《分析化学》-图文课件-第十二章

分析化学分析化学 第十二章第十二章 高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法的速率理论高效液相色谱法的特点与分类高效液相色谱法的流动相高效液相色谱法的固定相高效液相色谱仪 第一节第一节 高效液相色谱法的特点与分类高效液相色谱法的特点与分类 高效液相色谱法的特点一、高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较1.高效液相色谱法与经典液相色谱法相比较，具有以下特点：（1）高速。由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。例如，氨基酸的分离，用经典的柱色谱法需用20多小时才能分离出20多种氨基酸，而用HPLC在一个小时之内便可以完成。（2）高效。由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板。HPLC填充毛细管柱已获得每米106理论塔板数，能实现高效的分离。第一节第一节 高效液相色谱法的特点与分类高效液相色谱法的特点与分类（3）高灵敏度。紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使 HPLC 的最小检测量可达10-11 g，甚至10-13 g，而且所需试样量少，微升数量级的试样就可以进行全分析。（4）高度自动化。计算机的应用，使 HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。（5）流动相可选择范围广。它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。（6）馏分容易收集。第一节第一节 高效液相色谱法的特点与分类高效液相色谱法的特点与分类高效液相色谱法与气相色谱法的比较高效液相色谱法与气相色谱法的比较2.高效液相色谱法具有以下优点：分离效能高；分析速度快；检测器灵敏度高；流动相选择范围宽；柱后流出组分不被破坏，易收集；应用范围广。应当指出的是，高效液相色谱和气相色谱法一样，各有所长。在当今高效液相色谱法广泛应用的同时，其他色谱方法也仍然发挥着各自独特的作用。高效液相色谱法也有一定的局限性，从目前的发展来看，高效液相色谱法尚缺少灵敏度高的通用型检测器；另外，使用的有机溶剂为流动相，会污染环境，梯度洗脱操作比较复杂，这些都是它的局限性。第一节第一节 高效液相色谱法的特点与分类高效液相色谱法的特点与分类 高效液相色谱法的分类 二、高效液相色谱法的分类与经典液相色谱法一致，按固定相的聚集状态可分为液-液色谱法(LLC)和液固色谱法(LSC)两大类。按分离机制可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法和空间排阻色谱法四类基本类型色谱法。此外，高效液相色谱法还包括亲合色谱法、手性色谱法、胶束色谱法及电色谱法等其他类型的色谱法。第二节第二节 高效液相色谱法的速率理论高效液相色谱法的速率理论 柱内峰展宽 一、涡流扩散项涡流扩散项(H(He e)1.He=2dp (12-1)上式的含义与气相色谱法中的A项完全相同。由于高效液相色谱法的固定相是高效填料，粒径dp一般为310 m，远比气相色谱法的dp小，且高效液相色谱法多采用匀浆法装柱，填充很均匀，使填充因子变得更小。因此，其值比气相色谱法范氏方程A项值要低。第二节第二节 高效液相色谱法的速率理论高效液相色谱法的速率理论纵向扩散项纵向扩散项(H(Hd d)2.（12-2）上式的含义与气相色谱法中的B项相同。Cd为一常数，它与扩散系数Dm有关。纵向扩散是指组分分子在色谱柱内，由浓度大的谱带中心向浓度较低的周边扩散所引起的峰展宽。其值的大小与组分分子在流动相中的扩散系数Dm成正比，与流动相的平均线速度u成反比。由于液体的黏度要比气体大很多(约为100倍)，且液相色谱的柱温又比气相色谱低很多，其组分在液相中的扩散系数Dm要比在气相中小45个数量级。因此，高效液相色谱法的纵向扩散项对色谱峰展宽的影响实际上可以忽略不计。第二节第二节 高效液相色谱法的速率理论高效液相色谱法的速率理论传质阻抗项传质阻抗项(C)(C)3.(1)流动相传质阻抗(Hm)。当流动相流经色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒表面处的流速较慢，而流路中心的流速则较快，从而引起色谱峰展宽。这种由流动相在色谱柱内产生的不同流速所引起的板高变化与线速度功u及填充物的粒径dp的平方成正比，与组分分子在流动相中扩散系数Dm成反比，其关系可表示为(12-3)式中，Cm为一常数，它与柱形状及填充物结构等因素有关。第二节第二节 高效液相色谱法的速率理论高效液相色谱法的速率理论 (2)静态流动相传质阻抗(Hsm)。由于固定相的多孔性，可使部分流动相滞留在固定相微孔内，滞留在微孔内的流动相称为滞留区流动相。该区的流动相通常处于静止状态，不流动，故有静态流动相之称。当流动相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先扩散到滞留区。如果固定相中的微孔又小又深，则滞留就越严重，传质阻抗就越大，色谱峰的展宽就越明显。静态流动相传质阻抗在整个传质过程中起主要作用，其值的大小与固定相的粒径和微孔孔径有关，其表达式为(12-4)式中，Csm为一常数，它与固定相颗粒微孔及容量因子等因素有关。第二节第二节 高效液相色谱法的速率理论高效液相色谱法的速率理论 (3)固定相传质阻抗(Hs)。这种阻抗主要发生在分配色谱法中，它与气相色谱法中液相传质阻抗项C相一致，其大小取决于固定液液膜厚度df和组分分子在固定液内的扩散系数Ds。由于高效液相色谱法多采用化学键合相，键合相多为单分子层，液膜厚度df很小，故固定相传质阻抗的Hs值也很小，其表达式为（12-5）式中，Cs为常数；df为固定液液膜厚度；Ds为组分分子在固定液内的扩散系数。第二节第二节 高效液相色谱法的速率理论高效液相色谱法的速率理论 综上所述，由柱内各种因素所引起的色谱峰展宽与塔板高度H的关系可归结为（12-6）上式可简写为 H=A+B/u+Cu (12-7)式(12-7)与气相色谱法速率方程式的表达形式是一致的。但由于液相色谱中纵向扩散项B/u可以忽略不计，故高效液相色谱法中的速率方程式可写为：H=A+Cu (12-8)第二节第二节 高效液相色谱法的速率理论高效液相色谱法的速率理论从上述讨论可知，要使高效液相色谱法的柱内峰展宽效应变小，必须设法降低理论塔板高度H值，才能增加柱效。通常采用的方法有：(1)减小固定相粒径，采用310 m填料，可明显提高柱效。(2)降低流动相黏度，如用低黏度的甲醇等溶剂，或提高柱温(以25 左右为宜，过高易产生气泡)，可增大Dm值。(3)适当减小流速，如采用1 mLmin-1的低流量，有利于减小H值。(4)提高装柱技术，采用匀浆法装柱可使涡流扩散项A减小，柱效提高。第二节第二节 高效液相色谱法的速率理论高效液相色谱法的速率理论 柱外峰展宽二、柱外峰展宽(柱外效应)是由色谱柱外因素所引起的色谱峰展宽。所谓柱外因素是指从进样口到检测器之间(不包括柱子本身)的所有死体积，如进样器、连接管、连接头和检测器等，它们均能影响色谱柱的死体积。若死体积增大，则对色谱峰展宽的影响越大，而且这种展宽在液相色谱中远比气相色谱更为显著，这是因为分子在液相中的扩散系数要比在气体中低许多。为了降低柱外效应对色谱峰展宽的影响，必须尽量减小柱外死体积。例如，采用进样阀进样，使用内腔体积小的检测器及“零死体积接头”连接输液管道等技术。第三节第三节 高效液相色谱法的固定相高效液相色谱法的固定相 液-固吸附色谱固定相一、硅胶硅胶1.硅胶按结构和形态可分为表孔硅胶、无定形全多孔硅胶、球形全多孔硅胶及堆积硅珠等类型。(1)表孔硅胶（或称薄壳玻珠）。表孔硅胶是在实心玻璃微球上，用有机胶粘上数层硅溶胶，烧结而成，呈圆球形，硅胶层厚度约1 m。该类产品国产代号为YBK(Y液，B薄，K壳)。该硅胶具有传质快的优点，可作为载体应用。但因其表孔硅胶的粒度大、柱效低，不宜作为固定相使用。第三节第三节 高效液相色谱法的固定相高效液相色谱法的固定相(2)无定形全多孔硅胶。无定形全多孔硅胶是一种形态不一、粒径为510 m的填料，其理论塔板数每米可达5104。无定形全多孔硅胶的国产代号为YWG(Y液，W无，G硅)。该填料在HPLC法中应用较广泛，它既可作分析型柱和制备型柱的固定相，又可作键合相的载体使用。其优点是价格低、柱效高、柱容量大，缺点是涡流扩散项大及柱渗透性差。(3)球形全多孔硅胶。球形全多孔硅胶外形为球形，常用粒径为310 m，粒径为3 m的理论塔板数每米可达8104。国产代号为YQG(Y液，Q球，G硅)，YQG除具有YWG的优点外，还具有涡流扩散项小及渗透性好等优点。(4)堆积硅珠。堆积硅珠是由二氧化硅溶胶加凝结剂聚结而成，也属全多孔型。国产代号也用YQG。它与球形全多孔硅胶类似，粒径一般为35 m，柱效高，其理论塔板数每米也可达8104，传质阻力小，柱容量大，是一种较理想的高效填料。第三节第三节 高效液相色谱法的固定相高效液相色谱法的固定相高分子多孔微球（或称有机胶）高分子多孔微球（或称有机胶）2.该填料是由苯乙烯与二乙烯苯交联而成。国产代号用YSG表示。其分离机制多认为属吸附作用，也有认为是吸附与分配兼有，且同时还具有小孔径凝胶的作用。该填料的柱效较低，其理论塔板数每米仅有1000，但选择性好，峰形好，用途相当广泛。第三节第三节 高效液相色谱法的固定相高效液相色谱法的固定相 液-液色谱固定相二、化学键合相的特点化学键合相的特点1.1 12 23 34 45 5键合相的固定液在使用过程中不流失；化学性能稳定，一般在pH为27的溶液中不变质；热稳定性好，一般在70 以下不变性；利于梯度洗脱。选择性好；化学键合相的特点 第三节第三节 高效液相色谱法的固定相高效液相色谱法的固定相化学键合相的分类化学键合相的分类2.(1)非极性键合相(或称反相色谱键合相)。该键合相表面键合的是极性很小的烃基，如十八烷基(C18)、辛烷基(C18)、苯基等。(2)极性键合相(或称正相色谱键合相)。该键合相表面键合的是一些极性基团，如氰基(-CN)、氨基(-NH3)、二醇基(DIOL)等。(3)离子交换键合相。该键合相是以全多孔球形或无定型硅胶为载体，然后在其表面上键合离子交换基团。如键合的是磺酸基(-SO3H)、羧酸基(-COOH)，则为阳离子键合相；如键合的是季铵基(-R3NCl)，则为阴离子键合相。第三节第三节 高效液相色谱法的固定相高效液相色谱法的固定相 固定相的选择三、液液-固吸附色谱固定相的选择固吸附色谱固定相的选择1.在液-固吸附色谱法中，广泛采用的固定相是510 m粒径的全多孔硅胶。在选择硅胶的性能时，应主要考虑硅胶的比表面积、平均孔径和含水量。通常，硅胶的比表面积越大，溶质的值越大。在某些情况下，可采用大比表面积的硅胶来改善分离。硅胶的比表面积与硅胶的平均孔径成反比，即增大硅胶比表面积的结果是减小平均孔径，从而增大传质阻力，降低柱效；而减小硅胶比表面积又使试样负载量减小。一般来说，分析分子量较大的试样宜选择大孔径硅胶，因小孔径硅胶对大分子物质有排阻现象。另外，硅胶吸附剂中水的含量对分离结果有很大影响，通常溶质分子的k值随硅胶含水量的增加而降低。为保证分离结果的重复性，硅胶的含水量必须保持恒定。第三节第三节 高效液相色谱法的固定相高效液相色谱法的固定相化学键合相色谱固定相的选择化学键合相色谱固定相的选择2.在键合相色谱法中，如果是反相色谱、反相离子抑制色谱及反相离子对色谱法，应选用非极性键合相。非极性键合相的烷基链的长短对溶质的保留值、选择性和载样量都有影响。如长链烷基键合相可使溶质的k值增大，选择性改善，载样量增加，而且长链烷基键合相的稳定性也较短链烷基要好。因此，十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)就成为HPLC中使用最为广的非极性键合相。ODS对各种类型的化合物都有很强的适应能力，既可用于分离分子型化合物，也可用于分离离子型或可离子化的化合物。若是短链烷基键合相，可用于分离极性化合物；若是苯基键合相，则较适合于分离芳香化合物。第四节第四节 高效液相色谱法的流动相高效液相色谱法的流动相 流动相的极性一、流动相对组分的洗脱能力与溶剂的极性有关。溶剂的极性越强，洗脱能力越强。衡量溶剂极性强弱的方法多用Snyder提出的极性参数P来描述。P值越大，说明溶剂的极性越强，洗脱能力越强。第四节第四节 高效液相色谱法的流动相高效液相色谱法的流动相 正相色谱法与反相色谱法二、正相色谱法正相色谱法(normal phase chromatography,NPC)(normal phase chromatography,NPC)1.流动相的极性小于固定相的极性时，该系统称为正相色谱法。正相色谱法常用的固定相是极性较大的氨基、氰基、二醇基等化学键合相。而流动相则是疏水性的非极性或弱极性溶剂，如正戊烷、正己烷、环己烷等。正相色谱法的分离机制主要靠范德华作用力的定向作用力、诱导作用力及氢键作用力。例如，用氨基键合相分离极性化合物时，主要是靠被测组分的分子与键合相的氢键作用力的强弱差别来实行分离。若分离含有芳环等可诱导极化的非极性样品时，则主要靠键合相与组分分子的诱导作用力。正相色谱法适合于分析氨基酸类、胺类、酚类及羟基类等极性或中等极性的化合物。第三节第三节 高效液相色谱法的固定相高效液相色谱法的固定相反相色谱法反相色谱法(reverse phase chromatography(reverse phase chromatography，RPC)RPC)2.流动相的极性大于固定相的极性时，该系统称为反相色谱法。反相色谱法常用的固定相是非极性的十八烷基硅烷（C18）、辛烷基(C8)等化学键合相；流动相一般是以水作为基础溶剂，然后再加入一定量的能与水相混溶的有机溶剂，如甲醇、乙腈、乙醇及四氢呋喃等来调节溶剂的极性，最典型的色谱系统是以十八烷基硅烷键合硅胶作固定相，以甲醇-水(或乙腈-水)作流动相。反相色谱法组分的流出顺序正好与正相色谱法相反，即样品中极性大的组分先流出色谱柱，极性小的组分后流出色谱柱。在进行反相洗脱时，若流动相的极性增大，洗脱能力降低，组分的k增大，tR增大；反之，则相反。第三节第三节 高效液相色谱法的固定相高效液相色谱法的固定相反相色谱法的特点反相色谱法的特点3.流动相可灵活选择。柱子使用寿命较长。应用范围特别广泛。第四节第四节 高效液相色谱法的流动相高效液相色谱法的流动相 离子抑制色谱法与离子对色谱法三、离子抑制色谱法离子抑制色谱法(ion suppression chromatography(ion suppression chromatography，ISC)ISC)1.离子抑制色谱法是在反相色谱法的基础上，通过在流动相中加入少量弱酸(常用醋酸)、弱碱(常用氨水)或缓冲盐(常为磷酸盐及醋酸盐)作为抑制剂，以调节溶液的pH，抑制待测组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、有机弱碱的目的。离子抑制色谱法适用于3.0pKa7.0的弱酸、7.0pKb8.0的弱碱及两性化合物的分离。第三节第三节 高效液相色谱法的固定相高效液相色谱法的固定相离子对色谱法离子对色谱法(ion pair chromatography,IPC)(ion pair chromatography,IPC)2.离子对色谱法根据固定相和流动相极性的相对大小可分为正相离子对色谱法与反相离子对色谱法，其中以反相离子对色谱法应用较广。反相离子对色谱法是将离子对试剂加入到极性流动相中，待测组分的离子在流动相中与离子对试剂的反离子(counter ion)生成不带电荷的中性离子对，能使待测组分的离子在非极性固定相中的溶解度增加，分配系数增大，分离效果改善。反相离子对色谱法的分离机制多用“离子对模型”解释。该理论认为，试样离子在流动相中与离子对试剂解离出的离子生成不带电荷的疏水性离子对，然后溶解或吸附在非极性固定相上。离子对试剂的烷基碳链越长，生成的离子对与固定相的亲和力越大，组分的保留值也相应增大。第三节第三节 高效液相色谱法的固定相高效液相色谱法的固定相离子抑制色谱与离子对色谱的比较离子抑制色谱与离子对色谱的比较3.(1)加入试剂的目的不同。离子抑制色谱法是向流动相中加入抑制剂以抑制待测组分分子自身的解离，所加的抑制剂多为弱酸、弱碱或缓冲盐。而离子对色谱法则是向流动相中加入离子对试剂，使离子对试剂的反离子与待测组分的离子结合成中性离子对。所加的离子对试剂多是有机两性化合物或表面活性剂。(2)适合分析的对象不同。离子抑制色谱法适合于有机弱酸、有机弱碱以及弱酸、弱碱与分子化合物共存时的分离。而离子抑制色谱法则适合有机酸、有机碱、盐以及离子型和非离子型混合物的分离。第四节第四节 高效液相色谱法的流动相高效液相色谱法的流动相 流动相的选择四、对流动相的基本要求对流动相的基本要求1.高效液相色谱法对流动相有如下要求：(1)与固定相不互溶，也不发生化学反应。(2)对样品要有适宜的溶解度，使样品组分的k值最好在25内。(3)溶剂的纯度要高，要求使用前，用微孔滤膜过滤溶剂，并应进行脱气。(4)溶剂的黏度要小，否则会降低组分的扩散系数，使传质阻力增大，柱效降低。例如，甲醇的黏度要比乙醇小，故常用甲醇作流动相。(5)溶剂应与检测器相适应。若用紫外检测器检测，只能选用截止波长小于检测波长的溶剂作流动相。第三节第三节 高效液相色谱法的固定相高效液相色谱法的固定相流动相的选择流动相的选择2.在键合相色谱法中，如果是正相高效液相色谱，可先选用中等极性的溶剂作为流动相。如果组分的保留时间太短，说明溶剂的极性太强，可改用极性较弱的溶剂；如果组分的保留时间太长，可再选择极性在上述两种溶剂之间的溶剂，通过多次实验便可选出最合适的流动相系统。如果是反相高效液相色谱，流动相一般以极性最强的水作主体，然后再按比例加入适量的极性有机溶剂混合而成。在离子交换色谱法中，通常采用具有一定量的缓冲溶液作流动相，有时可在流动相中加入少量甲醇以改善某些酸碱物质的溶解度，有时还可通过改变盐的浓度来控制其离子强度，以获得满意的分离效果。第四节第四节 高效液相色谱法的流动相高效液相色谱法的流动相 洗脱方式 五、五、恒组成溶剂洗脱恒组成溶剂洗脱1.恒组成溶剂洗脱是指采用恒定配比的溶剂系统作流动相进行洗脱，是一种最常用的色谱洗脱方式。该法的特点是操作简便，柱易再生，但对于组分复杂的样品，往往难以获得理想的分离结果。第三节第三节 高效液相色谱法的固定相高效液相色谱法的固定相梯度洗脱梯度洗脱2.梯度洗脱又称为梯度淋洗或程序洗脱，是指在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成(如溶剂的极性、pH及离子强度等)，使样品中性质差异较大的组分，都能在适宜的分离条件下实行良好的分离。梯度洗脱特别适合分离组分多、性质相差大的复杂样品。该方式有如下特点：(1)可缩短分析周期；(2)可提高分离效能；(3)可改善色谱峰形；(4)可增加检测灵敏度；(5)有时易引起基线漂移，且重复性较差。第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 输液泵 一、一、输液泵的性能要求输液泵的性能要求1.1 12 23 34 45 5应具较高的输出压力。出压力应恒定无脉动。由于脉动会使检测器噪声变大。流量应稳定。泵体耐腐蚀，适用于各种溶剂及缓冲溶液，便于清洗，便于梯度洗脱。流量范围宽且可调节。分析型仪器的输出流量范围一般在0.0110 mLmin-1。从分析角度考虑，输液泵的性能应符合下列要求：第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪输液泵的类型输液泵的类型2.输液泵按液体输出方式可分为恒压泵和恒流泵两类，恒压泵流量受柱阻影响，流量不恒定，已淘汰，现多采用恒流泵。恒流泵的优点是输出的溶剂流量恒定，与压力变化无关。恒流泵按结构不同可分为螺旋泵和往复泵两种，螺旋泵的缸体太大，已不用。往复泵又可分为隔膜往复泵和柱塞往复泵。目前，高压液相色谱仪广泛使用的是柱塞往复泵，如图12-1所示。图12-1 柱塞往复泵示意图1.马达 2.往复轮 3.垫圈 4.球型单向阀5.溶剂 6.色谱柱 7.脉冲阻压器 第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 进样器二、二、隔膜进样器隔膜进样器1.隔膜进样器是指用微量注射器穿过隔膜直接将样品注入到与色谱柱相连的进样头内。该进样器结构简单，操作方便，但只能在低压或停流情况下进样，而且易漏液，重现性差。早期的低档仪器多采用此法。第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪六通进样阀六通进样阀2.六通进样阀是当今仪器普遍采用的进样装置，六通进样阀进样是在流动相不通过的情况下，用微量注射器先将样品注入贮样管，然后转动六通阀手柄，样品随流动相即进入色谱柱中。贮样管有一定容积，可按需选用。用六通阀进样具有进样量准确、重现性好及可带压进样等优点。六通进样阀结构如图12-2所示。图12-2 六通阀进样示意图1.贮样管(或定量管)2.样品入口 3.流动相进口 4.色谱柱 第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 色谱柱三、柱规格柱规格1.色谱柱为直形，按规格可分为分析型和制备型两类。(1)分析型柱。分析型柱有常量柱、半微量柱和毛细管柱三类。常量柱：内径为25 mm，柱长为1030 cm；半微量柱：内径为12 mm，柱长为1020 cm；毛细管柱：内径为0.20.5 mm，柱长为3075 cm。(2)制备型柱。实验室制备型柱的内径为2040 mm，柱长为1030 cm。第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪装柱装柱2.高效液相色谱柱的填充是一项技巧性很强的技术，填充的好坏直接影响用匀浆法装柱，即先将填料用等密度的有机溶剂(如二氧六环和四氯化碳的混合液)调匀，并用超声波振荡，使其填料颗粒在介质中高度分散，呈浆糊状，装入与色谱柱相连的匀浆罐中。然后，用高压泵以100 MPa以上的压强，将顶替液注入匀浆罐，把匀浆顶入色谱柱中即可。第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪柱效评价柱效评价3.装填好的色谱柱或购进的色谱柱，均应检查柱效。检查柱效的实验条件如下：(1)硅胶柱。样品：苯、奈、联苯及菲(用己烷配制)；流动相：无水己烷。(2)反相色谱柱。样品：尿嘧啶(测定死时间用)、硝基苯、奈及芴；流动相：甲醇-水(8515，V/V)或乙晴-水(6040，V/V)。(3)正相色谱柱。样品：四氯乙烯(测定死时间用)、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二正丁酯及肉桂醇，也可用偶氮苯、氧化偶氮苯及硝基苯为样品；流动相：正庚烷。按上述条件，测得各组分的Wb/2及tR，其理论塔板数(n)应大于25万/米，相邻两组分的分离度(R)应大于1.5。第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪色谱柱再生色谱柱再生4.色谱柱的价格较贵，再生可以延长柱子的使用寿命。(1)反相色谱柱。反相色谱柱以甲醇水(955,V/V)、纯甲醇及一氯甲烷等为流动相，依次冲洗。然后，再以相反顺序依次冲洗。每种流动相的冲洗体积约为柱体积的20倍。(2)正相色谱柱(含硅胶柱)。正相色谱柱以严格脱水的正己烷、异丙醇、一氯甲烷及甲醇为流动相，依次冲洗。然后，再以相反顺序依次冲洗。冲洗时顺序不得颠倒。每种流动相的冲洗体积约为柱体积的20倍。第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 检测器四、四、紫外检测器紫外检测器(UVD)(UVD)1.(1)固定波长检测器。固定波长型是一种光源波长固定的紫外分光光度计。(2)可变波长检测器。可变波长检测器是目前高效液相色谱仪配置最多的检测器。(3)光电二极管阵列检测器。光电二极管阵列检测器是20世纪80年代出现的一种新型的光学多通道检测器。第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪荧光检测器荧光检测器(FLD)(FLD)2.荧光检测器相当于一台荧光分光光度计或荧光光度计。其原理是基于某些荧光物质吸收一定波长的紫外光后，能发射出一种比吸收波长更长的光波，即荧光。荧光强度与荧光物质浓度的关系服从朗伯比耳定律，测定荧光强度便可对组分进行定量分析。荧光检测器的显著特点是灵敏度高，所需试样少，其最小检测浓度可达10-12 gmL-1。由于许多物质都不能产生荧光，所以其应用范围有限。若利用荧光试剂进行柱前或柱后衍生化，可扩大荧光检测器的应用范围。第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪示差折光检测器示差折光检测器(RID)(RID)3.示差折光检测器是一种通用型检测器，它是利用样品池和参比池之间折光率的差别来对组分进行检测，测得的折光率差值与样品组分的浓度成正比。由于每种物质都有各自不同的折光率，原则上都可用示差折光检测器来检测。该检测器的主要缺点是检测灵敏度较低，不适合梯度洗脱。而且折光率易受温度的影响，测定时需维持恒定温度。第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ELSD)ELSD)4.蒸发光散射检测器是20世纪90年代出现的一种新型的质量型检测器。该检测器的工作原理是将色谱柱的流出液引入雾化器与通入的气体(常用高纯氮，也可用空气)混合，形成均匀的微小液滴，经过加热的飘移管，蒸发除去流动相，而样品组分则在蒸发室内形成气溶胶，进入检测室。当用强光或激光照射气溶胶，可产生光散射(丁铎尔光效应)，用光电二极管测定散射光强度。散射光的强度与气溶胶中组分的质量成正比。通过测定散射光的强度，便可求得组分的浓度。该检测器可用于挥发性低于流动相的任何样品组分测定，如糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸及甾体等化合物。该检测器的主要缺点是对有紫外吸收组分的检测灵敏度比UVD低(约低1个数量级)，其次是只适用于流动相能挥发的色谱洗脱。第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪安培检测器安培检测器(AD)(AD)5.安培检测器属电化学检测器(ECD)，电化学检测器是一种选择性检测器，仅适合于测定那些具有电化学活性的物质。电化学检测器包括极谱检测器、安培检测器、库仑检测器及电导检测器等，其中以安培检测器应用最广。安培检测器的灵敏度很高，其检测限可达10-12 gmL-1，特别适合痕量组分的分析。谢谢观看！