细胞工程7胚胎干细胞培养课件

细胞工程7胚胎干细胞培养CELLENGINEERING细胞工程细胞工程第一页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养第一章第一章 绪论绪论 4 4个学时个学时第二章第二章 实验室配置及基本技术实验室配置及基本技术 2 2个学时个学时第三章第三章 植物细胞工程的理论植物细胞工程的理论(lln)(lln)基础基础 4 4个学时个学时第四章第四章 植物组织器官培养技术植物组织器官培养技术 6 6个学时个学时第五章第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产植物细胞培养及次生代谢产物生产 3 3个学时个学时第六章第六章 原生质体培养和体细胞杂交原生质体培养和体细胞杂交 3 3个学时个学时第七章第七章 人工种子及植物种质资源保存人工种子及植物种质资源保存 2 2个学时个学时 第八章胚胎干细胞培养第八章胚胎干细胞培养 2 2个学时个学时 第九章第九章动物细胞培养动物细胞培养 4 4个学时个学时第十章动物细胞融合与单克隆抗体第十章动物细胞融合与单克隆抗体 4 4个学时个学时第十一章动物组织与胚胎工程第十一章动物组织与胚胎工程 1 1个学时个学时第十二章试管动物与克隆动物第十二章试管动物与克隆动物 1 1个学时个学时课程课程(kchng)(kchng)初步安排：初步安排：3636学时学时第二页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养第七章第七章 胚胎胚胎(piti)干细胞培养干细胞培养v干细胞是什么vES/EG细胞的培养及建系技术vES/EG细胞的体外诱导分化(fnhu)v诱导分化细胞的永生化vES/EG细胞技术学在医学中的应用vES/EG细胞技术学面临的问题和研究趋势第三页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养 一、干细胞（一、干细胞（stem cellsstem cells）是什么）是什么(shn me)(shn me)具有无限的或延长的自我更新具有无限的或延长的自我更新(gngxn)(gngxn)能力的细胞能力的细胞 能产生至少一种类型的高度分化的细胞能产生至少一种类型的高度分化的细胞第四页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l 从具有的分化潜能从具有的分化潜能(qin nn)(qin nn)上上讲：讲：-专能干细胞专能干细胞-多能干细胞多能干细胞-全能干细胞全能干细胞第五页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l 从组织从组织(zzh)(zzh)发生即来源上讲：发生即来源上讲：-胚胎性干细胞胚胎性干细胞 -成体干细胞成体干细胞/组织干细胞组织干细胞第六页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养v 胚胎性干细胞胚胎性干细胞是一类是一类(y li)(y li)来自早期胚胎、原始生殖细胞等源于胚来自早期胚胎、原始生殖细胞等源于胚胎的干细胞，基本特征是有稳定地在体外自我更新、稳定地维持胎的干细胞，基本特征是有稳定地在体外自我更新、稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能够分化为属于三胚层范畴的各正常核型和发育全能或多能性、能够分化为属于三胚层范畴的各种类型分化细胞，甚至参与个体发育。种类型分化细胞，甚至参与个体发育。-来自早期胚胎：胚胎干细胞（来自早期胚胎：胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESembryonic stem cells,ES）-来自胚胎生殖嵴中的原始生殖细胞：胚胎生殖细胞（来自胚胎生殖嵴中的原始生殖细胞：胚胎生殖细胞（embryonic embryonic germ cells,EGgerm cells,EG）-来自畸胎瘤组织：胚胎性癌细胞（来自畸胎瘤组织：胚胎性癌细胞（embryonal carcinoma cells,ECembryonal carcinoma cells,EC）第七页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养19811981年，年，EvensEvens和和MartinMartin分别成功的分离和体外培养了小鼠分别成功的分离和体外培养了小鼠 的胚胎干细胞；的胚胎干细胞；19951995年，年，ThomsonThomson等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎 干细胞；干细胞；19981998年，年，ThomsonThomson等建立了第一株人类胚胎干细胞；等建立了第一株人类胚胎干细胞；19981998年，年，ShamblottShamblott等建立了第一株人类生殖干细胞；等建立了第一株人类生殖干细胞；20022002年年3 3月，美国麻省理工学院科学家宣布，他们首次利用月，美国麻省理工学院科学家宣布，他们首次利用 人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在 治疗心血管疾病等领域治疗心血管疾病等领域(ln y)(ln y)的应用潜力；的应用潜力；目前已有报导，目前已有报导，ESES细胞在离体适当条件下分化为心肌细胞，细胞在离体适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞及血管内皮细胞，肝细胞等。胰岛细胞及血管内皮细胞，肝细胞等。第八页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养v 成体干细胞（成体干细胞（adult stem cells,ASadult stem cells,AS），也叫作组织干细胞（，也叫作组织干细胞（tissue tissue stem cellsstem cells）是指一群分布在成体组织中处于尚未分化的、具有自我更是指一群分布在成体组织中处于尚未分化的、具有自我更新并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞潜能的干细胞。如骨髓的造新并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞潜能的干细胞。如骨髓的造血干细胞、间充质干细胞；神经系统的神经干细胞；肝干细胞；骨骼肌干血干细胞、间充质干细胞；神经系统的神经干细胞；肝干细胞；骨骼肌干细胞等。细胞等。-造血干细胞可分化为血液系统的各种细胞；小肠和皮肤中的干细胞具有分造血干细胞可分化为血液系统的各种细胞；小肠和皮肤中的干细胞具有分化、补充和更新小肠和皮肤组织的能力。化、补充和更新小肠和皮肤组织的能力。-骨髓干细胞除了形成各种血细胞和衍生于间质细胞的各类细胞外，骨髓干细胞除了形成各种血细胞和衍生于间质细胞的各类细胞外，还可被诱导分化为神经细胞、肌肉还可被诱导分化为神经细胞、肌肉(jru)(jru)细胞、骨和肝细胞等不同细胞、骨和肝细胞等不同分化细胞。分化细胞。第九页，共六十一页。细胞工程7胚胎干细胞培养第十页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养 二、二、ES/EGES/EG细胞的培养细胞的培养(piyng)(piyng)建系技术建系技术 分离分离(fnl)(fnl)囊胚的内细胞群囊胚的内细胞群与成纤维细胞共培养，与成纤维细胞共培养，ESES细胞非分化细胞非分化(fnhu)(fnhu)增殖增殖分离胚胎生殖腺细胞分离胚胎生殖腺细胞胚胎干细胞的鉴定胚胎干细胞的鉴定定向诱导分化定向诱导分化功能细胞功能细胞第十一页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养第十二页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养1 1、ES/EGES/EG细胞细胞(xbo)(xbo)的来的来源源(1)(1)发育良好的囊胚，从中分离发育良好的囊胚，从中分离ICMICM，进一步分离培养进一步分离培养ESES细胞细胞(2)(2)从胚胎生殖腺中分离出从胚胎生殖腺中分离出EGEG细胞细胞 从畸胎瘤中分离出从畸胎瘤中分离出ECEC细胞细胞治疗性克隆治疗性克隆(k ln)(k ln)即体细胞核转移（即体细胞核转移（SCNTSCNT）途径分离培养）途径分离培养ESES细胞细胞 第十三页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养第十四页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养第十五页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养2 2、ES/EGES/EG细胞细胞(xbo)(xbo)的分化抑制培养的分化抑制培养l 目前常用目前常用(chn yn)(chn yn)的细胞分化抑制物主要有三种的细胞分化抑制物主要有三种:-饲养层细胞饲养层细胞(feeder layer)(feeder layer)-特殊细胞的条件培养液特殊细胞的条件培养液(conditioned medium),(conditioned medium),如如BRL(Buffalo rat liver)BRL(Buffalo rat liver)细胞条件培养液细胞条件培养液-分化抑制因子分化抑制因子(differentiation inhibitory factor,DIF),(differentiation inhibitory factor,DIF),如如白血病抑制因子白血病抑制因子(leukemia inhitory factor,LIF)(leukemia inhitory factor,LIF)第十六页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l饲养饲养(syng)(syng)层细胞培养法：层细胞培养法：常用的饲养层细胞有下列两种：常用的饲养层细胞有下列两种：（1 1）MEFMEF细胞细胞(mouse embryonic fibroblast)(mouse embryonic fibroblast)，取自各种品系，取自各种品系小鼠的小鼠的12dpc12dpc胚胎。经剪碎和胰蛋白酶消化，常规分散细胞培胚胎。经剪碎和胰蛋白酶消化，常规分散细胞培养为单层散布的成纤维细胞。养为单层散布的成纤维细胞。（2 2）STOSTO细胞细胞，来自，来自SIMSIM小鼠小鼠(S)(S)胚胎的对硫代鸟嘌呤胚胎的对硫代鸟嘌呤(T)(T)和乌本和乌本苷苷(O)(O)有抗性的成纤维细胞系，能分泌有抗性的成纤维细胞系，能分泌(fnm)(fnm)干细胞生长因子干细胞生长因子(stem cell factor,SCF)(stem cell factor,SCF)以及白血病抑制因子以及白血病抑制因子(leukemia(leukemia inhibitory factor,LIF)inhibitory factor,LIF)。第十七页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l无饲养无饲养(syng)(syng)层培养法：层培养法：饲养层细胞的制备在一定程度上使饲养层细胞的制备在一定程度上使ES/EGES/EG细胞培养显得较繁杂。近来细胞培养显得较繁杂。近来以以添加添加LIFLIF生长因子生长因子或或某些特定细胞的条件培养液某些特定细胞的条件培养液至含至含FCSFCS的正常培养液，的正常培养液，借此替代饲养层细胞：借此替代饲养层细胞：（1 1）直接在）直接在ESES细胞基础细胞基础(jch)(jch)培养液中加入重组培养液中加入重组LIFLIF（2 2）BuffaloBuffalo大鼠肝细胞条件培养液大鼠肝细胞条件培养液(BRL-CM)(BRL-CM)（3 3）2 23 3周幼年大鼠心肌细胞条件培养液周幼年大鼠心肌细胞条件培养液(RH-CM)(RH-CM)第十八页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养3 3、ES/EGES/EG细胞系的特性细胞系的特性(txng)(txng)和鉴定和鉴定（1 1）形态学特征）形态学特征(tzhng)(tzhng)（2 2）发育全能性和分化潜能）发育全能性和分化潜能(qin nn)(qin nn)鉴定鉴定（3 3）嵌合体动物）嵌合体动物第十九页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养（1 1）形态学特征）形态学特征(tzhng)(tzhng)l 体外培养小鼠体外培养小鼠ES/EGES/EG细胞在抑制细胞在抑制(yzh)(yzh)分化培养中呈现一个或几个分化培养中呈现一个或几个核仁、且核质比高的圆形或卵圆形细胞，彼此均呈单层或多层紧密堆核仁、且核质比高的圆形或卵圆形细胞，彼此均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或巢状群体生长形态，组成克隆的细胞彼此界限不清楚，积而形成岛状或巢状群体生长形态，组成克隆的细胞彼此界限不清楚，粘连性强。粘连性强。l 人人ESES与与EGEG细胞的形态学特征有所不同，与小鼠细胞的形态学特征有所不同，与小鼠ES/EGES/EG也有所不同。单也有所不同。单层培养时，人体层培养时，人体ESES细胞呈扁平状群落，且细胞界限细胞呈扁平状群落，且细胞界限(jixin)(jixin)清楚。清楚。第二十页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养（2 2）发育全能性和分化）发育全能性和分化(fnhu)(fnhu)潜能鉴定潜能鉴定 小鼠和包括人在内的灵长类动物全能或多能性胚胎性小鼠和包括人在内的灵长类动物全能或多能性胚胎性干细胞，具有特有的表达标志干细胞，具有特有的表达标志(biozh)以及在体内外的分化特以及在体内外的分化特点。点。第二十一页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养干细胞标记鼠类EC鼠类ES鼠类EG人类EC人类ES人类EGSSEA-1 +-+SSEA-3 -+SSEA-4 -+TRA-1-60 -+TRA-1-80 -+AKP +Oct-4 +？+小鼠与人类多能干细胞标记小鼠与人类多能干细胞标记(bioj)(bioj)蛋白表达谱蛋白表达谱 第二十二页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养lSSEAs(stage-specific embryonic antigen):SSEAs(stage-specific embryonic antigen):时期专一性胚胎抗原时期专一性胚胎抗原lTRA-1-60TRA-1-60、TRA-1-81:TRA-1-81:肿瘤排斥抗原肿瘤排斥抗原lAKPAKP：碱性磷酸酶在小鼠及灵长类的：碱性磷酸酶在小鼠及灵长类的ESES细胞中活性较高，在已分化细胞中活细胞中活性较高，在已分化细胞中活性明显降低；性明显降低；lOct-4:Oct-4:是生殖系专一性转录因子。作为和胚胎发育全能是生殖系专一性转录因子。作为和胚胎发育全能/多能性相关的转录因子，多能性相关的转录因子，Oct-4Oct-4通过多种调控机制激活或抑制不同通过多种调控机制激活或抑制不同(b tn)(b tn)靶基因的转录，在细胞的全能靶基因的转录，在细胞的全能/多多能性及未分化状态的调控和维持中发挥重要作用。能性及未分化状态的调控和维持中发挥重要作用。l端粒酶端粒酶(telomerase):(telomerase):一类核糖核蛋白，与维持真核细胞染色体末端的端粒长度一类核糖核蛋白，与维持真核细胞染色体末端的端粒长度和控制细胞寿命有关。人和控制细胞寿命有关。人ESES细胞的端粒酶活性高，而分化细胞一般难以检测到；细胞的端粒酶活性高，而分化细胞一般难以检测到；l胚胎胚胎(piti)干细胞的特异性表达标志：干细胞的特异性表达标志：第二十三页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l ES/EG ES/EG细胞在体外被刺激分化为各种类型细胞是其最基本的细胞在体外被刺激分化为各种类型细胞是其最基本的 属性属性;l ES/EG ES/EG细胞接种于同一品系的小鼠或免疫缺陷小鼠腹股沟、细胞接种于同一品系的小鼠或免疫缺陷小鼠腹股沟、眼窝、腹腔等可以形成眼窝、腹腔等可以形成(xngchng)(xngchng)由内胚层、中胚层和外胚层细胞由内胚层、中胚层和外胚层细胞构成构成 的畸胎瘤。的畸胎瘤。l胚胎胚胎(piti)干细胞的体内、外分化特点：干细胞的体内、外分化特点：第二十四页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l 组织和器官的细胞由含有两个或两个以上基因型构建而成的完整个组织和器官的细胞由含有两个或两个以上基因型构建而成的完整个体体(gt)(gt)称为嵌合体动物（称为嵌合体动物（chimaerachimaera）。把）。把ES/EGES/EG细胞注入胚泡或与桑细胞注入胚泡或与桑椹胚聚集，使其与正常胚胎结合在一起，并参与宿主胚胎发育，可形椹胚聚集，使其与正常胚胎结合在一起，并参与宿主胚胎发育，可形成嵌合体动物的各种组织和器官，包含生殖系成嵌合体动物的各种组织和器官，包含生殖系l 嵌合体动物可通过毛色、皮肤颜色等外观指标进行判定或是取器官组织嵌合体动物可通过毛色、皮肤颜色等外观指标进行判定或是取器官组织进行同功酶检测进行同功酶检测(3)(3)嵌合体动物嵌合体动物(dngw)(dngw)第二十五页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养 三、三、ES/EGES/EG细胞细胞(xbo)(xbo)的体外诱导分化的体外诱导分化第二十六页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养1 1、基本原理、基本原理l 细胞诱导细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调的分分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调的分子细胞学过程，是胚胎正常发育子细胞学过程，是胚胎正常发育(fy)过程中重要而基本的现象；过程中重要而基本的现象；l ESES细胞细胞(xbo)(xbo)是体外研究诱导分化的较理想模型，在体外被诱是体外研究诱导分化的较理想模型，在体外被诱导分化的途径可能与在体胚胎细胞导分化的途径可能与在体胚胎细胞(xbo)(xbo)的不完全相同；的不完全相同；l 在体胚胎的细胞分化在体胚胎的细胞分化(fnhu)(fnhu)过程中，诱导作用的结果不只是决过程中，诱导作用的结果不只是决定于各种诱导物质的性质和专一性，同时也决定于被诱导细胞的定于各种诱导物质的性质和专一性，同时也决定于被诱导细胞的反应能力反应能力(competence)(competence)。后者受遗传、发育潜能等内在因素的限。后者受遗传、发育潜能等内在因素的限制；制；第二十七页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l ESES细胞体外诱导分化实验中，所用诱导物质繁多，诱导模式细胞体外诱导分化实验中，所用诱导物质繁多，诱导模式 不尽相同，按其作用机理不尽相同，按其作用机理(j l)(j l)大致分为两类：大致分为两类：-使被诱导细胞可逆性轻度损伤，导致神经细胞分化使被诱导细胞可逆性轻度损伤，导致神经细胞分化 无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物等无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物等-诱导物通过其与被诱导细胞表面的受体结合而诱导细胞分化诱导物通过其与被诱导细胞表面的受体结合而诱导细胞分化 类固醇激素、维甲酸衍生物、多肽生长因子等类固醇激素、维甲酸衍生物、多肽生长因子等 同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞(xbo)(xbo)或变化多端的构造，不仅涉及诱导剂或变化多端的构造，不仅涉及诱导剂的浓度差别、诱导作用模式和微环境的未知因素等，而且可能与被诱导细胞的浓度差别、诱导作用模式和微环境的未知因素等，而且可能与被诱导细胞(xbo)(xbo)本本身的发育潜能和对诱导剂的反应性等差别有关。身的发育潜能和对诱导剂的反应性等差别有关。第二十八页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l ESES细胞细胞(xbo)(xbo)体外诱导分化途径可分为：体外诱导分化途径可分为：-谱系分化谱系分化（lineage differentiationlineage differentiation），有利于认识组织），有利于认识组织 谱系细胞分化机理和全过程谱系细胞分化机理和全过程。ESES细胞细胞 谱系祖细胞谱系祖细胞 谱系定型细胞谱系定型细胞 终末分化细胞终末分化细胞-定向分化定向分化（committed differeniationcommitted differeniation），需设法控制导向），需设法控制导向 产生单一类型的分化细胞。产生单一类型的分化细胞。对对ESES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因、细胞分化因子细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因、细胞分化因子 结合报告基因和诱导条件选择等手段，探索定向诱导分化途径结合报告基因和诱导条件选择等手段，探索定向诱导分化途径第二十九页，共六十一页。细胞工程7胚胎干细胞培养第三十页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养第三十一页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养2 2、ESES细胞体外诱导分化细胞体外诱导分化(fnhu)(fnhu)的基本方法的基本方法l单层单层ESES细胞细胞培养和诱导培养和诱导(yudo)(yudo)分化：较难分化为单一类型的细胞分化：较难分化为单一类型的细胞lESES细胞拟胚体细胞拟胚体形成和诱导分化：相对诱导分化细胞类型较形成和诱导分化：相对诱导分化细胞类型较 单一单一,具体方法有：具体方法有：（1 1）软琼脂培养软琼脂培养 （2 2）悬滴培养悬滴培养 第三十二页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养制备制备ESES单细胞悬浮液单细胞悬浮液培养皿盖上接种培养皿盖上接种20ul/20ul/滴，直径滴，直径10cm10cm的培养皿盖的培养皿盖盖上带有悬浮细胞小滴的盖子盖上带有悬浮细胞小滴的盖子培养皿内加培养皿内加PBSPBS培养皿边缘用膜封培养皿边缘用膜封 置置3737，5CO 2培养箱培养培养箱培养3d3d后，转移拟胚体至含后，转移拟胚体至含细胞分化诱导剂的培养细胞分化诱导剂的培养皿或微孔板进一步培养皿或微孔板进一步培养然后然后,移放入铺有移放入铺有0.1%0.1%白明胶的培养皿或微孔白明胶的培养皿或微孔板内在培养液中再培养板内在培养液中再培养可被诱导分化为不同类型细胞可被诱导分化为不同类型细胞 ES ES细胞细胞(xbo)(xbo)体外悬滴培养体外悬滴培养第三十三页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养3 3、ESES细胞体外诱导细胞体外诱导(yudo)(yudo)分化举例分化举例 造血细胞造血细胞 内皮细胞与血管内皮细胞与血管 神经细胞神经细胞 脂肪细胞脂肪细胞 心肌心肌(xnj)(xnj)和其他肌肉细胞和其他肌肉细胞 软骨细胞软骨细胞 胰岛细胞胰岛细胞第三十四页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l小鼠小鼠ESES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构并分化产生岛样的结构并分化产生(chnshng)(chnshng)各种造血系统的细胞：各种造血系统的细胞：用胰蛋白酶消化小鼠用胰蛋白酶消化小鼠ESES细胞拟胚体成单个细胞，经细胞拟胚体成单个细胞，经干细胞因子干细胞因子(SCF)(SCF)、血小板生成素血小板生成素(TPO)(TPO)和和条件培养液条件培养液处理，诱导其定向分化为造血干细胞；处理，诱导其定向分化为造血干细胞；用原代用原代骨髓基质细胞骨髓基质细胞作饲养层和作饲养层和SCFSCF及及IL-6IL-6细胞因子细胞因子处理处理 可进一步可进一步使使ESES细胞来源的造血干细胞分化为细胞来源的造血干细胞分化为B B淋巴细胞系。淋巴细胞系。造血造血(zo xu)细胞细胞第三十五页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养内皮细胞与血管内皮细胞与血管(xugun)l小鼠小鼠ESES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构，其中结构，其中(qzhng)(qzhng)也有内皮细胞出现：也有内皮细胞出现：利用经利用经转化生长因子转化生长因子1(TGF-1)1(TGF-1)基因转染基因转染的小鼠的小鼠ESES细胞在含细胞在含RARA培养液培养液中经悬滴培养形成拟胚体；中经悬滴培养形成拟胚体；再继续贴壁培养，发现拟胚体周围呈辐射状长出许多血管样结构。再继续贴壁培养，发现拟胚体周围呈辐射状长出许多血管样结构。将将外源重组外源重组TGF-TGF-11添加至培养液，同样也能诱导内皮细胞组成的添加至培养液，同样也能诱导内皮细胞组成的血管样结构。血管样结构。第三十六页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养心肌和其它肌肉心肌和其它肌肉(jru)细胞细胞l 悬浮或悬滴培养的小鼠悬浮或悬滴培养的小鼠ESES细胞拟胚体在细胞拟胚体在RARA诱导条件下贴壁生诱导条件下贴壁生长数天，常出现某些分化细胞集落具有节律长数天，常出现某些分化细胞集落具有节律(jil)(jil)性自发收缩的性自发收缩的现象，显然是肌细胞：现象，显然是肌细胞：DMSODMSO诱导诱导ESES细胞拟胚体可以形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多种细胞拟胚体可以形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多种类型肌细胞，类型肌细胞，用肌肉用肌肉(jru)(jru)专一性的调节因子专一性的调节因子MyoDMyoD基因转染基因转染ESES细胞并结合细胞并结合DMSODMSO诱诱导处理，额外表达导处理，额外表达MyoDMyoD基因的基因的ESES细胞主要分化为骨骼肌且常融合成肌细胞主要分化为骨骼肌且常融合成肌管。管。第三十七页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养vESES细胞定向诱导分化是至今仍未解决、正在探索细胞定向诱导分化是至今仍未解决、正在探索中的问题。根据国外少数报道和国内的经验，对中的问题。根据国外少数报道和国内的经验，对ESES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因或是细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因或是(hu sh)(hu sh)有关细胞分化因子等遗传操作，并结合诱导有关细胞分化因子等遗传操作，并结合诱导条件选择等手段，是一条可能的探索条件选择等手段，是一条可能的探索ESES细胞定向细胞定向诱导分化的途径。诱导分化的途径。第三十八页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养 四、四、ES/EGES/EG细胞诱导细胞诱导(yudo)(yudo)分化细胞的永生化分化细胞的永生化 寻找建立寻找建立ES/EGES/EG细胞诱导产生的分化细胞永生化途径细胞诱导产生的分化细胞永生化途径是目前是目前(mqin)(mqin)ES/EGES/EG细胞研究领域待解决的问题。细胞研究领域待解决的问题。第三十九页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养 五、五、ES/EGES/EG培养与诱导培养与诱导(yudo)(yudo)分化的意义分化的意义哺乳类发育哺乳类发育(fy)的体外模型的体外模型人体的基因和细胞人体的基因和细胞(xbo)治疗治疗组织工程的种子细胞来源组织工程的种子细胞来源第四十页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养第四十一页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l 哺乳动物早期胚胎一般体积很小，又在宫内发育，在体内研究哺乳动物早期胚胎一般体积很小，又在宫内发育，在体内研究胚胎发育和各类细胞分化及其机理几乎不可能；胚胎发育和各类细胞分化及其机理几乎不可能；l ESES细胞具有完整的发育潜能性，而且对所有调节正常发育的细胞具有完整的发育潜能性，而且对所有调节正常发育的信号具有应答信号具有应答(yngd)(yngd)能力。虽然能力。虽然ESES细胞体外分化途径和机制细胞体外分化途径和机制与在体胚胎不完全相同，但在分子水平有共同或相似之处，与在体胚胎不完全相同，但在分子水平有共同或相似之处，是研究特定类型细胞分化、某些前体细胞起源和细胞谱系演是研究特定类型细胞分化、某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系；变较理想的实验体系；l 许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下，已允许将许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下，已允许将人人ESES细胞类似于小鼠细胞类似于小鼠ESES细胞体外实验一样，用于研究人类胚胎发育、细胞体外实验一样，用于研究人类胚胎发育、分化和调节信号等事件。分化和调节信号等事件。哺乳类发育哺乳类发育(fy)的体外模型的体外模型第四十二页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养 人体人体(rnt)的基因和细胞治疗的基因和细胞治疗 这里的基因治疗是指用遗传改造过的人体细胞直接移植或输入这里的基因治疗是指用遗传改造过的人体细胞直接移植或输入(shr)病人体内，达到控制和治愈疾病为目的的治疗手段，又称细病人体内，达到控制和治愈疾病为目的的治疗手段，又称细胞治疗。胞治疗。第四十三页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l目前常说的基因治疗技术虽然能把编码正常序列目前常说的基因治疗技术虽然能把编码正常序列(xli)(xli)的基因导入的基因导入 突变细胞而使突变基因的功能得到纠正，但导入基因的整合突变细胞而使突变基因的功能得到纠正，但导入基因的整合 和表达难以精确控制，特别是基因插入后对其他基因产生的和表达难以精确控制，特别是基因插入后对其他基因产生的 效应尚无法预知。更大问题是，许多被用作基因操作的细胞效应尚无法预知。更大问题是，许多被用作基因操作的细胞 在体外不易稳定地被转染和增殖传代；在体外不易稳定地被转染和增殖传代；lESES细胞是基因治疗的较理想的靶细胞，经遗传操作后一般仍细胞是基因治疗的较理想的靶细胞，经遗传操作后一般仍 能稳定地在体外增殖传代，克服了目前基因治疗中需要大量能稳定地在体外增殖传代，克服了目前基因治疗中需要大量 靶细胞来源的主要问题。靶细胞来源的主要问题。第四十四页，共六十一页。细胞工程7胚胎干细胞培养定向定向(dn xin)诱导分诱导分化，选择化，选择治疗因子治疗因子(ynz)基因表基因表达达 人人ES细胞细胞(xbo)基因操作基因操作（克服免疫学障碍）（克服免疫学障碍）多种多种MHC组合组合 的的ES细胞库细胞库 组织谱系干细胞（如组织谱系干细胞（如造血干细胞）造血干细胞）功能性分化细胞（如功能性分化细胞（如神经细胞）神经细胞）移植移植移植移植 不同类型疾病的宿主不同类型疾病的宿主 基因组被改造基因组被改造 的的ES细胞细胞异源性基因表达异源性基因表达 基因修饰基因修饰 基因敲除、敲入基因敲除、敲入定向诱导分化定向诱导分化选择选择 组织谱系干细胞或功组织谱系干细胞或功能性分化细胞能性分化细胞移植移植图图2-2-1 用于基因和细胞治疗的人用于基因和细胞治疗的人ES细胞工程示意图细胞工程示意图基本策略基本策略1 1第四十五页，共六十一页。细胞工程7胚胎干细胞培养基本基本(jbn)(jbn)策略策略2 2欲接受细胞治疗欲接受细胞治疗(zhlio)患患者的者的 体细胞核体细胞核导入导入去核卵细胞去核卵细胞体外发育体外发育(fy)胚泡期胚泡期专用专用ES细胞细胞 特化细胞特化细胞分离培养分离培养体外诱导分化体外诱导分化 回输回输第四十六页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养细胞治疗的临床细胞治疗的临床(ln chun)应用应用前景前景l神经系统疾病神经系统疾病(jbng)l骨和软骨疾病骨和软骨疾病l血液病血液病l肝病肝病第四十七页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l神经系统神经系统(shnjngxtng)疾病疾病 根据小鼠根据小鼠ES/EGES/EG细胞研究资料，由于各种类型神经细胞因某种原因死亡而成细胞研究资料，由于各种类型神经细胞因某种原因死亡而成熟神经细胞又不能分裂、补充和替代熟神经细胞又不能分裂、补充和替代(tdi)(tdi)死亡细胞引起的神经系统疾病如死亡细胞引起的神经系统疾病如ParkinsonsParkinsons疾病，疾病，AlzheimersAlzheimers病、多发性硬化症等，有望通过人病、多发性硬化症等，有望通过人ES/EGES/EG细细胞进行细胞治疗。胞进行细胞治疗。新近，产生多巴胺的神经细胞已能从小鼠新近，产生多巴胺的神经细胞已能从小鼠ESES细胞衍生细胞衍生(yn shn)(yn shn)而来，而来，为细胞治疗为细胞治疗ParkinsonsParkinsons病的病的ESES细胞来源问题提供实验依据。细胞来源问题提供实验依据。第四十八页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l骨和软骨骨和软骨(rung)疾病疾病ES/EGES/EG细胞可能在体外被诱导为骨和软骨，这些细胞被导入骨关细胞可能在体外被诱导为骨和软骨，这些细胞被导入骨关节炎患者的关节软骨损伤区域，或因骨折节炎患者的关节软骨损伤区域，或因骨折(gzh)(gzh)、手术而引起的较、手术而引起的较大骨隙中，这类从大骨隙中，这类从ESES细胞衍生的骨和软骨细胞在被移植部位自我修细胞衍生的骨和软骨细胞在被移植部位自我修复的优点远远超过现行的组织移植。复的优点远远超过现行的组织移植。第四十九页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l血液病血液病ESES和造血干细胞和造血干细胞(xbo)(xbo)研究有助于产生供细胞研究有助于产生供细胞(xbo)(xbo)移植用的、不含有移植用的、不含有 镰刀状血球突变的血细胞。镰刀状血球突变的血细胞。第五十页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l肝病肝病利用肝干细胞移植治疗肝病取得利用肝干细胞移植治疗肝病取得(qd)了重要进展。了重要进展。第五十一页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养 组织组织(zzh)工程的种子细胞来源工程的种子细胞来源 人体人体ESES细胞技术细胞技术(jsh)(jsh)学的发生和发展，有望解决目学的发生和发展，有望解决目前组织或器官修复中的难题。前组织或器官修复中的难题。第五十二页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养l 设想是选择与人体细胞兼容性较好的生物材料，按缺损组织或器官的设想是选择与人体细胞兼容性较好的生物材料，按缺损组织或器官的要求设计制成模型或支架放在体外培养系统中，使要求设计制成模型或支架放在体外培养系统中，使ESES细胞或其定向诱导细胞或其定向诱导分化细胞沿着分化细胞沿着(yn zhe)(yn zhe)模型或支架不断地生长扩增，构建成新的组织或器模型或支架不断地生长扩增，构建成新的组织或器官。但官。但ESES细胞定向分化和构成组织和器官中细胞类型的复杂性等诸多问细胞定向分化和构成组织和器官中细胞类型的复杂性等诸多问题尚待解决；题尚待解决；l 目前工作是着重于从成年或幼年器官和组织的碎片中分离、培目前工作是着重于从成年或幼年器官和组织的碎片中分离、培养和扩增某一类型的组织干细胞，经过体外培养扩增有可能作为养和扩增某一类型的组织干细胞，经过体外培养扩增有可能作为组织工程的种子细胞来源。例如，从骨髓分离和扩增间质干细胞组织工程的种子细胞来源。例如，从骨髓分离和扩增间质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)(mesenchymal stem cell,MSC)，用作骨折愈合、肌腱韧带修复、，用作骨折愈合、肌腱韧带修复、肌肉再生和造血重建等组织工程的种子细胞。肌肉再生和造血重建等组织工程的种子细胞。第五十三页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养 六、六、ESES细胞研究面临的问题细胞研究面临的问题(wnt)(wnt)和研究趋势和研究趋势-如何解决用于人类胚胎干细胞研究的胚胎来源问题？如何解决用于人类胚胎干细胞研究的胚胎来源问题？-如何分离如何分离(fnl)(fnl)、纯化干细胞？、纯化干细胞？-如何保持体外培养胚胎干细胞的全能性，并控制定向诱导分化？如何保持体外培养胚胎干细胞的全能性，并控制定向诱导分化？-如何使如何使ESES细胞诱导分化产生的分化细胞永生化？细胞诱导分化产生的分化细胞永生化？-分化后的细胞是否有致瘤性？分化后的细胞是否有致瘤性？-如何使干细胞在体外发育成完整的器官？如何使干细胞在体外发育成完整的器官？-如何克服分化细胞移植后仍有可能发生的免疫排斥？如何克服分化细胞移植后仍有可能发生的免疫排斥？-有关伦理道德和法律以及商业应用等问题有关伦理道德和法律以及商业应用等问题第五十四页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养-改善改善ESES细胞的体外培养条件，建立更有效、更简便的获得细胞的体外培养条件，建立更有效、更简便的获得 ESES细胞的方法；细胞的方法；-定向诱导分化成特定类型细胞，用于临床疾病治疗并解决定向诱导分化成特定类型细胞，用于临床疾病治疗并解决 免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题(wnt)(wnt)；-成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较：成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较：成体干细胞能否替代胚胎干细胞？成体干细胞能否替代胚胎干细胞？第五十五页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养嵌合体一词的英文是嵌合体一词的英文是chimerachimera，源于希腊神话，是指狮子头、山羊，源于希腊神话，是指狮子头、山羊(shnyng)(shnyng)身和蛇尾的雌性怪物。有关嵌合体神话在各国文化中都有身和蛇尾的雌性怪物。有关嵌合体神话在各国文化中都有嵌合体的科学概念则是，任何由两个或两个以上遗传上不同的组织构成嵌合体的科学概念则是，任何由两个或两个以上遗传上不同的组织构成的机体。它可以是任何不同物种的机体。它可以是任何不同物种(wzhng)的混合，但目前较关注的是动的混合，但目前较关注的是动物与人的嵌合体。物与人的嵌合体。嵌合体与杂合体（嵌合体与杂合体（hybridhybrid）不同。杂合体是由来自不）不同。杂合体是由来自不同物种的两个配子同物种的两个配子(piz)(piz)形成一个合子。一个杂合体形成一个合子。一个杂合体的所有细胞来源于这一合子。的所有细胞来源于这一合子。第五十六页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养 最近美国政府封杀了斯坦福大学的一项向小鼠大脑植入人最近美国政府封杀了斯坦福大学的一项向小鼠大脑植入人类神经干细胞的研究，引起了国际学界和公众的关注。这项研类神经干细胞的研究，引起了国际学界和公众的关注。这项研究是当前干细胞研究前沿的一个重要方面，涉及到一个机体究是当前干细胞研究前沿的一个重要方面，涉及到一个机体(jt)拥有两种不同物种的细胞或组织，这种嵌合体研究引起许多新拥有两种不同物种的细胞或组织，这种嵌合体研究引起许多新颖的伦理问题，激发了对这类研究应该采取什么行动的伦理争颖的伦理问题，激发了对这类研究应该采取什么行动的伦理争论。论。第五十七页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养第一是为了建立动物模型第一是为了建立动物模型。例如世界上首次克隆牛的华裔美籍科学家杨向中创造了兔子的人类心脏病模例如世界上首次克隆牛的华裔美籍科学家杨向中创造了兔子的人类心脏病模型，可以型，可以(ky)表达人类引致心脏病的基因；而原来用大鼠建立的模型不能表达人表达人类引致心脏病的基因；而原来用大鼠建立的模型不能表达人的基因，用大鼠模型试验的药物对人体无用的基因，用大鼠模型试验的药物对人体无用为什么要创建为什么要创建(chungjin)嵌合体嵌合体呢？呢？第五十八页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养干细胞移植到病人体内后如何行为？它们如何分化、移动和形成新组织？在人身上干细胞移植到病人体内后如何行为？它们如何分化、移动和形成新组织？在人身上试验不道德，应首先在动物身上研究。将人类干细胞注射入动物体内，引起两方面试验不道德，应首先在动物身上研究。将人类干细胞注射入动物体内，引起两方面的问题：的问题：一是在生殖方面，如果将人胚胎干细胞注射入动物胎儿，尤其在很早期，它们很可能移一是在生殖方面，如果将人胚胎干细胞注射入动物胎儿，尤其在很早期，它们很可能移动到发育机体的生殖系产生人类的精子和卵。如果这两个嵌合体交配，一个人类精子使一个动到发育机体的生殖系产生人类的精子和卵。如果这两个嵌合体交配，一个人类精子使一个人类卵受精，结果在一个动物子宫生长出一个人类胚胎。如果这种动物（例如嵌合体小鼠）人类卵受精，结果在一个动物子宫生长出一个人类胚胎。如果这种动物（例如嵌合体小鼠）产生的人类精子和卵，用体外受精方法产生一个孩子，他或她的父母是一对小鼠？这对孩子产生的人类精子和卵，用体外受精方法产生一个孩子，他或她的父母是一对小鼠？这对孩子将是非常尴尬的。将是非常尴尬的。二是在脑方面。如果二是在脑方面。如果WeissmanWeissman设想的有设想的有100%100%人类神经细胞的小鼠有一天人类神经细胞的小鼠有一天(y tin)(y tin)站站起来说：起来说：“嗨，我是米老鼠！嗨，我是米老鼠！”那时我们对它该怎么办？这种可能似乎不大。理由是意那时我们对它该怎么办？这种可能似乎不大。理由是意识肯定不发生在细胞层次，鼠脑又不到人脑大小的千分之一。但如果将人类干细胞注射识肯定不发生在细胞层次，鼠脑又不到人脑大小的千分之一。但如果将人类干细胞注射入黑猩猩胚胎内，拥有入黑猩猩胚胎内，拥有 100%100%人类神经细胞的黑猩猩是否会发育生长出具有某种人性的人类神经细胞的黑猩猩是否会发育生长出具有某种人性的功能，就很难说了。功能，就很难说了。第二是为了第二是为了(wi le)进行干细胞研究进行干细胞研究。第五十九页，共六十一页。细胞工程细胞工程7胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养 受精受精 卵裂卵裂 受精后受精后72h 受精后受精后5-7天天精子精子+卵子卵子 合子合子 卵裂球卵裂球 桑椹胚桑椹胚 囊胚囊胚 滋养层胎盘及胎儿附属结构滋养层胎盘及胎儿附属结构囊胚囊胚 内胚层内胚层 消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰 内细胞群内细胞群 中胚层中胚层 结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层外胚层 体表结构；神经系统体表结构；神经系统第六十页，共六十一页。细胞工程7胚胎干细胞培养内容(nirng)总结C。1995年，Thomson等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎。1998年，Thomson等建立了第一株人类胚胎干细胞。1998年，Shamblott等建立了第一株人类生殖干细胞。（3）23周幼年大鼠心肌细胞条件培养液(RH-CM)。ES/EG细胞接种于同一品系的小鼠或免疫缺陷小鼠腹股沟、。嵌合体动物可通过毛色、皮肤颜色等外观指标进行判定或是取器官组织进行同功酶检测(jin c)。神经系统第六十一页，共六十一页。