丹酚酸B对内皮细胞氧化损伤的保护作用及机制研究

丹酚酸B对内皮细胞氧化损伤的保护作用及机制研究 目的：研究丹酚酸B对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化损伤的保护作用,并探讨其对HUVECs CD54表达和中性粒细胞黏附率的影响。方法:以H2O2为损伤剂，观察丹酚酸B对HUVECs培养上清中LDH、NO、MDA含量的影响,并利用免疫组化方法和显微计数法观察该药对H2O2存在下CD54表达和中性粒细胞黏附率的影响。结果:丹酚酸B可剂量依赖性地减少H2O2所致内皮细胞LDH外漏和MDA生成,并提高NO释放,还能有效抑制H2O2存在下CD54表达和增加中性粒细胞黏附率。结论:丹酚酸B具有减轻H2O2所致内皮细胞的氧化性损伤，降低血管内皮细胞表面细胞黏附分子表达和抑制中性粒细胞黏附的作用，这一作用可能是丹酚酸B抗心肌缺血/再灌注损伤的作用机制之一。丹酚酸B 内皮细胞 CD54 中性粒细胞丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎。丹参归心、肝经,药性微寒,味苦、无毒,具有祛瘀止痛、活血调经、养心除烦的功效。近年研究显示，丹参有广泛的生物活性，其治疗心血管系统疾病的作用尤其受到关注，并已有相关药物在临床使用14。目前已有研究表明,其水溶性有效成分为治疗心血管疾病的主要药效物质基础，而丹酚酸B是其中较为重要的成分之一。目前关于丹酚酸B的研究主要集中于心肌缺血/再灌注损伤和缺氧/复氧损伤，而关于丹酚酸B对内皮细胞氧化性损伤的研究尚未见报道。鉴于血管内皮细胞所处的特殊位置（血液与间质组织间的一层半透性的屏障）及其损伤对心肌缺血/再灌注损伤的重要影响，我们研究了丹酚酸B对血管内皮细胞氧化性损伤的影响，以期为更全面了解丹酚酸B的药理作用提供相关依据。1材料和方法1.1药品、试剂和仪器丹参注射液，生药1.5gml-1，正大青春宝药业有限公司，批号0405202。肝素钠注射液，常州生物千红制药有限公司，批号030212。RPMI 1640培养基，Gibco产品。新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批号041030。胰蛋白酶（1250），Amresco分装。3%双氧水，南京兴蓝箭科技公司，批号200309011。乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20050225。一氧化氮（NO）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20050112。丙二醛（MDA）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20050203。Rabbit Anti CD54(ICAM1)，0.1 ml(200 gml-1)，武汉博士德生物工程有限公司。即用型SABC免疫组化染色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。Percoll，100 ml(1.131 gml-1),北京夏斯生物有限公司，批号301944。Beckman冷冻台式离心机，美国Beckman公司。莱卡显微工作站，德国莱卡公司。精密移液器，吉尔森公司。Forma细胞培养箱，美国Forma公司。全自动高压灭菌锅，日本SANYO公司。超净工作台，苏州净化设备厂。24孔培养板，Costa公司。12药物对H2O2所致HUVECs氧化损伤的影响121HUVECs的培养及氧化损伤模型的建立5HUVECs按常规方法复苏后接种于40 ml培养瓶中，培养液为含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液，37、95% O2、5% CO2条件下培养，待细胞长满瓶底后，加入0.25%胰蛋白酶37 消化23 min，用新生牛血清终止消化。将细胞悬液移入离心管，1 000 rmin-1离心10 min，弃去上清液，用新鲜的RPMI 1640培养液重新悬浮细胞，将细胞浓度调整为1108 L-1的细胞悬液，同样条件下继续培养，待细胞长满单层融合后，弃去上清，以含0.5%血清的培养液培养24 h，使其同步化生长，即可用于试验。接种于24孔板的HUVECs同步化生长后，加入含有终浓度为200 molL-1 H2O2的无血清的RPMI 1640培养液，作用24 h。122实验分组（1)正常对照组：无血清的RPMI 1640培养液；（2）模型组：无血清的RPMI 1640培养液加200 molL-1H2O2作用24 h；（3）丹参注射液组：加入含有丹参注射液终质量浓度为3.0 gL-1的培养液预孵1 h，然后换成含有200 molL-1 H2O2的培养液作用24 h；（4）丹酚酸B低剂量组：加入含有丹酚酸B终质量浓度为110-6 gL-1的培养液预孵1 h，然后换成含有200 molL-1 H2O2的培养液作用24 h；（5）丹酚酸B中剂量组：加入含有丹酚酸B终质量浓度为110-5 gL-1的培养液预孵1 h，然后换成含有200 molL-1H2O2的培养液作用24 h；（6）丹酚酸B高剂量组：加入含有丹酚酸B终质量浓度为110-4gL-1的培养液预孵1 h，然后换成含有200 molL-1 H2O2的培养液作用24 h。123细胞形态学观察及生化指标测定各组HUVECs经H2O2处理24 h后，于相差倒置显微镜下观察其形态学变化，并检测培养液中LDH、NO、MDA含量。13HUVECs CD54表达的测定方法将HUVECs按110-4ml-1的密度接种于预先铺有玻片（5 mm5 mm）直径为35 mm的培养皿中，每个培养皿中4块玻片。37、95% O2、5% CO2条件下培养，待细胞长至80%融合后吸去上清，以含0.5%血清的培养液培养24 h，使其同步化生长，即可用于实验。将长满细胞的涂片从培养皿中取出，置于冰丙酮（100%）中固定10 min，晾干。将固定好的玻片用502胶固定于载玻片上，放入4冰箱中备用。取出4冰箱中的载玻片，用PBS润洗1 min，晾干。30% H2O21份+纯甲醇50份混合，将载玻片置于其中浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水润洗3次，晾干。滴加5% BSA封闭液，室温20 min，甩去多余液体。滴加Rabbit Anti CD54抗体，稀释度为1100，4过夜,PBS润洗3次，每次2 min。滴加生物素化山羊抗兔IgG，湿盒中37 20 min，PBS润洗3次，每次2 min。加试剂SABC，37 20 min，PBS润洗4次，每次5 min。使用DAB试剂盒显色，取1 ml蒸馏水加试剂A、B、C各1滴，混匀后加至载玻片，室温显色，镜下控制反应时间530 min，蒸馏水洗涤；苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。免疫组化染色阴性对照：用PBS代替Rabbit Anti CD54抗体4过夜，其余步骤同上。每张切片在统一放大倍数4040下，随机选取10个视野，计算平均单个视野CD54阳性细胞数。14HUVECs与嗜中性多形核白细胞（PMN）黏附率的测定PMN的分离6：按文献所述方法将分离所得的PMN用无血清的RPMI 1640混悬，调整细胞浓度为5108L-1，备用。将HUVECs接种于24孔板中，常规培养，待细胞80%融合后，换含0.5%血清的RPMI 1640，使之同步化生长。24 h后弃去培养液，按“1.2.1”的步骤进行氧化损伤处理。取处理后细胞用PBS洗涤2次，加入1 ml的PMN悬液（其中含有5105个PMN），于培养箱内继续培养，1 h后吸出上清，用1 ml PBS轻洗1次，将上清和PBS洗液合并，用细胞计数板计数未黏附的PMN数量。黏附率()=(5105-收集PMN数）/（5105）100。15统计学处理所得数据用 SPSS软件进行统计学处理，结果进行Studentst检验。