高效液相色谱法标准操作程序

高效液相色谱法标准操作程序1=-高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品 进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依 次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。1对仪器的一般要求和色谱条件所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理 系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。1.1色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充 剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如 氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂 有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多 孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量 和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。孔径在15nm （1nm=10A）以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合 物则应选择孔径在30nm以上的填料。除另有规定外，普通分析柱的填充剂粒径一般在3gm10gm之间。粒径更小（约2gm） 的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹 配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规 定的色谱条件的测定结果为准。以硅胶为载体的普通键合固定相的使用温度通常不超过35C，为改善分离效果可适当 提高色谱柱的使用温度，但不能超过60C。流动相的pH值应控制在28之间。当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH值 小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于8的流 动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充 剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或2非硅胶填充剂等；当需使用pH值小于 2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙 基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂，或有机无机杂化填充剂等。1.2检测器最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测 器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还 与化合物的结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有的化合 物均有响应;蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关； 二极管阵列检测器可以同时记录待测物的吸收光谱，故可用于待测物的光谱鉴定和色谱峰的 纯度检查。紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性 关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液的浓度通常呈指数关系，故进行计算时，一般 需经对数转换。不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应符合紫外可 见分光光度法（附录W A）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有 机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允 许使用含不挥发性盐组分的流动相。1.3流动相 反相色谱系统的流动相首选甲醇一水系统（采用紫外末端波长检测时，首 选乙腈-水系统），如经试用不适合时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的 流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于C18链在水相环境 中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有 机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色 谱系统不稳定。各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色 谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测 器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。其中，调整流 动相组分比例时，以组分比例较低者（小于或等于50%）相对于自身的改变量不超过土30% 且相对于总量的改变量不超过10%为限。如30%相对改变量的数值超过10%时，则改变 量以10%为限。对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种，可在该品种项下注明。2系统适用性试验色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。其 中，分离度和重复性尤为重要。按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试 验溶液对色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。2.1色谱柱的理论板数（n）用于评价色谱柱的效能。由于不同物质在同一色谱柱上 的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测组 分或内标物质的理论板数。在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图， 量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单 位）和峰宽（W）或半高峰宽（Wh/2），按n=16（tR/W）2或n=5.54（tR/Wh/2）2计算色谱 柱的理论板数。2.2分离度（R）用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是 衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其它难分离物质）的分离度，或将供试品 或对照品用适当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的分离度，对色谱系统进行 评价与控制。无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之 间有较好的分离度。除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。分离 度的计算公式为：R=2（tR2tR1）/（W1+W2）或r=2（t t ）/170（W +W ）或R=2 ktR2 tR1）/1，/O（W1, h/2+W2, h/2）式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1、W2及W, h2、W2, h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽。2.3重复性用于评价连续进样后，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时，通 常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标 准偏差应不大于2.0%；采用内标法时，通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液， 加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因 子。其相对标准偏差应不大于2.0%。2.4拖尾因子（T） 用于评价色谱峰的对称性。为保证分离效果和测量精度，应检查待 测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为：T=W0.05h/2d1式中W0.05h为5%峰高处的峰宽;d1为5%峰高出峰顶点至峰前沿之间的距离（如图）。除另有规定外，峰高法定量时T应在0.951.05之间。峰面积法测定时，若拖尾严重，将影响峰面积的准确测量。必要时，可根据情况对拖尾 因子作出规定。3测定法3.1内标法按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各 适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照 品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：校正因子（f）=（As/cs）/（AR/cR）式中As为内标物质的峰面积或峰高；Ar为对照品的峰面积或峰高；C s为内标物质的浓度；cR为对照品的浓度。再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待 测成分（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：含量（cx）=f-Ax/（A,s/c,s）式中Ax为供试品峰面积或峰高；cx为供试品的浓度；As为内标物质峰面积或峰高；Cs 为内标物质的浓度；f为校正因子。采用内标法，可避免因样品前处理或进样体积误差对测定结果的影响。3.2夕卜标法按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定 量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高）， 按下式计算含量：含量（cx） =cR（Ax/AR）式中各符号意义同上。由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时，以定量环或自动进样器进样为好。3.3加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项 下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的 溶液，进样，记录色谱图，按上述（1）法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各 品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照， 采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当 的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度（以噪音水平可接受为限）或进样量（以柱子 不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的10%25%或其峰面积能准 确积分通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD）应小于10%；含量在 0.5%2%的杂质，峰面积的RSD应小于5%；含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于 2%。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间，除另 有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积， 分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。3.4不加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，若没有杂质对照品，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同 上述（3）法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样， 前者的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色 谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图 I，再记录等体积纯溶剂的色谱图II。色谱图I上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色 谱图II上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。3.5面积归一化法按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。测量各峰的 面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。用于杂质检查时，由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察 供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。4注意事项4.1流动相的制备与保存用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外一可见分光光 度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水，可用超纯水器制得或用重蒸馏 水。凡规定PH值的流动相，应使用精密PH计进行调节，除另有规定外，偏差一般不超过土 0.2PH单位，配制好的流动相应通过适宜的0.45rm（或0.22rm）滤膜过滤，以除去杂 质粒.流动相用前一般脱气，否则容易在系统内欲出气泡，影响泵的工作，色谱柱的分离效 率，检测器的灵敏度以及基线稳定性等。流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯等容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶 剂如甲醇、乙月青等可浸入塑料表面的曾塑剂，导致流动相受污染。贮存容器一定要盖严，以 防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相引起PH的变化，对分离或分 析结果带来误差。磷酸盐，醋酸盐缓冲液容易发生霉变化，应尽量新鲜配制使用，如确需贮 存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。4.2溶液的配制与保存除另有规定外，采用规定溶剂配制的对照品和供品容液，定 量测定时，对照品溶液和供试品溶液均应分别制两份。供试品溶液在注入液相色谱仪前，一 般应经适宜的0.45rm（或0.22rm）滤膜过滤，以减少对色谱系统产生污染或影响色谱 分离。应根据试验要求和供试品稳定性，设置待测溶液的贮存条件（如温度、避光等）4.3色谱柱的使用与保存 根据实验要求和流动相得PH值，参照色谱柱说明书，选用 适宜的色谱柱。安装色谱柱时应使流动相流路的方向与色柱标签上的箭头所示方向一致。除 另有规定外，不宜反向使用，否则导致色谱柱柱效明显降低，无法恢复，进样前色谱柱用流 动相充分冲洗平衡。经色谱适应性试验测试，应符合要求。色谱柱在使用过程中，应避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动，温度的变化或者 机械的震动都会影响柱内固定相的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因 此在调节流动相流速时应该缓慢进行。试验结束后，可按色谱柱使用说明书，对色谱柱进行冲洗和保存一般来讲，对于反相谱柱的使用说明书，如使用缓冲液或含盐溶液作为流动相，在实验 结束后，应用10倍柱的体积（如150mm柱长，约15ml）的低浓度的甲醇/乙青一水溶液（10% 20%）冲洗，使色谱柱内的盐完全溶解洗脱出，再用较高浓度的甲醇/乙青一水溶液（50%） 冲洗，最后用高浓度的甲醇/乙青一水溶液（80%100%）冲洗，使色谱柱中的强吸附物质 冲洗出来。如色谱柱需长期保存，反相柱可以贮存于甲醇或乙青中，正相柱可以贮存于经脱水处理 后的正己烷中，离子交换柱可以贮存于含5%甲醇或含0.05%叠氮化钠的水中，并将色谱柱两 端的密封，以免干燥，室温保存。4.4流动相的调整为满足色谱系统适应性要求，试验中有时需要调整流动相的组份 的比例。在调整流动相组份比例时，以组份较低者（小于或等于50%）相对该变量不超过土 30%且绝对改变量不超过10%为限，如30%相对改变量的数值超过10%，则改变量以10%为 限。下面举例说明。4.4.1二元流动相系统例1两组比例为50:50按上述原则，50%的最大相对改变量为15%，已超过绝对改变量 允许范围，故该流动相比例调节范围是10%，即40:60至60:40。例2两组比例为2:98按上述原则，2%最大相对该变量为0.6%故该流动相调节的范围是 1.4： 98.6 至 2.6:97.4。4.4.2三元流动相系统例3三组比例为60:35:5按上述原则，可每次调节流动相系统中比较低的两个组分。对于35%的组分，其最大相对该变量为10.5%，已超过了绝对改变量允许范围，故该比 例调节范围是10%，即25%45%，则流动相系统比例的调节范围是50:45:5至70:25:5。对于5%的组分，其最大相对该变量为1.5%，该组份比例调节的范围时土 1.5%，即3.5% 6.5%，则流动相系统比例调节范围是58.5:35:6.5至61.5:35： 3.5。4.5杂质检查时色谱参数的设置在进行杂质检查时，选择适宜检测灵敏度和设定适宜积分参数非常重要。国内药品质量 标准中，通常制备与杂质限度相当浓度的对照溶液，用以调节检测灵敏度，使对照溶液的主 成分色谱峰的峰高达满量程的10%25%，再进行供试品溶液的测定，以峰面积计算单个杂 质量和总杂质量。目前国内色谱数据处理系统大致有积分仪和色谱工作站两种类型，对于传统的积分仪， 由于记录仪的满量程是固定的，因此检测灵敏度的调节通常是调节检测器的灵敏度使色谱逢 高达到记录仪满量程的某个范围；而对于色谱工作站，由于记录标尺的满刻度是可调的，所 以通常是调解刻度的设定值，使色谱峰的量程占满刻度的某个范围。无论使用的是积分仪，或是色谱工作站，如质量标准中没有明确规定峰面积的取舍范围， 或没有测定灵敏度测试溶液，则在实际检验中，实验者通常根据以往经验设定积分参数和最 小峰面积，由此也出现了同批样品的杂质总量在不同实验室（或不同实验者）之间差异较大 的现象。如遇到这种情况，建议实验者在检测灵敏度调节（或工作站标尺量程调整）完毕后，采 用对照液逐步稀释法配制系列溶液来确定此色谱系统的检测限，在与供试品溶液与对照液相 同的标尺下记录图谱，通常以信噪比是3:1时的相应浓度作为检测限，以该检测限对应的峰 面积作为计算杂质总量时色谱峰峰面积的舍系限值。4.6梯度洗脱 梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。要注意溶 剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超 出范围后就不互溶，使用时更引起注意，当有机溶剂和缓冲液混合时，还能析出盐的晶体， 尤其适用磷酸盐时须特别小心。混合剂的黏度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力变化。例如甲醇和水黏度 都较小，当二者以相近比例混合时黏度增大很多，此时的柱压大概是甲醇或水为流动相时的 两倍，因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，如洗脱过程中基线漂移较大， 亦可对色谱图进行空白扣除处理。