性控技术现状及未来展望

家畜性别控制技术现状及未来展望家畜性别控制（Sex Control）技术是指通过人为干预，使雌性繁殖动物按 人们的愿望繁衍所需性别后代的技术。性控技术是基于对性别决定和分化机制认 识基础上的应用。家畜的性别控制在生产实践中具有广泛的现实意义。主要有：（1）发挥性别控制性状的潜能。通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别 限制的生产性状（如泌乳）和受性别影响的生产性状（如生长速度、肉质等）的 最大经济效益。（2）排除伴性有害基因的危害。消灭不理想的隐性性状，防止 性连锁疾病的发生。如血友病，色盲，杜兴氏肌肉营养不良等（3）加速遗传进 展和畜群更新。控制后代的性别比例可增加选种强度，加快育种进程。（4）加 快珍稀频危动物的繁殖进程。（5）克服母牛异性孪生不育等1家畜性别控制的历史回顾早在公元前400多年，Democritus就设想人为地控制动物性别。在我国民间 有许多人为控制性别的说法。进入20世纪后，随着科学技术的发展，关于人为控 制动物性别逐渐发展成为一门科学。1902年，Mcclung在研究蝗虫精细胞时，在 历史上第一次提出性别决定的染色体理论。Stenvens和Wilson研究指出，雌、雄 个体中不同的性染色体与性别有关，并将性染色体定义为X染色体和Y染色体。20 世纪前半个世纪的大量研究证实，哺乳动物的性别是由一对性染色体所决定的。 在哺乳动物的所有正常配子中均含有一组常染色体和一条性染色体，即雌性卵子 所含的性染色体为X染色体，而雄性精子则有两类性染色体，一部分精子含有X 染色体，另一部分则含有Y染色体。携带Y染色体的精子（Y精子）与卵子结合受 精，其受精卵就向雄性个体（XY）发育，而携带X染色体的精子（X精子）与卵子 结合受精，其受精卵就朝雌性个体（XX）发育11955年Eichwald和Silmser2发现了雄性特异性弱组织相容性抗原（H-Y）， 引发了对精子分离选择和胚胎性别鉴定的广泛研究。1959年，Jacabsu等认为决 定雄性性别的因素存在于Y染色体上，并于1966年证实雄性性别决定基因位于Y 染色体短臂上。20世纪80年代，美国韦赫生物医学研究院发现，Y染色体上的基 因启动雄性性别的发育，将该基因称为睾丸决定子（Testis-determining factor TDF3。Palmer等（1989）发现，决定动物性别的基因是丫染色体上一个核心区 基因，并将其命名为SRY （Sex Determining Region in Y-Chromosome）。由于 一系列的动物性别决定因素的发现，人们针对性地研究出许多进行性别鉴定的有 效方法，为动物性别控制开辟了行之有效的科学方法。2性别控制的基本方法目前，性别控制的方法可分为两大类：一为X与Y精子的分离，二为鉴定胚胎 性别。2.1 X与Y精子的分离2.1.1分离X与Y精子的生物学基础（1）X精子的F小体：1968年Cosperson5在研究男性染色体时发现，在Y染 色体长臂末端发出有比其他部分强的荧光亮点，将这些点称为F小体。1970年 Barlow等首次报道在Y精子头部发现F小体，且F小体在人和家畜的精子上都能 见到。后来经实验反复证明，有F小体的精子一定是Y精子，而没有的则是X精子。（2）精子的重量：X与Y精子在重量和比重上有差异，主要表现在DNA量的不 同。Morruzi（1979）7报道了X与Y精子染色体所含DNA的不同，X染色体更大，其 DNA含量也比Y染色体所含的DNA多，重量更大。两者的DNA含量差异一般在3 %5 % 之间，其中牛为3.9%，绒鼠为7.5%（Johnson等，1987b）。由于重量和比重 的不同，而致X和Y精子在液体中运动力、沉降速度等的不同。（3）精子运动：据报道，Y精子的活动能力比X精子强，运动速度快，在含 血清蛋白的稀释液中呈直线运动。Ericssons等（1973）将人的精液置于血清白 蛋白柱的上层，从柱的最下面分离出的精子与原精液相比，运动的精子的比率高， 其83%为F小体阳性，即Y精子。精子的表面膜电荷：精子的表面均带有膜电荷， 为负电荷，但X、Y精子表面的电荷量和分布有差异。膜电荷量取决于同核蛋白结 合的唾液酸的含量。Y精子尾部膜电荷较多，而X精子头部膜电荷较多。（4）精子的耐酸碱性：Y精子更嗜碱性，而X精子则更嗜酸性。（5）H-Y抗原及分布：H-Y抗原即雄性特异性弱组织相容性抗原（Male Specific Minor Histocompatibility一Y Antigen，简称H-Y抗原），H-Y抗原是 一种弱抗原，并且已证实，只有Y精子才能表达H-Y抗原。2.1.2精子分离的研究方法和现状由于X、Y精子存在物理化学和生物学上的差异，人们一直试图依据这些微小 的差异将X、Y精子分离。（1）沉降法：Schilling等（1967） 9将由脱脂乳、盐类及卵黄组成的液体， 调制成黏度为710CP、比重1.0371.044的液体，用于沉降分离牛精子。沉降时 间在60min内，使用最下层的分离液对母牛进行人工受精，结果雌性率为70%。 用上层部分精子配种，雄性犊牛为63.9%。实验在牛、羊等上的多数结果表明： 用上层精液输精得到的多数为雌性，而下层则多数为雄性，但是各种结果的差异 性很大。沉降法虽然有一定的效果，但试验结果不稳定。(2) 离心沉降法：Lindahl(1970)i0在1220摄氏度环境下离心牛精子，将 上下层精子分别给母牛输精，上层产公犊58.7% (27/46)，下层产母犊58.72%。 Shastry等m(1977)用聚蔗糖胶体密度梯度分离出73%的含F小体的精子。 Luderer等(1982) 用牛顿凝胶离心分离牛精子输精，得雄性犊牛29头，雌性 犊牛25头。乌兰少布(1985)用生理盐水稀释羊精液并离心，输下层液雌羔率为 76%，上层液为21.87%。玲木达行(1986)眄用Perool密度梯度分离牛精子， 将分出的X精子层给母牛授精所得母犊77.8%。Ogawa等(1987) u。用密度梯度离 心法分离猪精子，在底层收集到的精子中，有F小体的精子为10.1%。虽然离心 沉降法分离精子的成功率较高，但离心过程对精子破坏性大，常使精子畸形、活 力下降。(3) 电泳法：Shoredon(1932) 13用电泳法分离牛精子，分别收集向两极运 动的精子。阳极雌性占71.3%，阴极雄性占63.8%。Hafs和bod(1974m将10%卵 黄磷酸缓冲液稀释的精液3.5m l置于活动式间隔槽内，以8V/cm和21/cm在35摄氏 度下电泳移动1min，用正极处的精子输精得到121头犊牛，55%为雄性；用负极 处的精子输精得到137头犊牛，44%为雄性，但对照组的59头犊牛中也是44%为 雄性。Cardon (1975) 区电泳兔精液，用阳极精液输精，仔兔中有74.3%为雌性； 阴极精液输精，雌性率仅占15.1%。刘嗣枢等(1985) 13用改装电泳装置分离牛 的精子，阳极侧X精子占90.38%。Mobri等(1986)眄用自由电泳法处理人的精 液时发现，在PH7.4时，阳极侧多为X精子，阴极侧多为Y精子(80%)； Engelmannl 等10 (1988)用此方法却得到与此完全相反的结果。(4) 免疫学分离法：该方法是利用H-Y抗体检测精子质膜上存在的H-Y抗原， 以此来分离X精子和Y精子。由于H-Y抗原极弱，因此对细胞表面H-Y抗原进行血清 学和免疫学的检测在70年代的效果并不理想。随着生产高效价H-Y抗体方法的发 展，并在Bryant等12 (1980)应用H-Y抗体免疫学亲和柱层析首次成功地分离了 人和小鼠的H-Y阳性和阴性精子后(已经获美国专利)，利用H-Y抗原进行动物性 别的控制的研究才有实质性进展。Zavos (1982) g用兔子生产抗血清进行实验， 把H-Y抗血清注入母兔阴道，15min后输精，产出的雌性兔为74.2%； 1987年他又 采用免疫过滤法对兔子和牛进行试验，用抗H-Y的单克隆抗体晕聚精细胞的H-Y 复合体，结果后代中雌兔为78.9%、母犊为74.4%。Bradley (1989) 12用免疫 亲和柱层析法分离绵羊的H-Y阳性和H-Y阴性精子，发现未结合到层析柱的精子有 70%80%为阴性，结合到层析柱上而后被洗脱下来的精子75%78%为阳性；而 对照组的H-Y阳性和H-Y阴性精子分别为43%44%和56%57%。王光亚等(1994) 15用兔H-Y抗血清进行试验，将效价为1： 32的兔H-Y抗血清输入发情母兔阴道内 1015min后自然交配，所生2只小兔均为雌兔。(5) 流式细胞分离法(流式细胞光度法)：借助流式细胞光度计进行测定， 其理论依据是X与Y精子DNA的含量不同。DNA含量高，当用专用荧光染料染色时， 其吸收的染料就多，发出的荧光也强，反之发出的荧光就弱。这种分离方法开创 了精子分离的新局面。Johson等16 (1989)用分离的兔Y精子在子宫内输精后， 预测雄性兔比例为81%，实际亦为81%； X精子输精后预测雄兔的比例为14%， 实际产雄兔的比例为6%。1991年他用经使用该法分离的猪X精子输精后，获得 74%的雌性仔猪，Y精子输精后获得68%的雄性仔猪。Gran等m (1993)使用该 法分离牛精子用于体外授精，将胚胎移植给9头受体牛，其中4头妊娠产牛犊6头， 3头雌性，3头雄性，均与预测性别相符。Abeydeera等睥(1998)报道，利用该 法分离的猪X精子授精，产雌性23头，雄性1头，准确率为97% ；利用分离的Y精 子授精，产雄性仔猪率为100%。Seidel等19 (1999)报道了使用牛分离精子冷 冻保存后的授精效果，后代性别准确率在90%以上。但是用一般流式细胞分类器 分离精子时，需要精子一个个通过，这样就必须稀释精液，造成精子的运动能力 下降，加之分离效率太低，目前还无法应用于实际生产。但是，据Johson (2000) 20报道，同时分离收集X和Y精子，分离速度以达到每小时6000000精子；若只分 离和收集X精子，则分离速度可达到每小时18000000精子，看来，用于生产实践 为期已不远。如果结合显微注射技术，该方法将是一种有效的分离X、Y精子的技 术。其他方法：柱层析分离法、化学药品处理法、Y特异性DNA探针法。在奶牛上 人们研究了输精时间与后代性别比例关系，发现排卵前输精易得雌性后代，排卵 后输精易得雄性。2.2胚胎性别鉴定动物性别控制可以通过对其胚胎进行性别鉴定，然后移植所需要的性别，以 达到性别控制的目的。至今发展较为成熟的方法包括：细胞学方法、生物化学微 量分析法、免疫学方法和分子生物学方法。2.2.1细胞学方法该方法是经典的胚胎性别鉴定方法，主要是通过核型分析而对胚胎进行性别 鉴定。鉴别过程是将胚胎用含有丝分裂阻滞剂的培养液培养，然后诱使细胞肿胀 及染色体扩展并加以固定、染色、在显微镜下检查其核型，其准确率为100%。 但要获得高质量的中期染色体分散相难度很大，据报道中期分散相的获得率一般 在61%81%之间，而能用于进行核型鉴定的只有6.7%60%。这对于胚胎的浪 费很大，而且耗时费功。虽然结合了胚胎分割技术，分割一半胚胎用于鉴定，另 一半进行冷冻或者移植，已经获得性别鉴定的犊牛(Seike) 10。目前该方法主 要用来验证其他性别鉴定方法的准确率。2.2.2生物化学分析法该方法是通过测定与X染色体相关的酶活性，来达到鉴别胚胎性别的目的。 其原理是早期雌性胚胎的两条X染色体中有一条失活。一般在哺乳动物中雌性带 有两条X染色体，而雄性则带有一条X染色体和一条Y染色体。在胚胎发育早期， 为保持两性间的基因等量，雌性的一条X染色体失活。在胚胎基因组的激活和X 染色本失活这一短暂期雌性胚胎的两条X染色体都可以被转录和翻译。这样雌性 胚胎的X染色体连锁酶的活性和浓度是雄性胚胎的两倍。这些相关酶有6-磷酸葡 萄糖脱氢酶(G6PD)、次黄嘌吟磷酸核糖转移酶(HPRT)、腺嘌吟磷酸核糖基转移 酶(APRT)。这最终反映在雌性胚胎中与X染色体相关酶的细胞内浓度及活性是雄 性胚胎的两倍，这就是该法进行性别鉴定的理论依据。WWilliam对桑葚胚、囊胚 阶段的胚胎进行了乂染色体相关酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)活性检查，对雌 性胚胎鉴定的准确率为93.94%(62/66)。Monk等10 (1988)用8细胞鼠胚的一 个卵裂球检查了乂染色体相关的次黄嘌吟磷酸核糖转移酶(HPRT)活性，雌性和 雄性细胞鉴定准确率分别为91%和100%。但是，由于X染色体失活的确切时间还 不知道，如果有些雌性胚胎的X染色体提前失活，就很容易将雌性误判为雄性。2.2.3免疫学方法是指利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y抗 原，从而进行的胚胎鉴别方法。对胚胎的H-Y抗原检测有三种方法，即：细胞毒 性分析法、间接免疫荧光法、囊胚现成抑制法。(1) 细胞毒性分析法：该法是将H-Y抗血清与补体(鼠血清)加入培养液中 对胚胎进行培养，将在培养中继续发育的胚胎判为H-Y阴性(雌性)，将出现个 别卵裂球溶解以及不能发育到囊胚者判为H-Y阳性(雄性)。Shelton (1981 )把 经细胞毒性处理而没有溶解的鼠胚进行移植，得到81%的雌性个体。White等 (1982) 21 在体外处理鼠816细胞胚1000枚，其中479枚(48%)为雄性。他将 未发生反应的胚胎进行移植，所得58个仔鼠中50个为雌性(88%)KyozoUstsumi等10 (1984)将大鼠1632细胞胚胎浸入H-Y抗体中，置于5%CO箱内37下培养 26h,发现正常发育和受阻的胚胎各占50% ；然后将受阻胚胎取出置于不含H-Y抗 体的培养基中孵育数小时后，抑制被解除，胚胎可以继续发育。将未被抑制和解 除抑制的两部分胚胎分别移植，后代中前者雌性鼠为77.6%，后者雌性鼠为 4.9%。但该方法是以破坏一部分胚胎(雄性)为代价，因此此方法很少使用。(2) 间接免疫荧光法：该法是将胚胎先用H-Y抗血清或单克隆抗体中培养处 理30分钟，再用异硫氤酸盐荧光素(FITC)标记的第二抗体处理，在荧光显微镜 下观察是否有特异荧光来判断，有荧光者为雄性胚胎，无荧光者为雌性胚胎。 White等22 (1983)用此方法进行研究发现，被标记的鼠胚胎为55.4%，未被标 记的胚胎为4.6% ；后将这些胚胎分别移植后，雄性胚胎仔鼠为78.3%，雌性胚 胎仔鼠为82.6%。1987年，他们发现用此法检测，在牛有89%的雌性鉴定准确率， 在猪有86%的雌性鉴别准确率，在绵羊有85%的雌性鉴别准确率。这种方法的优 点是不损害胚胎，鉴别的准确率也较高，但对荧光强度的估测则有高度的主观性。 此外，胚胎质量似乎也与荧光强度和类型有关，第二抗体有时发生非特异结合， 如与同卵周隙的细胞碎片结合等。(3) 囊胚形成抑制法：该法是利用H-Y抗体对雄性桑葚胚向囊胚发育具有可 逆性抑制。Utsumi等1983U0的原理发展起来的一种胚胎性别鉴定方法。内海恭三(1989) 10将H-Y抗血清与桑葚胚共同培养一段时间，具有H-Y抗原的雄性胚胎 则被H-Y抗体所抑制，不能形成囊胚腔，而无H-Y抗原的雌性胚胎则不被H-Y抗 体所抑制，可在培养过程种继续发育成囊胚，以此可将雄性胚胎与雌性胚胎分开。 内海恭三(1989)将大鼠H-Y抗体与大鼠桑葚胚共同培养6小时，形成囊胚者为雌 性胚，未形成囊胚者为雄性。雄性胚除去H-Y抗体后培养数小时，还可以形成囊 胚。将两种胚胎移植后分别获得了79%(38/48)的雌性鼠和92.3%(21/23)的 雄性鼠。似乎这是一种有效的胚胎性别鉴定方法，但其不足之处是容易将一部分 的发育迟缓的雄性胚胎误判为雌性胚胎。此外，在实际工作中，如不是通过体外 受精，很难同时获得刚好处于桑葚胚期的大量胚胎而不浪费桑葚胚以前及囊胚以 后的胚胎。2.2.4分子生物学方法该法的实质就是检测Y染色体上是否存在SRY基因以鉴别鉴别胚胎性别，有 SRY基因的为雄性，否则则为雌性。(1) DNA探针法。该方法的原理是：带有可检测标记(如同位素、生物素或 荧光染料等)的一小段已知序列的寡聚核苷酸，长度在十几个、几十个或几百碱 基对以上，即一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基 因，也可以仅仅是基因的一部分。可通过分子杂交探测与其序列互补的基因是否 存在。具体操作方法：从胚胎取下少量细胞，将其DNA与丫染色体特异标记的DNA 序(探针)杂交，阳性结果为雄性，阴性结果为雌性。Leonard等(1987)首次 报道用牛Y染色体特异性DNA多重复序列探针鉴定牛囊胚期胚胎获得成功，他们从 胚胎取1020个细胞作原位杂交，共取150枚胚胎样品，胚胎细胞鉴定准确率为 95%。Bondioli等(1989)用此法进行牛胚胎性别的鉴定，鉴定70例，其准 确率为100%。探针的标记物有两种，一为放射性同位素，另一为生物素。前者 需要大量的胚胎细胞和较长的时间(一般同位素低温暴光需要78天)，后者技 术难度较大，但所需时间较短。使用此方法鉴定准确率达90%以上，但是成本较 高、操作繁复、实际应用很少(2) PCR扩增法。1988年Saili等10人建立起来了特异性DNA序列聚合酶链 式”反应(PCR)放大技术。此方法是选用与待放大的DNA片段两个3 一端分别 互补的两个寡聚核甘酸引物，在变温和DNA聚合酶催化下进行变性一复性一延伸 反应，从而使两引物间规定的那段DNA序列复制，若进行这种反应，该段DNA序列 就随着反应周期数的增加而迅速得到多拷贝放大。Heer等地 (1990)首先采用PCR 技术扩增，特异多重序列鉴定了牛羊等家畜胚胎性别，准确率分别为91.6%、 96.5%。Gubbay等10(1990)发现哺乳动物的性别决定区(Sex一determine region in Y.SRY)位于染色体短臂A区的35K的序列内，是一个长约250bp，可编码80多b个保守氨基酸的单拷贝基因，用PCR技术来检测SRY的有无，便可以判别胚胎的性 别，从而为胚胎性别提供了可靠的保证。曾益滔等(1991)应用DNA直接测序 法测定了牛SRY，基因的“核心序列”，在此基础上设计合成了两对牛5RY，序列 特异的PCR扩增引物，建立了超微量扩增单拷贝SRY基因技术方法，并用此方法鉴 定了 17枚牛胚胎的性别，其中雌性7枚，雄性10枚；后用于移植，结果有4枚移植 成功，犊牛的性别与鉴定结果一致，准确率为100%。罗应荣(1991) 10用PCR 进行绵羊和牛胚胎的性别鉴定，准确率分别为80%(20/25)和82%Utsumi(1991) 使用PCR技术对牛的全胚、半胚和部分胚胎细胞进行性别鉴定，准确率分别为100(45/45)、100%(19/19)和92%(12/13)。目前，PCR进行胚胎性别鉴定的 最大问题是污染问题(Herr等，1990)扑，在采摘胚胎细胞时间如采到粘在胚胎 上的精子、空气中的污染、PCR试剂的污染，以及培养液中的BSA、FCS都可能成 为污染源，引起阳性结果。(3) FISH荧光原位杂交。基本原理是：如果被检测的染色体上的靶DNA 与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核 酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛， 可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。该法的优点：1、荧光 试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同 一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。缺点是：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下 降，荧光素分辨率低且对胚胎毒性较大。（4）LAMP （Loop-mediated isothermal amplification） 环介导等温扩增反 应。鉴于PCR方法操作较复杂，对仪器和操作人员要求较高，不适合基层或现 场快速诊断，因此在国内的推广受到限制。2000年，日本学者Notomi等在 Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即环介导等温扩增反 应。LAMP法是一种全新的基因扩增法。由于双链 DNA在65C左右处于动 态平衡状态，任何一条引物对双链 DNA的互补部位进行碱基配对时，一条 链就会脱落变成单链。在等温条件（60-65 C）下孵化，通过测定扩增基因 时出现的副产物-焦磷酸镁的混浊度来判断是否存在目标基因。反应时间 40min左右。PCR法相比，具有以下特征:不需要使双链DNA先变性成单链； 扩增反应在等温下可持续进行；扩增的效率极高；针对6个区段使用4种 不同的引物，可特异性扩增靶基因序列；仅使用1种链置换型DNA聚合酶， 成本低；扩增产物是以同一条DNA为模板形成大小不一的结构；当模板是 RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA 一样进行扩增28。3性控技术未来展望奶牛是单胎动物。其自然繁殖率低。目前，采用常规的人工授精繁育技术， 远不能满足产业化发展的需要。我国良种奶牛繁育及精液供应市场还处于培育阶 段。参与人工授精奶牛头数仅占可繁殖母牛的40%，情期受胎率为70%，母犊出生 率为50%左右。由于奶牛自然繁殖率低，繁殖速度慢，使得国内现有奶牛种群扩 繁受到很大限制，从国外大批引进种奶牛要花费大量的外汇，也受到隔离场数量 不足和进口国牛源及牛品质的限制。因此，成为目前我国奶业发展的瓶颈。调整 奶牛品种和品质结构，提高个体单产，关键是要加快推广应用一批优良品种和先 进生产技术，积极引进国外优良品种和先进技术，加快优质、专用品种的选育和 推广。而性别控制技术，即XY分离精液的优势恰恰克服了我国高产纯种奶牛缺乏 这一缺陷。XY精子分离技术是当今获得良种母牛后代的最先进、最快的一种良种 繁育技术，它可以最大限度地发挥良种牛的繁殖潜力，加快奶牛品种结构调整， 提高良种牛繁育速度。经过十几年的研发，XY精子的性控比率已达到93%以上， XY精子的受精成活率已达65%，这意味着如果得到1头良种母牛犊，采用传统的 冻精技术，则需要5剂精液，花费2年的时间，而采用XY精子分离技术，只需要2.5 剂精液，花费1年的时间。不论从繁育的成本还是从生产效率方面考虑，XY精子 分离技术都将是畜牧业的一场技术革命。与此同时，随着生物科学技术的发展， 将SRY基因上的片段进行有效的整合将来也将成为可能。性控技术和其产品一性 控精液应用于奶牛业，将最大限度地发挥良种牛的遗传、繁殖潜力，增加遗传和 表型性别的选择强度，加快遗传进展，从而加快牛品种结构调整，提高生产效率 和良种牛繁育速度。同时可显著提高奶牛的生产水平和奶农收入，大大促进中国 乳业的发展。参考文献I Goodfellow,P.N.,Darling,S.M.Genetics of sex -determining in man andmouse.zJDevelopment,1988,102:251258 Eichvald,E.F.,Silmer,C.R.,Untitled Communication.JTransplant,Bull,1955,2:1481493 段子渊.动物性别决定的分子机理及性别鉴定与控制新技术.J黄牛杂志,1998,24:52544 葛宝生，李善如，陈永福等.性别决定及SRY基因在胚胎发生中的表达.J国外畜牧科 技，1998,(25):29325 Cosperson,T.J Exp.Cell Res.,1968,49:2196 Barlow,P.,Vosa,C.G.,TheY-Chromosome in human spermatozoa.J Nature,1970,226:2612627 Moruzzi,J.F.Selecting a mammalian species for the separation of X-andY-chromosome-bearing spermatozoa.JJ.Repord.Fertil,1979,57:3193238 Johnson,L.A.,Flook,J.P.,Look,M.V.,Pinkel,D.Flow sorting of X-and Y-chromosome-bearingsperm spermatozoa into two populations.J Gmete res,1987b,16,199 Schiling, E.Sex ratio at birth-prospects for control .JSoc Anim. Sci.,1967,768410 倪和民，郭勇，陈英.哺乳动物性别控制的研究进展.J北京农学院学报，1996,11(1):129134II Shastry,P.R.,et al . .J Nature,1977,22:3012 郭志勤等.家畜胚胎工程.M中国科学技术出版社，1998年第一版13 李馨，郭志光.家畜性别控制研究现状与展望.J内蒙古畜牧科学，1997,2:151814 Zavos,P.M. Preconception sex determination viaintravaginal administration of H-Y antigen in rabbits.J Theriogenology,1982,20:23524015 王光亚，段恩奎.山羊胚胎工程.陕西天则出版社,1994,14917916 John,L.A.,Flook,J.P.,HAWK,H.W. Sex preselection in rabbits:live birth from X-and Y-sperm separated by DNA and cell sorting .J Biol. Reprod,41,19920317 Cran,D.G.,Johnson separation of X-and Y-chromosome -bearing sperm and in vitro fertilization.JVet.Rec.,1993,132:404118 Abeydeera ,L.r.,Johnson,L.A.,Welch,G.D.,et al. Birth of piglets preselected for gender following in vitro fertilization of in vitro matured pig oocytes by X-and Y-chromosome-bearing spermatozoa sorted by high speed flowcytometry .JTheriogenology ,1998,50,981-98819 Seidel ,G.E,Jr.,Schenk,J.L.,Herickoff,L.A., et ai. Insemination of heifers with sexed sperm.J Theriogenology,1999,52,1407142020 Johson,P.A. Sexing mammalian sperm for production of offspring:the state-of-the-art.JAnim. Reprod.Sci.,2000,6166:9310721 White,K.L. et al . Serviral after transfer ofsexed mouse embryos -xantigeh,to H JTheriogenology,1982,18:65566222 White,K.L. et al . Cytolytic and fluoresent detection of H- antigen on preimplantation mouse embryos. J Theriogenology,1983,19:70170523 Bondioli,K.M.et al. J Theriogenology,1989,31:9510424 Herr,C.M. et al. J Theriogenology,1990,33:24624725 曾益滔等.J中国科学(B辑)，1993,23 (4)： 371-37626 Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNAJ. Nucleic Acids Res ,2000,28 (12) :E6327 Nagamine K, Watanabe K, Ohtsuka K, et al. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template J .Clin Chem,2001,47(9):1742174328 Soliman H,EI-Matbouli M.Reverse transcription loop-mediated isothemal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS) J.VetMicrobiol, 2006,114 (3-4)： 205-213