人源肝癌单链抗体（scFv）基因真核表达载体的构建和表达

人源肝癌单链抗体（scFv）基因真核表达载体的构建和表达 目的: 构建人源肝癌单链抗体（scFv）基因真核表达载体pSectag2/scFv并在中国仓鼠卵巢（CHO)细胞中获得表达。方法: 利用噬菌体细胞内重组技术筛选得到了肝癌特异性scFv, 用PCR技术及核酸内切酶技术将其克隆入真核表达载体pSectag2, 构建重组载体pSectag2/scFv, 测序鉴定后, 电转染CHO细胞, 利用SDSPAGE和Western blot检测目的蛋白的表达情况。结果: 将750 bp人源肝癌scFv插入真核表达载体pSectag2, 经DNA测序鉴定正确, 成功构建了pSectag2/scFv。将Sectag2/scFv转染CHO细胞后获得目的蛋白表达。SDSPAGE和Western blot检测表明目的蛋白Mr约为34 000。结论: 成功地构建抗scFv真核表达载体pSectag2/scFv, 并在CHO细胞中获得表达, 为人源肝癌scFv的进一步的应用研究提供依据。 毕业肝癌 单链抗体 CHO细胞 基因表达 毕业由于种种原因单克隆抗体(mAb)在进入临床中受到了很大的限制1。原因之一是因为动物源性抗体在人体应用时容易诱发HAMA, 产生不良反应2。近年来, 逐渐发展的抗体库技术为制备高亲和性的人源抗体提供了有力工具。该技术无需免疫即可制备全人源性抗体, 可有效避HAMA3。噬菌体抗体将表型与其基因型之间精确联结, 单链抗体（scFv）可以在预先并不知道细胞表面受体特征的情况下与肿瘤细胞特异性结合而获得, scFv蛋白具有分子小、 穿透力强等优点4。本实验室曾利用噬菌体抗体库技术, 构建了全人源肝癌scFv噬菌体库, 并筛选到了1株肝癌特异性scFv5,实现scFv的功能性表达, 进一步鉴定scFv蛋白的功能。我们利用筛选到的基因进行蛋白的真核表达。 毕业1材料和方法 毕业 1.1材料毕业人源肝癌scFv由第四军医大学西京医院肝胆外科实验室提取获得并保存; 质粒pSectag2/Hygro B、E.coli感受态菌株DH5和CHO细胞株由第四军医大学生化教研室馈赠; 连接酶及限制性核酸内切酶Hind 、Not均购自TaKaRa公司; 胶回收试剂盒为美国Promega公司产品; 质粒DNA提取试剂盒购自博大泰克公司; HiTrapNiNTA鳌合层析介质为美国Invitrogen公司产品; 6His mAb、HRP羊抗鼠IgG购自大连宝生物公司; DMEM培养基、标准胎牛血清为美国Gibco公司产品; Eppendorf电转染电融合仪4308为德国Eppendorf公司产品。 毕业 1.2方法 毕业 1.2.1真核表达载体的构建毕业设计扩增scFv基因的引物,上游引物5CGAAGCTTTCCTCTGAGCTGACTCAGGACCCCTC3, 含有Hind 酶切位点, 下游引物5ATATAGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCGT3, 含有Not 酶切位点, 引物由北京奥科公司合成。用设计的引物PCR扩增全长目的基因:PCR 反应条件设定为: 起始945 min变性; 然后94 30 s, 6530 s, 7230 s, 30 循环; 最后72延伸10 min。PCR 扩增产物经琼脂糖电泳后, 凝胶纯化试剂盒纯化回收(具体参见Promega小提试剂盒说明书)。将回收的PCR产物与载体pSectag2用Hind 、Not 酶行双酶切, 酶切产物琼脂糖电泳后试剂盒回收, 回收产物经T4连接酶16连接过夜, 将目的基因克隆入载体pSectag2中。将构建的载体转化感受态大肠杆菌DH5, 以AMP筛选出阳性克隆,经PCR和Hind 、Not 酶切分析鉴定后送北京奥科生物公司进行序列测定, 测序正确的重组载体命名为pSectag2/scFv。 毕业1.2.2pSectag2/scFv扩增提取毕业将重组载体pSectag2/scFv菌液扩增, 37、200 r/min振荡培养12 h获得成熟菌液50mL, 根据博大泰克中提试剂盒提取重组载体,参见博大泰克中提试剂盒说明书进行。 毕业1.2.3pSectag2/scFv电转染CHO细胞毕业提取的重组载体pSectag2/scFv经分光光度计检测定量后, 利用电转染仪转染CHO细胞。将处于对数生长期的CHO细胞用胰蛋白酶消化后取4106细胞、电压600 V、穿孔时间400 s, 具体操作步骤参见Eppendorf电转染点融和仪4308说明书, 转染后以10倍培养液稀释细胞, 转至培养皿内, 培养24 h换新培养液, 收集培养上清, 70保存备用。 毕业1.2.4目的蛋白的纯化和鉴定毕业收集72 h转染后CHO细胞的培养上清, 上清过0.45 m滤膜, 用Ni2+NTA鳌合层析介质室温结合1 h, 用洗涤缓冲液洗涤5次后, 用含200 mmol/L的咪唑洗脱液洗脱获得纯化蛋白。蛋白样品经行SDSPAGE分离后电转移至硝酸纤维素膜, 以5 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h, 依次加入鼠抗 6His mAb（11 000稀释, 4过夜）、 HRP标记的山羊抗鼠IgG（15 000稀释, 室温1 h）, 用化学发光试剂盒于暗室条件下X光片感光显影。 毕业