异补骨脂素对人晶状体上皮细胞雌激素受体表达的上调作用

异补骨脂素对人晶状体上皮细胞雌激素受体表达的上调作用黄秀榕;祁明信;张可丽;郭娜【摘要】目的:研究人晶状体上皮细胞(HLECs)雌激素受体(ER)表达的情况及中药 植物雌激素异补骨脂素(ISR)对ER表达的影响,为中药植物雌激素防治老年性白内 障提供实验依据方法：本研究将ISR与HLEC共同孵育，以雌二醇(E2)作为阳性对照, 再用H2O2对HLECs造成氧化损伤后，采用流式细胞术检测不同浓度的ISR对ER 蛋白表达的影响结果:正常HLECs存在ERa、p的表达;H2O2组HLECs ERa、p 表达明显下降，与空白组比较差异显著(Pv0.01)；E2和ISR高、中、低浓度组 HLECs的ERa、p表达明显升高，与H2O2组比较差异显著(PvO.01);且随ISR浓度 的增高ERa、p表达逐渐升高，呈明显的浓度依赖关系.结论:E2、ISR能上调经 H2O2处理的HLECs的ERa、ER0表达,并呈明显的浓度依赖关系,其抗氧化损伤 作用，可能是通过上调ERa、ERp表达实现的.【期刊名称】 中国病理生理杂志【年(卷),期】 2010(026)009【总页数】5页(P1844-1848)【关键词】 人晶状体上皮细胞;受体,雌激素;异补骨脂素;氧化性损伤;白内障【作 者】 黄秀榕;祁明信;张可丽;郭娜【作者单位】 福建中医药大学病理生理研究中心,福建,福州,350003;福建中医药大学附属第二人民医院眼科,福建,福州,350003;福建中医药大学病理生理研究中心,福建,福州,350003;福建中医药大学病理生理研究中心,福建,福州,350003正文语种】中文【中图分类】R285.5;R776.1近年来的流行病学调查研究和实验研究结果1，2从不同角度表明老年性白内 障与雌激素间存在一定的相关性。在核性、后囊下和皮质性白内障 3 种类型之中， 女性白内障的患病率都高于男性，而当服用雌激素后，女性核性白内障患病率有所 下降;单独应用雌激素或雌激素孕激素联合应用的激素替代疗法与降低白内障的 风险有联系，绝经后使用雌激素可减少白内障的发生，对晶状体透光性有保护作用;典型闭经的激素水平与白内障的发生也有显著的依从性;在对SD大鼠应用甲基亚 硝脲诱导的年龄相关性白内障模型中研究发现，去卵巢后未予雌激素组晶状体混浊 眼数较给予雌二醇或雌酮组高，未用雌激素组晶状体透光率较使用雌激素组低;抗 雌激素药他莫昔芬使用5年以上可增加发生白内障的危险，这可能与阻断晶体氯 离子通道而导致晶状体混浊有关。而近年的实验研究表明，很多富含植物雌激素的 中药，如补骨脂、牛膝、葛根、淫羊藿、黑升麻、虎杖等具有类雌激素活性 3， 异补骨脂素(isopsoralen，ISR)为中药补骨脂的有效单体，归肾、脾经，温肾助阳， 肾属水，肝属木，水可生木，即肾可生肝，而肝开窍于目。本实验选取ISR作用 于H2O2处理的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells，HLECs)，探讨 其对老年性白内障的防治作用。材料和方法1 材料1.1 仪器流式细胞仪(Flow Cytometer，FCM)(BD FACScan)、CO2 培养箱 (FORMA 2111)、倒置相差显微镜(Olympus IMT-413)、超净工作台(江苏SW -CJ-IF)、微量移液器(Gilson)、冰箱(青岛BCD- 268)、超低温冰箱(MDF-V5410)、电热式压力消毒器(上海YXQ.SG41)、数字酸度计(上海PHS-25)、微 量电子天平(上海FA200X)、低速水平离心机(北京LD4-2)、恒温水浴锅(深圳 HH-4)、干燥箱(上海101A-2)、自动三重纯水蒸馏器(上海SZ-97)、真空泵 (EF006)。1.2试剂雌二醇(P - estradiol , E2)粉末，纯度97% , Sigma;ISR粉末，购自中 国药品生物制品检定所;胰蛋白酶(trypsin)为美国Gibco产品，乙二胺四乙酸 (ethylenediamine tetraacetic acid , EDTA)为 Augus 产品，购自华美生物工程 公司;DMEM 培养基(Dulbeccos modified Eagles medium)干粉为 Gibco 产品， 牛血清白蛋白(bovine serum albumin , BSA)为Amresco产品，新生牛血清 (newborn calf serum , NCS)为奥地利PAA产品，购自厦门泰京生物技术有限公 司;HEPES 为 Amresco 产品，Triton X - 100、NP - 40 为 Sigma 产品，购自厦 门鹭隆生物技术有限公司;兔抗人ERa、p多克隆抗体为Santa Cruz产品，异硫氰 酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔抗体，购自北京中山生物技术有限公司清霉素系福建 汇天生物药业有限公司产品，链霉素为大连美罗大药厂产品;其余试剂均为国产分 析纯。2 方法2.1 HLECs培养取出保存冻存细胞的冻存管立即放入37工水中，将溶解的细胞悬 液用10倍体积以上的培养液进行稀释，离心，除上清，反复洗涤3次。以 5x108cells/L接种于培养瓶中，37工、5%CO2培养箱培养。待细胞生长融合后 进行传代培养。2.2 E2溶液配制取E2粉末0.0136 g，溶于0.5 mL无水乙醇，待完全溶解后， 加无水乙醇至5 mL，配制成10 - 2mol/L的储存液，分装，-20工冻存备用，临 用前用灭菌后的三蒸水稀释成10 - 4mol/L的工作液。2.3 ISR溶液配制取ISR粉末0.0091 g，溶于0.5 mL无水乙醇，待完全溶解后， 加无水乙醇至5 mL，配制成10 - 2mol/L的储存液，分装，-20工冻存备用，临 用前用灭菌后的三蒸水稀释成10 - 4mol/L的工作液。2.4核分离液配制分别称取BSA 0.5 g , HEPES 0.59575 g，依次将其溶解于80 mL PBS（溶解时必须待一种试剂完全溶解后，再加入下一种试剂，直至所有试剂溶 解后混匀），加入0.6 mL NP-40,补加PBS至100 mL混匀，4工保存备用。2.5反应缓冲液配制称取BSA 2.5 g，将其溶解于180 mL PBS，加入0.125 mL Triton X -100,补加PBS至200 mL混匀，4C保存备用。2.6分组与给药对照组:HLECS+含10%NCS的DMEM培养液;H2O2组:对照组 +3x10 - 4mol/L H2O2;E2 组:H2O2 组 +10 - 8mol/L E2;ISR 组（高浓度）:H2O2 组 +10 - 5mol/L ISR;ISR 组（中浓度）:H2O2 组+10 - 6mol/L ISR;ISR 组（低浓 度）:H2O2 组+10 - 7mol/L ISR。各ISR组提前加药孵育1 h后，再加入H2O2，培养24 h后进行检测。2.7 FCM检测经H2O2处理的HLECs上雌激素受体a（estrogen receptor a, ERa）和P（ER的表达取对数期生长的细胞，常规消化，收集，细胞密度为（1- 2）x109cells/L, PBS洗涤1次，每组设7个平行样本（其中一个为阴性对照）;用- 20C预冷的100%甲醇-20C固定20 min;PBS洗涤2次，用4C预冷的核分离 液室温处理10 min，用反应缓冲液洗涤2遍;加入含有1%BSA及1%NCS的PBS 50 pL,混匀后室温中放置30 min;反应缓冲液洗涤2遍，分别加入1:100稀释 （稀释液为0.01 mol/L的磷酸钠缓冲液，pH7.6）的1抗（ERa抗体、ER0抗体）,4C 反应过夜（阴性对照组以PBS代替I抗，其它步骤同前，以便试机、调零），然后用 反应缓冲液洗涤2遍;加入1:50稀释（稀释液为0.01 mol/L的磷酸钠缓冲液，pH 7.6）的FITC标记的口抗，置冰上避光放置30 min;反应缓冲液洗涤2遍，加入1 mL PBS悬浮细胞，上机做流式细胞分析，检测ERa、ERp蛋白阳性率。3 统计学处理数据以均数士标准差()表示，采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，多组均数比 较用 One - way ANOVA 方法。结果1 FCM检测ISR对经H2O2处理的HLECs ERa表达的影响FCM检测结果显示(表1、图1):正常HLECs存在ERa的表达;H2O2组HLECs内ERa表达明显下降，与对照组比较有显著差异(Pv0.01);E2、ISR高、中、低浓度 组的HLECs内ERa表达明显升高，与H2O2组比较有显著差异(P 0.01)；且随 ISR浓度的增高HLECs内ERa表达逐渐升高，呈明显的浓度依赖关系。表1 FCM检测不同浓度ISR对经H2O2处理的HLECs ERa表达的影响Table1. The effect of different concentrations of ISR on expression of ERa inHLECs incubated with H2O2(.n=6) *P 0.01 vs control group;P 0.01 vs H2O2group.Group ERa(%)Control 33.552 2.147 H2O2 21.428 1.491* E2 31.470 1.536ISR(10 -5mol/L) 36.350 2.498ISR(10 -6mol/L) 31.402 1.940ISR(10 -7mol/L) 25.390 0.722Figure 1.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERa in H2O2 - treated HLECs examined by flow cytometry.图 1 FCM 检测不同浓 度ISR对经H2O2处理的HLECs ERa表达的影响2 FCM检测ISR对经H2O2处理的HLECs ER0表达的影响FCM检测结果显示(表2、图2):正常HLECs存在ER0的表达;H2O2组HLECs内 ERP表达明显下降，与对照组比较有显著差异(P 0.01)；E2、ISR高中低浓度组的 HLECs内ERP表达明显升高，与H2O2组比较有显著差异(P 0.01)；且随ISR浓 度的增高HLECs内ERP表达逐渐升高，呈明显的浓度依赖关系。表2 FCM检测不同浓度ISR对经H2O2处理的HLECs ER0表达的影响Table2. The effect of different concentrations of ISR on expression of ER0 ofHLECs incubated with H2O2(.n=6)*P v 0.01 vs control group;AP 0.01 vs H2O2group.Group ER0(%)Control 27.208 1.633 H2O2 15.702 0.613*E2 25.478 0.906ASR(10 -5mol/L) 29.950 4.526ISR(10 -6mol/L) 26.120 2.801AISR(10-7mol/L)18.025 0.540Figure 2.The effect of different concentrations of ISR on expression of ER0 in H2O2 - treated HLECs examined by flow cytometry 图 2 FCM 检测不同浓 度ISR对经H2O2处理的HLECs ER0表达的影响讨论 氧化损伤是诱发老年性白内障形成的一个重要因素，如各种原因和途径导致的晶状 体氧自由基产生过多或清除过少，均可引起HLECs和纤维组织的损伤而导致老年 性白内障的发生。ER是类固醇激素受体超大家族中的一员，人体内有2种雌激素受体，即ERa和 ERP。雌激素的生物效应主要是通过与ER结合而发挥作用4。已有相关研究 结果证实了 HLECs 上有 ER 的表达，并在亚细胞器上的定位进行了研究5-7 本研究结果表明:正常HLECs上存在ERa、p表达，与国内外学者的报道结果一致。 国外学者报道了氧化损伤能影响ERa、p的表达8。本研究表明:H2O2能下调 HLECs的ERa、p表达，提示由H2O2诱导的氧化损伤参与的老年性白内障可能 与H LECs的ERa、p下调有关。近年来有相关文献报道了 E2对氧化损伤的HLECs的保护作用:Wang等9的 研究结果表明了 E2对体外培养的HLECs氧化应激的保护效应:将HLECs暴露于 H2O2可引起细胞生存力、胞内ATP水平和线粒体膜电位三者呈剂量依赖性下降； 而用E2预处理的HLECs，前两者均呈剂量依赖性提高，此研究首次在HLECs中 证实雌激素具有抗氧化作用。Moor等10,11 研究发现E2在保护HLECs免 受氧化损伤中，稳定线粒体膜电位起了关键作用;在H2O2处理的HLECs中，E2 诱导ERK1/2磷酸化与稳定线粒体膜电位呈正相关，故可能在E2活化MAPK信 号通路与稳定线粒体膜电位来发挥17P- E2的抗氧化、细胞保护作用的能力之间 存在联系，这可能是E2抗氧化的机制之一。Flynn等12 进一步研究发现:在高 糖条件下培养的牛HLECs持续产生多羟化合物，多羟化合物的聚集促进线粒体膜 去极化，预先用E2处理HLECs可阻止线粒体膜电位的增加，对抗线粒体膜去极 化。Gottipati等13的研究表明，E2可快速活化HLECs线粒体相关的锰超氧 化物歧化酶(manganese superoxide dismutase , MnSOD)而不影响其 mRNA 和蛋白的表达，推测 MnSOD 可能在对抗线粒体氧化损伤过程中发挥了重要作用。 E2 通过受体发挥其生物学效用，在各种不同细胞上对 ER 的上调或下调作用14， 15 ISR是中药植物雌激素，已有报道ISR可使人乳腺癌T47D细胞的ERa mRNA表达显著增加，同时也可使ERP mRNA表达增加14。本研究表明:E2、 ISR能上调经H2O2处理的HLECs的ER表达，并呈明显的浓度依赖关系，提示 E2、ISR可能通过上调经H2O2处理HLECs的ER表达来发挥抗氧化损伤作用， 从而起到防治老年性白内障的作用。该结果将为开发防治老年性白内障的有效药物 提供科学的实验依据。参考文献1 Aina FO，Smeeth L，Hubbard R，et al.Hormone replacement therapy and cataract:a population-based casecontrol studyJ.Eye， 2006，20(2):417 -422.2 Dolatowska E.The evaluation of estradiol and FSH serum levels in menopausal women with primary cataractJ.Klin Oczna，2002，104(5 -6):357 -361.3 赵丕文，王大伟，牛建昭，等红花等10种中药的植物雌激素活性研究J. 中国中药杂志，2007，32(5):436-439.4 朱顺叶，余振华，陈红珊，等司坦唑醇激活ERa调节雌激素受抑的青春期 大鼠生长板软骨细胞的增殖和分化J.中国病理生理杂志，2009 , 25(6):1186-1191.5 Ogueta SB , Schwartz SD , Yamashita CK , et al.Estrogen receptor in the human eye:influence of gender and age on gene expressionJ.Invest Ophthalmol Vis Sci，1999，40(9):1906-1911.6 Cammarata PR，Chu S，Moor A，et al.Subcellular distribution of native estrogen receptor alpha and beta subtypes in cultured human lens epithelial cellsJ.Exp Eye Res，2004，78(4):861-871.7 Cammarata PR，Flynn J，Gottipati S，et al.Differential expression and comparative subcellular localization of estrogen receptor beta isoforms in virally transformed and normal cultured human lens epithelial cellsJ.Exp Eye Res，2005，81(2):165 -175.8 Tamir S，Izrael S，Vaya J.The effect of oxidative stress on ERa and ERp expression J.J Steroid Biochem MolBiol , 2002 , 81(4 - 5):327 - 332.9 Wang X，Simpkins JW，Dykens JA，et al.Oxidative damage to human lens epithelial cells in culture:estrogen protection of mitochondrial potential，ATP，and cell viabilityJ.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003， 44(5):2067 -2075.10 Moor AN，Flynn JM，Gottipati S.17p -estradiol stimulates MAPK signaling pathway in human lens epithelial cell cultures preventing collapse of mitochondrial membrane potential during acute oxidative stress J .Mitochondrion ， 2005 ， 5(4):235 - 247.11 Moor AN，Gottipati S，Mallet RT，et al.A putative mitochondrial mechanism for antioxidative cytoprotection by 17 beta estradiol J.Exp Eye Res，2004，78(5):933 944.12 Flynn JM，Cammarata PR.Estradiol attenuates mitochondrial depolarization in polyolstressed lens epithelial cellsJ.Mol Vis，2006， 12(4):271 282.13 Gottipati S，Cammarata PR.Mitochondrial superoxide dismutase activation with 17 betaestradioltreated human lens epithetlial cells J.Mol Vis，2008，14(5):898 905.14 赵丕文，牛建昭，王继峰，等异补骨脂素和蜕皮甾酮对人乳腺癌T47D细 胞增殖及ER亚型表达的影响J.北京中医药大学学报，2007 , 30(4):242 - 245.15 Nagira K , Sasaoka T , Wada T , et al.Altered subcellular distribution of estrogen receptor is implicated in estradiol-induced dual regulation of insulin signaling in 3T3-L1 adipocytesJ.Endocrinology，2006， 147(2):1020 -1028.