发酵工程-第二讲

第八章 发酵工程 第八章 发酵工程 -第二讲 第一节：发酵工艺 第二节：下游加工过程 第三节：生化反应器 第一节：发酵工艺 1、种子扩大培养 2、发酵方式 3、发酵过程控制 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休 眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇 瓶及种子罐逐渐扩大培养而获得一定是数量和质量的纯种 的过程。 1、种子扩大培养 1、种子扩大培养 作为种子的准则是： 菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长， 迟缓期短； 生理性状稳定； 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； 无杂菌污染； 保持稳定生产能力。 种子制备的工艺流程如下： 砂土（冷冻干燥管）管孢子 斜面 摇瓶液体（菌丝体） 或茄型瓶斜面或固体 种子罐 发酵罐 . 1、种子扩大培养 2、发酵方式 微生物发酵可以分为： 分批 补料 分批 半连续 连续 又称间歇式发酵罐，是一种准封闭式系统，种子接种到培 养基后除了气体流通外发酵液始终留在生物反应器内。 分批发酵 分批发酵过程可细分为 6期 : 停滞期： ：加速期： ：对数期： ：减速期： ：静止期： ：死亡期： 分批发酵 分批发酵应根据产物的不同，掌握不同的工艺重点。 细胞本身 : 应采用能维持最高生长产量的培养条件； 初级代谢产物 : 延长与产物生产相关联的对数生长期； 次级代谢产物 : 可缩短对数生长期，延长生产期，或降低 对数期的生长速率，从而使次级代谢产物更早形成。 优点 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程 和产品质量容易掌握 缺点 产率低 分批发酵 在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不 足而导致的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以 发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在 工厂的实际生产中采用这种方法很多。 补料 分批发酵 优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓度， 避免快速利用碳源的阻遏效应；减缓代谢有害物的 不利影响；可以通过补料控制达到最佳的生长和产 物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速 率，稳定最佳生产工艺。 缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导 致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了 染菌机会 补料 分批发酵 半连续发酵 在补料 分批发酵的基础上，间歇放出部分发酵液送到 产物提纯工段，被称为半连续发酵。 由于有害代谢产物的不断积累，产物合成最终难免受到 阻遏。放掉部分发酵液再补加适当料液不仅补充养分和 前体，而且代谢有害产物被稀释，从而有利于产物继续 合成。 半连续发酵也有她的不足： 放掉发酵液的同时也丢失了未利用养分和处于生产旺盛期的 菌体； 定期补充和放出使发酵液稀释，送去提炼的发酵液体积更大。 发酵罐被稀释后可能产生更多的代谢有害物，最终限制发酵 的产物合成； 一些经代谢产生的前体可能丢失； 有利于非生产菌突变株的生长。 半连续发酵 连续发酵 连续培养是在发酵过程中，一边流加新鲜的料液，一般以相 同的流速放料，维持发酵液原来的体积。在稳定条件下可通 过补料速率来控制比生长速率不变。流入罐内的料液使得基 质浓度上升、菌体浓度变稀，细胞生长将导致菌体浓度变浓、 基质浓度下降。连续发酵达到稳态时，放出发酵液中的细胞 量等于生成细胞量。 多级连续培养可以在每个罐中控制不同的反应条件，以满足 微生物各个阶段生长的不同要求。培养液中的营养成分也能 较充分地利用。最后流出的发酵液中，细胞和产物的浓度较 高。 连续发酵 有效延长对初期到稳定期的阶段的持续时间，使微生物的 生长速率、代谢活动始终处于恒定状态，发酵产量高、质 量稳定，从而提高发酵设备利用率。这主要是因为连续培 养持续的时间长，发生杂菌污染的机会多，菌种不稳定的 话，长期连续培养会引起菌种退化 。 连续发酵 3、发酵过程控制 发酵过程控制：除了满足生产菌种的营养需要之外，还要为 生产菌创造一个最适宜的环境，使人们所需要的代谢活动得 以最充分的表达。 温度：各种酶催化反应中，温度是保证酶活性的重要条件。 温度对细胞的酶结果与组成有较大的影响，它关系到代谢 途径和代谢产物的生物合成。最适合于菌体生长的温度未 必最适合于微生物的生物合成；反之亦然，要特别注意发 酵过程中的菌体生长与代谢产物积累两个阶段的最适温度 的控制。 3、发酵过程控制 pH： pH环境影响微生物的正常生长、代谢途径和产物的 性质。微生物在其生命活动中，会改变外界环境的 pH。 在微生物的培养过程中，及时调节合适的 pH很有必要。 pH值过低时，可加 NaOH、 Na2CO3、氮源等等或提高 通气量； pH值过高时，加 H2SO4、 HCl、碳源等或降低 通气量。 3、发酵过程控制 通气与搅拌：通气程度对微生物生长繁殖影响很大。微生 物在发酵中能利用的氧必须溶解于培养基中的溶解氧（ DO）。 临界氧浓度： 不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。如酵母 在在 20度时的临界氧浓度为 0.0037纳摩尔 /L。 生物合成最适氧浓度： 指溶氧浓度对生物合成 的最适 宜范 围，低了固然不好，但过高未必有利，不仅造成浪费 ，甚 至可能改变代谢途径。 第二节：下游加工过程 1、发酵液的预处理、固液分离和细胞破碎 2、初步纯化 3、高度纯化 4、成品加工和发酵废液排放 第二节：下游加工过程 一般说来，下游加工过程可分为 4 个阶段： 培养液的预处理和固液分离； 初步纯化（提取）； 高度纯化（精制）； 成品加工。 第二节：下游加工过程 一般工艺过程 : 1、发酵液的预处理、固液分离和细胞破碎 在活性物质稳定性的范围内，通过酸化、加热、以降低发 酵液的粘度。另一种有效的方法是加入絮凝剂，使细胞或 溶解的大分子聚结成较大的颗粒。 固液分离： 细胞破碎的方法有机械法、生物法、和化学法等。大规模生 产中常用高压匀浆器和球磨机。前者主要利用液相剪切力和 与固定表面撞击所产生的应力，后者主要依靠研磨，两者机 理不同，可以互为补充。 1、发酵液的预处理、固液分离和细胞破碎 细胞破碎： 2、初步纯化 经固液分离或细胞破碎及碎片分离后，活性物质存在于滤液 器中，滤液体积很大，浓度很低，下游加工过程就是浓缩和 纯化的过程，常需要好几步操作。其中第一步最为重要，称 为初步纯化或提取，主要目的在于浓缩，也有一些纯化作用， 而以后几步操作所处理的体积小，合称为高度纯化或精制。 吸附法：主要用于抗生素等小分子物质的提取，系利用 吸附剂与抗生素之间的分子引力而将抗生素吸附在吸附 剂上。 2、初步纯化 离子交换法：主要用于小分子的提取。离子交换法系利 用离子交换树脂和生物物质之间的化学亲和力，有选择 性地将生物物质吸附上去，然后以较少量的洗脱剂将它 洗下来。 2、初步纯化 沉淀法：广泛用于蛋白质的提取。它主要起浓缩作用， 而纯化的效果较差。本法又可分为下列 5种类型。 盐析：加入高浓度的盐使蛋白质沉淀。 加入有机溶剂：其机理为加入有机溶剂使溶液的介电 常数降低，从而使水分子的溶解能力降低。 调 pH至等电点：此法沉淀能力不强，常同时加入有机 溶剂，使沉淀完全。 加入非离子型聚合物：如 PEG，其机理与盐析作用相 似。 2、初步纯化 萃取法：萃取法是利用产品在互补相溶的二相溶剂中有 不同的溶解度来进行的 。 溶剂萃取法。由于蛋白质遇有机溶剂会引起变性，故 该法一般用于抗生素等小分子的生物物质的提取。 两水相萃取法。此法适用于蛋白质的提取，近年来也 开始研究用于小分子物质。由于聚合物分子的不相溶性， 两种聚合物的水溶液（含盐与不含盐）可以分成两相。 蛋白质分子可以在两相间进行分配。目前已成功应用在 酶的提取中。 超临界流体萃取。超临界流体的密度和液体相近，溶 质在其中的扩散速度可为液体的 1000倍，这是超临界 流体的萃取能力和萃取速度优于一般溶剂的原因。 逆胶束萃取。将水溶液与有机溶剂和表面活性剂混合， 并加以搅拌，如系统选择适当，则会形成逆胶束。表面 活性剂处在逆胶束表面，极性端指向胶束内部，而非极 性端指向胶束外面，形成含逆胶束的有机相与水相成平 衡。蛋白质就在这种有机相与水相之间进行分配。 2、初步纯化 膜过滤法：又分为超滤，微滤，反渗透和纳滤四种。超 滤法是利用一定截留分子量的超滤膜进行溶质的分离或浓 缩。微滤主要用于发酵液中除去菌体；反渗透主要用于小 分子的浓缩；纳滤也可用于小分子的浓缩。膜过滤的主要 缺点是浓差极化和膜的污染，膜的寿命较短和通量低，很 难用于处理量大的工业中。但这些缺点正在克服，有很好 的发展前景。 2、初步纯化 3、高度纯化 高度纯化（精制） 1 色谱分离：色谱分离是一种高效的分离技术，过去仅 用于实验室中，后来规模逐渐扩大而应用与工业上。操作 是在柱中进行的，包含两个相 固定相和流动相，物质 在两相间分配的情况不同，在柱中流动的速度也不同，而 获得分离。 2 结晶：结晶可以认为是沉淀的一种特殊情况。结晶 的先决条件是溶液要达到过饱和。要达到过饱和可用下列 方法： 加入某些物质，使溶液平衡发生改变，如调 pH； 将溶液冷却或将容易蒸发 发酵液经提取和精制后，还应视实际需要进行浓缩、干燥、 除菌等处理，以达到产品的应用要求。 4、成品加工和发酵废液排放 单元操作 分离机理 分离对象举例 膜分离 微滤 超滤 反渗透 透析 电渗析 渗透气 压力差、筛分 压力差、筛分 压力差、筛分 浓度差、筛分 电荷、筛分 汽液相平衡、筛分 菌体、细胞 蛋白质、多糖、抗生素 糖、氨基酸 盐、蛋白质 氨基酸、有机酸 乙醇 萃取 有机溶剂萃取 双水相 液膜萃取 反胶团萃取 超临界萃取 液液相平衡 液液相平衡 液液相平衡 液液相平衡 相平衡 有机酸、抗生素 蛋白质、抗生素 氨基酸、有机酸、抗生 素 氨基酸、蛋白质 香料、脂质 分离过程的机理与分离操作 单元操作 分离机理 分离对象举例 层析 凝胶过滤层析 反相层析 离子交换层析 亲和层析 疏水相互作用 层析聚焦 浓度差、筛分 分配平衡 电荷、浓度差 生物亲和作用 疏水作用 电荷、浓度差 脱盐、分子分级 甾醇、维生素、肽 蛋白质、氨基酸、抗 生素、核酸、有机酸 蛋白质、核酸 蛋白质 蛋白质 电泳 凝胶电泳 等电点电泳 等速电泳 区带电泳 筛分、电荷 筛分、电荷、浓度差 筛分、电荷、浓度差 筛分、电荷、浓度差 蛋白质、核酸 蛋白质、氨基酸 蛋白质、氨基酸 蛋白质、核酸 离心 离心过滤 离心沉降 超离心 离心力、筛分 离心力 离心力 菌体、菌体碎片 菌体、细胞 蛋白质、核酸、糖类 第三节：生化反应器 1、生化反应器的类型 2、机械搅拌式生化反应器 3、自吸式充气发酵罐 4、塔式罐 5、发酵与生产分离耦联 1、生化反应器的类型 生化反应器习惯上被分成酶反应器和发酵罐，但本质上都属 于酶反应器。按生化反应器的运行方式，可以分为间歇式 （又称分批式）反应器和连续式反应器两大类。 生化反应器可分为均相反应器和非均相反应器。均相反应器 是反应只在一个相内进行，非均相反应器是反应物不在同一 相中。 2、机械搅拌式生化反应器 机械搅拌式生化反应器内设搅拌装置， 借搅拌涡轮输入混合以及相际传质所 需要的功率。它还利用机械搅拌器的 作用，使得经过过滤除菌的无菌空气 与发酵液充分混合，促进氧的溶解。 是最传统、至今适用最广泛的生物反 应器。 优点： 不用空气压缩机或鼓风机，节省投资； 在所有机械搅拌通气发酵罐形式中，自吸式充气发酵罐的 充气质量最好，通入发酵液中的每立方米空气可形成 2315 平方米的气液接触面面积。 动力消耗低，据报道以糖蜜为基质培养酵母时，自吸式充 气发酵罐生产 1kg干酵母的电耗动力消耗为 0.5kwh。 3、自吸式充气发酵罐 由充气搅拌叶轮或循环泵来完成对发酵液的搅拌，并且在 搅拌过程中自动吸入空气。 缺点： 由于空气靠负压吸入罐内，所以要求使用低阻力、高除菌 效率的空气净化系统； 由于结构上的特点，大型自吸式充气发酵罐的搅拌充气叶 轮的线速度在 30m/s左右，在叶轮周围形成强烈的剪切区 域，据研究各种微生物中以酵母和杆菌耐受剪切应力的能 力最强，因此应用于酵母生产时自吸式充气罐能发挥其优 势。 3、自吸式充气发酵罐 3、自吸式充气发酵罐 鼓泡式反应器搅拌主要依赖于引入的 空气或其他气体。它是通过薄壳圆柱形 容器的底部鼓入空气提供混合传质所需 功率。 但容积增大后，液体深度增大，气泡在 上升过程中重新聚合成大气泡，导致传 质速率下降，动力效率跌落。 3、自吸式充气发酵罐 气升环流式生化反应器： 它内设内置或外置的循环管 道，在中央拉力管中用压缩 空气射流，由于引入气体的 运动，诱导液体自动拉力管 内上升，然后自拉力管外的 环隙下降，形成环流。从而 导致反应器内培养液进行混 合，并保持循环流动。对于 低粘度、牛顿型流体，如细 菌、酵母菌的澄清基质发酵 液，有可能获得较好的效果。 4、塔式罐 它的特点是罐身高，高径比较大，可是为气升环流式生化 反应器的延伸。它也无搅拌传动装置，通过微生物代谢产 生的 CO2等气体造成罐内上下培养液的密度差来进行液体 的上下对流循环。塔式罐中空气利用率高，节省空气和动 力，不用电机搅拌，设备简单；但底部有存在沉淀的现象， 降温较难。它多用于啤酒发酵。 5、发酵与生产分离耦联 传统的生物反应中，由于多种原因大多采用批式反应方式， 花费大量的时间、人力、物理和财力培养的细胞或制备的酶 往往仅使用一次，在其生产能力唯有明显随时的情况下废弃 是一种巨大的浪费。 在发酵和细胞培养过程中，细胞生长和产物的生产过程同时 进行，底物大量消耗，造成转化率和产物浓度较低，使产物 的回收和纯化困难，能耗高。 产物形成的生物反应过程中，产物达到一定浓度后往往发生 产物抑制作用，使细胞生长和生物反应过程受阻，使生物反 应产生抑制作用，或改变反应环境条件，使细胞生长和生物 反应速度降低或停止，甚至发生其他副反应。 5、发酵与生产分离耦联 5、发酵与生产分离耦联 生物反应器与分离设备偶联的方式通常有两种： 一是将生物反应器与分离设备融合为一体，称为原位偶联 或一体化偶联； 二是生化反应器与分离设备简单连接，称为异位偶联或循 环偶联。 5、发酵与生产分离耦联 原位偶联，在设备上是指将生化反应器与分离设备融为一体 而设计的，兼有进行生物反应和产物分离功能的设备，如膜 生物反应器，其设备结构比较特殊。在技术上是指分离介质 加到发酵液中，于同一设备内进行发酵和产物分离，如萃取 发酵、吸附发酵、膜分离发酵等。在这样的系统中，由于分 离介质直接与发酵液接触，发酵产生的产物或副产物可快速 而有效地从细胞周围移走，因而对于那些对产物或副产物的 抑制敏感的发酵更有效。 5、发酵与生产分离耦联 异位偶联是指发酵和产物分离分别在发酵和分离设备内进行， 设备间通过管道相连接、产物分离后的物料再返回发酵设备 内，如此循环反复进行。