发酵工程在现代生物技术中的应用

发酵工程在现代 生物技术中的应用 生物技术：应用自然学和工程学 的原理，依靠生物作用剂的作用 将生物物料进行加工以提供产品 和为社会服务的技术。 20世纪 70年代以后，以 DNA重组技 术的建立为标志，形成了一个以 基因工程为主导，发酵工程为中 心，包括细胞工程和酶工程的现 代生物技术体系。 第一节 基因工程菌发酵 一、基因工程技术 通过对核酸分子的插入、拼 接和重组而实现遗传物质的重新 组合，借助载体将重组的目的基 因转移新的宿主细胞体系，并使 目的基因在新的宿主体系细胞中 进行复制扩增和表达所需的目的 产物。 基因工程菌的制备 一、目的基因的制备 1.鸟枪法 选用合适的内切酶，在 Mg2+的激活 下，切开供体 DNA链获得目的基因，根据 酶切末端特点分为 a、 b两类。 基因工程菌的制备 2.cDNA法 又称反转录法，从细胞内提取目的 基因的 mRNA，在反转录酶的作用下，以 mRNA反转录互补的 cDNA。 3.人工合成 在电脑控制下通过合成仪合成获得 的 DNA片段。 二、载体的准备 目前常用的基因克隆载体： 1.质粒：严密性质粒和松弛型质粒 2.pBR322和 pUC：去除原有质粒的非 必须功能，引入选择标记和在适宜的位 臵设臵限制酶单一切点。 3.噬菌体载体 有 噬菌体和 M13噬菌体 三、基因与载体的连接 外源 DNA与载体 DNA之间连接方式： 1.粘性末端连接 先用一种酶切割外源 DNA并将拟插入 的那个片段用凝胶电泳分离出来，再用 同一种酶去切载体 DNA，这样可以通过粘 性末端连接起来。 2.平末端连接 3.在 DNA片段末端加上均聚寡核苷酸 后连接：末端核苷酸转移酶能催化 DNA末 端的 3 -OH上添加单核苷酸的反应，形成 寡聚核苷酸连，如果在一个 DNA片段的 3 -OH末端上添加寡聚 T，那么另一 DNA片 段的 3 -OH 末端上一定添加与 T互补的 寡聚 A。 四、目的基因导入受体细胞 取决于是否用合适的受体细胞、合适 的克隆载体和合适的基因转移方法 2、干热灭菌法 进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化， 微生物体内 蛋白质变性 和 电解质浓缩 引起 中毒等作用，其中氧化作用导致微生物死 亡是主要依据。由于微生物对干热的耐受 力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温 度要高，时间要长，一般 160 170 ， 1 1.5h。 实际应用时，对一些要求保持干燥的实验 器具和材料可以采用干热灭菌法。 湿热灭菌法 利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。 其原理是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞 中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特 别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微 生物死亡。 由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热灭菌对耐热 芽孢杆菌来说，温度升高 10 时，灭菌速度常 数可增加 8 10倍，对营养细胞更高。 蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠，是 目前最为常用的灭菌方法。一般的湿热灭菌条 件为 121 ， 30 min。 湿热灭菌法 煮沸灭菌法 将要消毒的物品放入水中煮沸 （ 100 ） 15 20min，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但 不能杀死芽孢。 巴氏消毒法 法国微生物学家、化学家巴斯德首创的低温消 毒法。加热到 62 ，经过 30分钟，以杀死不耐高 温的物质中的微生物和病原体的消毒法。 牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。 湿热灭菌法 间歇灭菌法 反复几次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微 生物营养体和芽孢的目的。 操作步骤： 100 ， 30-60min； 37 ， 1h； 同上重复三次 适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶 牛奶培养基。 方法简单，但却麻烦；工作周期长。 湿热灭菌法 高压蒸汽灭菌法 使用密闭的高压蒸汽灭菌锅，使灭菌锅 内蒸汽不外溢，增加压力，由于压力的增 高，温度也随之增高，从而提高杀菌力， 缩短灭菌时间。 最有效而广泛应用的灭菌方法 实验室常用的是 0.1MPa， 121 ， 15 30min 应用范围 培养基，水，发酵罐等其他不适 合干热灭菌的物品。 高压蒸汽灭菌法的注意事项： 1. 完全排除锅内冷空气 2. 灭菌完毕后要缓慢减压 3. 压力降为零后打开盖子 二、辐射灭菌法 利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物 以 紫外线 最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能 起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗 力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和 无菌室、培养间等空间的灭菌，且距照射物不超 过 1.2 m；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液 体物料的灭菌。 三、化学药品灭菌法 某些化学药品与微生物发生反应（蛋白变性、 酶失活、细胞通透性）而具有杀菌的作用。 化学药剂适于生产车间环境的灭菌，接种操 作前小型器具的灭菌等，不适用于培养基。 化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的 不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸 等。 高锰酸钾 高锰酸钾溶液的灭菌作用是使蛋白质、氨 基酸氧化，使微生物死亡，一般用 0.1 0.25的溶液。 漂白粉 漂白粉的化学名称是次氯酸盐 (次氯酸钠， NaOCl)，它是强氧化剂，也是廉价易得的灭菌 剂。它的杀菌作用是次氯酸钠分解为次亚氯酸， 后者不稳定，在水溶液中分解为新生态氧和氯， 使细菌受强烈氧化作用而导致死亡，对杀死细 菌和噬菌体均有效。 75酒精溶液 75酒精溶液的杀菌作用在于使细胞脱水， 引起蛋白质凝固变性。对营养细胞、病毒、霉 菌孢子均有杀死作用，但对细菌的芽孢杀死作 用较差。常用于皮肤和器具表面杀菌。 新洁尔灭 新洁尔灭是表面活性剂类洁净消毒剂。它在 水溶液中以阳离子形式与菌体表面结合，引起 菌体外膜损伤和蛋白变性。 10 min能杀死营养 细胞，但对细菌芽孢几乎没有杀灭作用。一般 用于器具和生产环境的消毒，不能与合成洗涤 剂合用，不能接触铝制品。 甲醛 甲醛 (HCHO)是强还原剂，它能与蛋白质的 氨基结合，使蛋白质变性，对氨基和蛋白质的 变性有较强活性，这是用甲醛作为灭菌剂的根 据。使用时可以以 2份 37甲醛溶液与 1份 KMnO4混合，或者将 37甲醛溶液直接加热， 产生气态甲醛用于灭菌。甲醛灭菌的缺点是穿 透力差。 过氧乙酸 过氧乙酸是强氧化剂，它是广谱、高效、 速效的化学杀菌剂，对营养细胞、细菌芽孢、 真菌孢子和病毒都有杀灭作用。 戊二醛 在酸性条件下，不具有杀死芽孢的能力， 只有在碱性条件下，才具有杀死芽孢的能力， 常用 2的溶液，常用于器具、仪器和工具等 灭菌。 酚类 苯酚毒性较大，易污染环境，且水溶性差， 使应用受到限制，而酚类衍生物的使用，扩 大了作为消毒剂的使用范围。 四、臭氧灭菌 利用臭氧的氧化作用杀死微生物细胞。 氧化分解葡萄糖所必需的酶，从而直接 破坏其细胞膜，从而将细菌杀死。 无污染消毒剂 对细菌、霉菌等杀菌效果好 安全，杀菌效果明显，安装灵活等特点 用于洁净室、净化设备的消毒。 五、过滤除菌法 利用过滤方法阻留微生物，也可达到除菌的目 的，这就是过滤除菌法。 此法仅适用于澄清液体和气体的除菌。工业上 常用过滤法大量制备无菌空气，供好氧微生物 培养过程使用。 表 3 - 6 各种灭菌方法的特点及适用范围 灭菌方法 原理及条件 特点 适用范围 火焰灭菌法 利用火焰直接把微生 物杀死。 方法简单、灭菌彻底、 但适用范围有限。 适用于接种针、玻璃 棒、试管口、三角瓶 口等灭菌 干热灭菌法 利用热空气将微生物 体内的蛋白质氧化进 行灭菌 灭菌后物料可保持干 燥，方法简单，但灭 菌效果不如湿热灭菌 适用于金属或玻璃器 皿的灭菌。 湿热灭菌法 利用高温蒸汽将物料 的温度升高使微生物 体内的蛋白质变性进 行灭菌 蒸汽来源容易、潜热 大、穿透力强、灭菌 效果好、操作费用低、 有经济快速的特点 广泛应用于生产设备 及培养基的灭菌。 射线灭菌法 用射线穿透微生物细 胞进行灭菌 使用方便，但穿透能 力较差，适用范围有 限 一般只适用于无菌 室，无菌箱摇瓶间和 器皿表面的消毒 化学式剂灭菌法 利用化学试剂对微生 物的氧化作用或损伤 细胞等进 行灭菌 使用方法较广，可用 于无法用加热方法进 行灭菌的物品 常用于环境空气的灭 菌及一些表面的灭菌 过滤除菌法 利用过滤介质将微生 物菌体细胞过滤进行 除菌 不改变物性而达到灭 菌目的，设备要求高 常用于生产中空气的 净化除菌，少数用于 容易被热破坏的培养 基的灭菌 第二节 培养基和发酵设备的湿热灭菌 一、灭菌条件的选择 选择的原则：达到灭菌的目的，同时 使培养基成分破坏减至最小。 1、 灭菌温度和灭菌时间的选择 为什么选择 高温快速 灭菌？ 温度升高，反应速率升高， 微生物死亡速 率远大于营养成分的的破坏速率 灭菌程度与灭菌时间的影响 微生物的热死规律 对数残留定律 灭菌程度与灭菌时间的 影响 微生物的热死规律 对数 残留定律 微生物受热死亡的主要原因是高 热能使蛋白质变性，这种反应可 认为是单分子反应，死亡速率可 视为一级反应，即与残存的微生 物数量成正比。 Kt eNN ttNN KN dt dN 0 00 , 积分得： 初始条件： 式中 N经时间 t后残存的活菌浓度（个 /L)， N0 开始灭菌时原有活菌浓度（个 /L)； t灭菌时间（ s,min） K灭菌速率常数或比死亡速率常数（ s-1,min-1） 它的大小与微生物的 种类 和加热 温度 有关。在同等 温度下，其值小，微生物的耐热性强。 从上式得出： t, N之间的关系为对数 式中 N/N0菌体存活率，而 N0/N为灭菌度。 t=（ 2.303/K） (N0/ N) 影响培养基灭菌的因素 培养基成分 油脂、糖类；低质量分数 (1 2 )的 NaCl溶液 pH值 pH值 6.0 8.0，微生物最耐热； pH6.0， 氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的 生理反应促使其死亡 培养基中的颗粒 泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使传热困 难，热难穿透过去杀灭微生物 二、培养基的灭菌方法 （ 1）分批灭菌 分批灭菌是在每批培养基全部流入发酵罐后， 就在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定 时间，再冷却到接种温度。实罐灭菌时，发酵 罐与培养基一起灭菌。 不需要附属设备，操作简便，常用的灭菌方法 加热和冷却时间较长，营养随时间降低，罐利 用率低；不能采用高温快速灭菌工艺。 发酵罐溶积越大，加热冷却时间越长 T总 =t1+t2+t3 式中 t1、 t2、 t3分别为加热、维持、冷却所需要的 时间 其他灭菌设备一般采用蒸汽灭菌，如设备十分 耐压，则可采用较高的温度，但必须注意设备 内部的凹处及露出的小配管等蒸汽不能到达的 部位。 （ 2）连续灭菌 连续灭菌也叫连消，是指培养基在发酵罐外经 过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入 已灭菌的发酵罐内的灭菌工艺流程。 其 温度一般以 126 132 为宜，总蒸汽压力要 求达到 0.044 0.049MPa以上。 优点 营养成分破坏少；发酵罐非生产占用时间短， 溶积利用率提高；蒸汽负荷均衡，锅炉利用率 高，操作方便；适用于自动化控制，降低劳动 强度。 缺点 不适用于黏度大或固形物含量高的培 养基的灭菌；增加了一套连续灭菌设备， 增加了操作环节，增加了染菌的概率。 按设备和工艺条件分 （ 1）蒸汽直接加热 （ 2）蒸汽间接加热 1、蒸汽直接加热连续灭菌系统 定义： 蒸汽通入培养基中， 快速加热至杀菌 温度，维持一段时间，后冷却至发酵温度的过 程。分两种形式： （ 1）由连消塔、维持罐和冷却器组成 配料罐将培养基预热 60-70 ，防止培养基在杀菌时 料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。 连消塔使培养基迅速 (20s)升温 (126-132 )。 维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。 2-7min. 冷却管：将培养基迅速冷却到 40-50 ，输送到灭菌 后的发酵罐内 连续灭菌流程 培养基配料 配料罐 加热器 维持罐 冷却器 无菌培养基 （ 2）喷射加热连续灭菌流程 由喷射加热、维持罐和真空冷却器组成的连续 灭菌系统。 蒸汽直接喷入待灭菌的培养液，培养液急剧升 温到预定的灭菌温度，培养基在该温度送入维 持管维持一段时间后，通过一膨胀阀进入真空 冷却器冷却。 保证培养基先进先出，避免过热或者灭菌不彻 底 升温快、营养损失小 随着蒸汽的冷凝使培养基稀释 2、蒸汽间接加热连续灭菌系统 蒸汽不直接与培养基接触，而是通过热交换器 对培养基进行加热。 热交换器有板式和螺旋板式两种 螺旋板式交换器的特点：流道宽，流速快，可 减少热交换器表面结垢现象。适用于含有固行 悬浮物的培养基的灭菌。 板式交换器的特点：适用于含有少量固行悬浮 物的培养基的灭菌。 温度随时间的变化 连续灭菌与分批灭菌的比较与选择 分批灭菌 优点： 1.不需附加设备 2.蒸汽利用率高 3.节约劳动力 缺点 1.培养基质量差 2.罐的利用率低 3.冷却水用量大 连续灭菌 优点： 1.采用高温快速灭菌法 2.可以把培养基按其性 质分开灭菌 3.有利于自动控制 4.节省冷却水 缺点 1.投资费用高 2.对物料要求高 3.蒸汽用量大 三、发酵设备灭菌 实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌 连续灭菌时，发酵罐、种子罐等要先进行空罐 灭菌。 0.147-0.180MPa，维持 45-60min。 空消后不能立即冷却，先保压，待培养基进入 后，再开冷却系统。 附属设备：空气过滤器、补料系统和消泡剂系 统等。 各个管路在灭菌前，要严格检查，以防泄露和 “死角”的存在。