玉米和水稻叶绿体的分离及叶绿素含量的测定

玉米和水稻叶绿体的分离及叶绿素含量的测定摘要：利用高盐低pH值法对植物和植物进行叶绿体的分离与提取，经研磨-差 速离心-裂解-纯化，可获得完整的叶绿体，进而用丙酮溶解叶绿素，测定光密度值， 推算出总叶绿素含量。本方法快速简便、省去传统的蔗糖密度梯度离心和氯化铯 密度梯度离心等昂贵、耗时的步骤，对仪器的要求不高，成本低，适用于实验教 学和科研活动。关键词：叶绿体；叶绿素；分离；含量测定Abstract : Plant chloroplast were extracted by the high-salt and low pH method. after skiving, differential centrifugation, cracking and purification we got eligible chloroplast. dissolved the chlorophyl by acetone and calculate the total content of chlorophyl after the absorbency mensurated. The method is fast and simple, it elide some expensive, time-consuming steps such as traditional sucrose density gradient centrifugation and cesium chloride density gradient centrifugation, it suit for teaching and research.Key words : Chloroplast, Chlorophyl, Separate, Content mensurate1前言叶绿体是植物进行光合作用极为重要的细胞器，它具有独立复制的遗传物质。20世纪 初，人们根据植物叶片的花斑现象具有母性遗传的特征，推断在叶绿体上可能存在着核外 的遗传因子。直到20世纪60年代初，随着核酸检测与镜技术发展，叶绿体基因组的存在 才最后由Ris等人证实1。目前，cpDNA被广泛地用于细胞质遗传、植物雄性不育、植物 的系统发育、遗传多样性和亲缘关系等方面的研究。然而，叶绿素是在叶绿体中得到的 一种色素，它广泛存在于植物的叶和茎中的绿色色素，它与蛋白质结合在于叶绿体中，是 绿色植物进行光合作用所必需的催化剂。一般叶绿素是泛指叶绿素类的总称。叶绿素及其 衍生物可广泛用作食品的食用色素，还可用于化妆品的着色剂、脱臭剂等；在医药上可用 来治疗创伤、传染性肝炎、胃及十二指肠溃疡、慢性肾炎及急性胰腺炎，它还能增进造血 机能及促进放射线损害机体的康复，外科上用于治疗灼伤、痔疮及子宫疾患，并有降低胆 固醇、改善便秘等作用。由于叶绿体中的重要功能，所以一直是细胞生物学、遗传学和 分子生物学的重要研究对象。人们根据光合作用碳素，同化中CO2固定的最初光合产物日不同，把高等植物分成2 类:1）C3植物。这类植物的最初光合产物是3-磷酸甘油酸（三碳化合物），这种反应途径C3途 径,如水稻、小麦、棉花、大豆等大多数植物。2）C4植物。这类植物以草酰乙酸（四碳化 合物）等为光合最初产物，所以这种途径称为C4途径，如玉米、甘蔗、高粱等。一般来说，C4植物比C3植物具有较强的光合作用，其原因可从结构和生理两方面来探讨。结构和功能是有密切关系的，是统一的。C4植物叶片的维管束鞘薄壁细胞较大，其中 含有许多较大的叶绿体，叶绿体没有基粒或基粒发育不良；维管束鞘的外侧紧密连接一层 成环状或近于环状排列的叶肉细胞，组成花环状”结构。这种结构是C4植物的特征。叶肉 细胞内的叶绿体数目少，个体小，有基粒。C3植物的维管束鞘薄壁细胞较小，不含或很少 叶绿体，没有“花环型”结构，维管束鞘周围的叶肉细胞排列松散。C4植物通过磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶固定CO2的反应是在叶肉细胞的细胞质中进行的，生成的四碳羧酸转移到维 管束薄壁细胞中，放出二氧化碳，参与卡尔文循环，形成糖类，所以玉米、甘蔗等24植物 进行光合作用时，只有维管束鞘薄壁细胞内形成淀粉，在叶肉细胞中没有淀粉。而水稻等 C3植物由于仅有叶肉细胞含有叶绿体，整个光合过程都是在叶肉细胞内进行，淀粉只是积 累在叶肉细胞中，维管束鞘薄壁细胞不积存淀粉。在生理上，C4植物一般比C3植物具有较强的光合作用，这是与。4植物的磷酸烯醇式 丙酮酸（PEP）羧化酶活性较强及光呼吸很弱有关4。高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素（光合色素）吸收的。叶绿体色 素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。叶片叶绿素含量与光合作用密切相关， 是反映叶片生理状态的重要指标。在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需 要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。分离完整的叶绿体是进行叶绿体遗传研究的第一步。传统提取高等植物叶绿体的方法 有蔗糖密度梯度离心法、氯化铯密度梯度离心法和无水法等，但它们都有不足，或得率较 低，或纯度不高，而且都费时，不易操作。2材料与方法2.1植物材料玉米、水稻新鲜嫩叶。2.2实验仪器分析天平、高速离心机、离心管、纱布、剪刀、显微镜、TU-1800S紫外可见分光光 度计等。2.3试剂配制缓冲液A(pH=3.6)： 50mmol/L Tris, 25 mmo1/L EDTA, 1.25 mol/L NaC1, 0.25 mol/L 抗坏血酸。缓冲液B(pH=8.0)： 50mmol/L Tris, 25 mmol/L EDTA, 1.25 mol/LNaC1, 10 mmol/Lp 一巯基乙醇，0.1%牛血清白蛋白。缓冲液 C(pH=8.0): 150mmol/L NaC1, 100mmol/L EDTA.2.4操作步骤2.4.1完整叶绿体的分离(1) 玉米、水稻叶片各10g，洗净、擦干水分，4C避光放置过夜，液氮速冻后研磨成粉 末，加入100ml4C预冷的缓冲液A (50mmol/L Tris, 25mmo1/L EDTA, 1.25 mol/L NaC1, 0.25 mol/L抗坏血酸，pH3.6)，匀浆至糊状，6层纱布过滤至预冷的离心杯中。(2) 将滤液分装到45mL离心管中，4C下2500rpm离心6min,弃上清，用缓冲液A洗1次。(3) 沉淀中加60mL缓冲液B (50mmol/L Tris, 25mmol/L EDTA, 1.25 mol/L NaC1, 10mmol/Lp 一巯基乙醇，0.1%牛血清白蛋白，pH8.0)(其中10mmol/Lp 一巯基乙醇用前加 入)，用于摇动，使溶液充分悬浮沉淀，4C下2500rpm离心6min，弃上清，用缓冲液B洗1 次。(4) 用少量5mL缓冲液C (150mmol/L NaC1, 100mmol/L EDTA, pH8.0)悬浮沉淀，补 加C液25mL, 4C下2500rpm离心6min,此沉淀即为纯化的叶绿体，镜检观察。(5) 每个样本用5ml 80%丙酮溶解，4C下2500rpm离心6 min,取上清液测定吸光度(A663 和 A645)o2.4.2观察用显微镜观察沉淀物中叶绿体的形状、大小。2.4.3测叶绿素的含量用分光光度计测定波长在663nm及645nm处的吸光系数，即可计算叶绿素含量。叶绿素 含量(mg/ml) =(8.02.A663+20.2.A645)/5，每个样品重复测3次，再取它们的平均值。2.4.4比较用高盐低pH值法测定C3植物与C4植物中叶绿素的含量，并比较出哪一种植物利用此方 法分离叶绿体效果更佳。2.4.5流程图3结果与分析3.1叶绿体镜检观察差速离心获得纯化的叶绿体镜检为绿色橄榄形、近圆形，大小在2-7um左右，在高倍 镜下可看到叶绿体内含有较深的绿色小颗粒。在提取过程中，有大量的叶绿体残体被破坏， 但同时也有很多完整的叶绿体存在。图1细胞中完整的叶绿体3.2比较叶绿体的含量采用此方法测出叶绿素的含量。见表1表1c3植物与植物叶绿素含量的比较材料原料（g）A663umA645um得率(mg/ml)C3植物（水稻）100.4260.0150.7439C植物（玉米）4100.3520.3031.7887通过比较两种植物的叶绿素的得率，进一步证实了 C4植物的叶绿素含量比。3植物的叶 绿素含量高。3.3分析3.3.1材料的选择和准备选幼嫩叶片为试材，应选择颜色较深，叶绿体发育较好，叶绿体色素含量相对较高的 叶片，有利于提取出完整的叶绿体。选择好实验用的叶片后，将叶片洗净，去掉叶柄、叶 脉，最好风十数小时后再用，这样经过风干处理的叶片，提取制备液中水分要低一些，能 获得高浓度的叶绿体色素凶。3.3.2方法的确定高盐低pH值提取方法的设计是围绕叶绿素的得率和叶绿体的完整性来进行的，传统的 方法，大都昂贵耗时，得率也不理想，在很大程度上限制了对下一步工作的深入研究，在 本实验采用了此方法中，经液氮研磨和差速离心后，镜检观察到很多较完整的叶绿体，同 时也有很多破碎的叶绿体，证明效果良好。3.3.3试剂的探讨低pH值的匀浆缓冲液的加入，有软化细胞壁外硅质的作用，能降低叶绿体膜在匀浆过 程中造成损伤，保证叶绿体的完整性。另外还能更进一步弱化DNA，组蛋白，叶绿体膜之 间的相互作用凹。叶绿体分裂时，沉淀要充分悬浮后，再漫漫加入10mmol/L 3巯基乙醇，否则裂解不完 全，就会影响得率【10。4结论叶绿素是叶绿体内的一种色素，它广泛存在于植物的叶和茎中。它与蛋白质结合分布 在于叶绿体内，是绿色植物进行光合作用所必需的物质。一般叶绿素是泛指叶绿素类的总 称，包括叶绿素A和叶绿素B。在样品处理上，选用液氮研磨方法，没有选用传统的匀浆法。用液氮研磨方法比匀浆 细胞破碎的效果好，完整叶绿体的得率高。这样可以有效破坏组织、细胞结构，降低叶片 含水量，从而提高叶绿体中色素的提取效率。选幼嫩叶片，有利于提取出完整的叶绿体。 生长较老的叶片容易产生较多的粗纤维，不便于离心分离。结果表明，利用高盐低pH值法对C3植物和C4植物进行叶绿体的分离与提取是比较有效 的，经研磨-差速离心-裂解-纯化，可获得较完整的叶绿体。根据表1可以证实，C4植物的 叶绿素含量比C3植物的叶绿素含量高。在制备叶绿体的过程中，由于叶绿体的被膜比较脆 弱，分离叶绿体应在等渗的缓冲溶液中，0-4C温度下进行，叶绿体活力会随着离体时间延 长而不断下降，所以，分离工作尽可能在短时间内完成。参考文献1 刘大钧.细胞遗传学M.农业出版社,2004.2 刘良式.植物分子遗传学M.科学出版社，20033 蔡秋声.叶绿素及其衍生物的特性和生理功能J.粮食与油脂,1997,(3):38.4 潘瑞炽，王小菁,李娘辉.植物生理学M.高等教育出版社,2001,65-67.5 范淑琴，梁淑文.现代植物生理学实验指南M.科学出版社，1999.6 崔彬彬，李云，冯大领等.杨树叶绿体分离及叶绿体DNA提取方法的研究J.北京林业大学生物科学 与技术学院.2006,4(2):25-27.7 冯双华.水稻叶绿素含量的简易测定J.福建农业科技1997,(4):7-8.8 欧阳菲.关于叶绿体色素提取与分离实验的难点分析及其改进方法J.伊犁教育学院学报,2001,6(2):94-96.9 龚小松.高等植物叶绿体DNA提纯方法的改进J.科学通报,1991,(6):467-469.10 王关林，方宏筠.植物基因工程M.科学出版社,2002.