶（ G-75）。 B、代表意义 ： “ G” 表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围 。 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨 胀时吸水 7.5克。 凝胶的前处理： 配置凝胶悬浮液： 计算并称取一定量的凝胶浸泡于 蒸馏水或洗脱液 中 充分溶胀后，配成 凝胶悬浮液。 凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将 凝胶悬浮液一次性 缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀 注意： 1、装填时尽量紧密： 降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在： 因为气泡会搅 乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 。 洗涤平衡： 连接缓冲液洗脱瓶，在 50cm高的 操作压下，用 300ml的 20mmol/L的 磷酸缓冲液（ pH为 7.0） 充分洗涤 平衡 12h。 注意： 1、液面不要低于凝胶表面，否则 可能有气泡混入，影响分离效果 2、不能发生洗脱液流干，露出凝 胶颗粒的现象 。 （ 2）凝胶色谱柱的装填 50cm高 （ 3）样品加入与洗脱 调节缓冲液面： 打开下端出口，使 缓冲液下降到与凝胶面 平齐，关闭出口 滴加透析样品 ： 吸管吸 1ml样品加到色谱柱的 顶端 ， 注意： 1、不要触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样 3、吸管管口贴着管壁环绕移动加样 样品渗入凝胶床： 打开下端出口，使样品渗入凝胶床内， 样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 洗脱： 加入 pH=7.0 的 20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度， 连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 收集： 待 红色的蛋白质接近色谱柱底端 时，用试管收集流出 液，每 5ml收集一试管，连续收集 。 （如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） （ 3）样品加入与洗脱 注意： 正确的加样操作是： 1、不要触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样。 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 思考下面的问题： 让血红蛋白处在稳定的 pH范围内，维持结构和 功能正常。 1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓 冲液处理的目的是什么？ 2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？ 这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？ 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过 观察 颜色 来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋 白的分离过程 非常直观，大大简化了实验操作。 血红蛋白提取和分离的程序包括： 样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定 。 样品的处理： 通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、 离心等操作收集到 血红蛋白溶液 ， 样品的粗分离 :透析 去除分子量较小的杂质 样品的纯化： 凝胶色谱法 除去 相对分子质量较大 的 杂质蛋白 纯度鉴定 :聚丙烯酰胺凝胶电泳 进行纯度鉴定。 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？ （三） SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做） 2.试剂的配制： 鉴定血红蛋白纯度。 1.目的： 3.方法步骤：（略） 观察处理的血液样品离心后 是否分层，如果分层不明显， 可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。 此外，离心速度过高和时间过长，会使 白细胞和淋巴细胞 一同沉淀 ，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取 纯度。 三、实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处 理后的样品发生了哪些变化吗？ 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱 柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 1、 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以 在凝胶柱旁放 一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。 2、加入大分子的有色物质， 例如蓝色葡聚糖 2000或红色 葡聚糖 ， 观察色带移动的情况。如果 色带均匀、狭窄、平 整，说明凝胶色谱柱的性能良好 。 3、 色谱柱出现 纹路或是气泡 ， 轻轻敲打柱体以消除气泡， 消除不了时要重新装柱。 红色区带：均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出； 说明凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确 红色区带：歪曲、散乱、变宽， 说明分离的效果不好， 这与凝胶色谱柱的装填有关。 3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移 动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离 效果？ 启动 I n t e r n e t E x p l o r e r 浏览器. l n k